一种使用重组耶氏解脂酵母菌株生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法

摘要

本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，该方法包括平板活化培养、种子培养、发酵培养、由菌体提取脂肪与由发酵上清液提取脂肪等步骤。使用较廉价的红花籽油代替昂贵的游离LA作为发酵用底物，既能提高t10，c12-CLA的产量，又能很大程度降低发酵成本，因此，本发明使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的应用前景。

说明书

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种使用重 组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸 甲酯的方法。

【背景技术】

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是由一系列含有共 轭双键、具有位置和几何异构的十八碳二烯酸的总称，是必需脂肪酸 亚油酸（Linoleic acid，LA）的立体几何异构体，也可看作是亚油酸 的次生衍生物。CLA具有多种异构体形式，其中cis-9，trans-11-CLA （c9，t11-CLA）、trans-10，cis-12-CLA（t10，c12-CLA）两种异构 体是含量最多并且确认具有生理活性功能的共轭亚油酸单体。CLA 作为一种新型的脂肪酸，其生理功能已逐渐被人们所认同。CLA具 有包括抗癌、抗动脉粥样硬化、免疫系统调节以及抑制脂肪积累等对 人类健康有益的效果，并且CLA能够提高饲料效价防霉变作用而被 广泛的研究。

因为CLA具有多种独特的生理功能，被誉为“21世纪的新型营 养素”，越来越多地引起了世界各国政府及科研工作者的重视，美国、 加拿大等国已经开始把CLA作为营养添加剂大量用于农业及食品工 业。CLA正成为药物、食品、饲料等研究领域的一个热点。由于天 然CLA主要存在于反刍动物乳制品中，含量非常低；而通过碱催化 异构化等化学方法合成的CLA是多种异构体的混合物，较难分离纯 化具有活性功能的异构体；所以，研究生物转化法获得成分单一的功 能CLA具有重要的现实意义。

到目前为止，c9，t11-CLA生物合成的最高产量是Shimizu研究 小组通过Delacroixia coronata菌株的delta-9脱饱和酶作用，以 33.3mg/mL异油酸（trans-11-octadecenoic acid，t-OA）为底物转生产 了10mg/mL的CLA，其中98%为c9，t11-CLA；而t10，c12-CLA生 物合成的最高产量是江南大学食品生物技术中心陈卫研究小组构建 的重组耶氏解脂酵母菌株（CCFM-JU277-9），通过添加20g/L大豆油， 在5L发酵罐中发酵38.5h得到CLA的最高产量为4g/L，其中全部为 t10，c12-CLA。由于CCFM-JU277-9能够在胞内合成亚油酸异构酶 （PAI），并催化LA形成专一的t10，c12-CLA单体形式，因此增加 底物LA的含量将有助于增加t10，c12-CLA的产量。

因此，本发明希望通过在培养基中添加LA含量较高的廉价植物 油、优化植物油的添加时间及添加量，从而实现提高t10，c12-CLA 产量的目标。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种使用重组耶氏解脂酵母菌株 CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生 产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。

所述生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法的步骤如下：

A、平板活化培养

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装 在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的 条件下平板活化培养2～6天，得到平板培养物；

B、种子培养

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种 子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条 件下培养40～52小时；

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种 子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20～32 ℃与150～250rpm的条件下震荡培养，在发酵0-45小时期间添加终浓 度为10～70g/L的乳化植物油，震荡培养48～100小时，得到一种发酵 培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌 体与发酵上清液；

所述的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次， 得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续 处理；洗涤的菌体接着进行冻干；

D、由菌体提取脂肪

按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12%盐酸-甲醇溶液之比为 20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12%盐酸-甲醇溶 液在温度45～-65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐 酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm 的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复 上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含 有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯；

E、由发酵上清液提取脂肪

按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用 按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次， 提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12% 盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小时，然后 加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在 3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到 的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干， 得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的平板固体培养基制备方 法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫 酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸 铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的 pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭菌20 min。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的种子培养基制备方法 如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L 硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏 水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5， 然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵培养基制备方法 如下：

按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、 酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所 得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机酸选自硫酸或盐 酸；所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾；所述无机酸或无机碱水 溶液的浓度是2.0～4.0mol/L。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的乳化植物油制备方法 如下：

把植物油添加到以重量计0.6%吐温80水溶液中，直到植物油的 浓度达到150～250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行 超声处理4～6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的添加的植物油为红花 籽油。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的乳化植物油是在重组 耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9进入生长稳定期时添加的。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的洗涤菌体在温度-10 ℃～-30℃与真空度1.0～10.0Pa的条件下进行冻干。

根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述共轭亚 油酸的t10，c12-CLA含量分别是1.3g/L～3.5g/L；在步骤E中，所述 共轭亚油酸的t10，c12-CLA含量分别是0.5g/L～6.8g/L。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生 产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法。

重组耶氏解脂酵母菌株（Yarrowia lipolytica）CCFM-JU277-9已 于2013年3月06日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院 微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 其保藏号为CGMCCNo.7284，具体参见CN 103233036A。

所述生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法的步骤如下：

A、平板活化培养

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装 在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的 条件下平板活化培养2～6天，得到平板培养物。

所述的平板固体培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫 酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸 铵溶解于蒸馏水中，再使用无机酸水溶液或无机碱水溶液，将所得到 溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下灭 菌20min。

在这个步骤中，使用的恒温培养箱是目前市场上销售的产品，例 如由上海森信实验仪器有限.公司以商品名隔水式恒温培养箱销售的 产品。

在这个步骤以及后续步骤中，所述的无机酸选自硫酸或盐酸。在 本发明中使用的是无机酸水溶液。所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧 化钾。使用的是无机碱水溶液。所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是 2.0-4.0mol/L。

B、种子培养

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种 子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条 件下培养40～52小时。

所述的种子培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L 硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏 水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所得到溶液的pH调节至5.5， 然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

在这个步骤中，所述的种子培养是在培养摇床中进行的，本发明 使用的培养摇床是目前市场上销售的产品，例如由上海智诚分析仪器 制造有限公司以商品名恒温培养振荡器销售的产品。

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种 子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20～32 ℃与150～250rpm的条件下震荡培养，在发酵0-45小时期间添加终浓 度为10～70g/L的乳化植物油，震荡培养48～100小时，得到一种发酵 培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌 体与发酵上清液；

所述的发酵培养基制备方法如下：

按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、 酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用无机酸或无机碱水溶液将所 得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min。

在这个步骤中，所述的发酵培养是在震荡培养箱中进行的，本发 明使用的震荡培养箱是目前市场上销售的产品，例如由上海智诚分析 仪器制造有限公司以商品名恒温培养振荡器销售的产品。

所述的乳化植物油制备方法如下：

把植物油添加到以重量计0.6%吐温80水溶液中，直到植物油的 浓度达到150～250g/L，接着使用超声设备在功率200W的条件下进行 超声处理4～6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

根据本发明，所述的植物油是小麦胚芽油、大豆油、红花籽油、 亚麻油、菜籽油、葵花籽油或核桃仁油。

优选地，所述的植物油是小麦胚芽油、大豆油、红花籽油、葵花 籽油或核桃仁油。

更优选地，所述的植物油是红花籽油。

在这个步骤中，使用的超声设备是目前市场上销售的产品，例如 由美国SONICS公司以商品名超声波细胞粉碎机销售的产品。

在这个步骤中，使用的0.22μm无菌滤膜是目前市场上销售的产 品，例如由上海兴亚净化材料厂公司以商品名微孔滤膜销售的产品。

由于诱导亚油酸异构酶（PAI）蛋白表达的启动子是在对数期末 期或稳定期初期才启动表达外源基因（参见文献MadzakC，TretonB， Blanchin-Roland S.Strong hybrid promoters and integrative  expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of  heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.Journal of  Molecular Microbiology and Biotechnology，2000，2(2):207-216）， 所以PAI蛋白在对数期末期或稳定期前期大量合成的。如果在发酵初 期添加植物油会使大量的底物LA作为碳源供细胞生长繁殖，进入稳 定期后剩余的LA才被PAI蛋白催化合成t10，c12-CLA。为了使尽量 多的LA作为底物用于合成t10，c12-CLA，需要确定植物油的最佳添 加时间。

研究发现，植物油添加时间对t10，c12-CLA的产量有明显的影 响。以红花籽油为例研究了植物油的最佳添加时间。在发酵开始、重 组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9菌体对数期中期与对数期末期 添加红花籽油所得到的t10，c12-CLA的产量，比进入稳定期添加红 花籽油时所达到的产量低得多，说明在PAI蛋白量积累最多时添加红 花籽油使更多的底物LA流向t10，c12-CLA合成途径，具体情况见 实施例2。

研究还发现，植物油添加量对t10，c12-CLA的产量也有明显的 影响。以红花籽油为例研究植物油添加量发现，红花籽油终浓度从 10g/L增加到70g/L时，t10，c12-CLA的产量从逐渐增加转变为逐渐 降低，而t10，c12-CLA的得率则从43%逐渐降低到12.3%，具体情 况见实施例3。所述的得率是指t10，c12-CLA产量（g/L）与添加红 花籽油量（g/L）的比值。

得到的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次， 得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续 处理；洗涤的菌体接着进行冻干。

NaCl水溶液洗涤的目的在于洗掉菌体细胞表面附着的脂肪酸所 述的冻干是让所述的洗涤菌体在温度-10℃～-30℃与真空度1.0 ～10.0Pa的条件下进行冷冻干燥。

在这个步骤中，进行冻干所使用的设备是目前市场上销售的产 品，例如由美国LABCONCO公司以商品名冻干机销售的产品。

D、由菌体提取脂肪

按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12%盐酸-甲醇溶液之比为 20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12%盐酸-甲醇溶 液在温度45～-65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐 酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm 的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复 上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含 有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。

在本发明中，采用常规气相色谱定量分析方法（参见文献Baixi  Zhang,Chunchi Rong ect.De novo synthesis of trans-10,cis-12 conjugated linoleic acid in oleaginous yeast Yarrowia  Lipolytica.Microbial Cell Factories,2012,11:51）分析了在所述脂肪酸甲 酯中的共轭亚油酸t10，c12-CLA含量。

在这个步骤中，所述脂肪酸甲酯中共轭亚油酸t10,c12-CLA的含 量分别是1.3g/L～3.5g/L。

E、由发酵上清液提取脂肪

按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0， 用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4 次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的 8～12%盐酸-甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小 时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着 在3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得 到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹 干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。

采用上述常规气相色谱定量分析方法分析，所述脂肪酸甲酯中共 轭亚油酸t10，c12-CLA的含量分别是0.5g/L～6.8g/L。

在本发明中，共轭亚油酸t10,c12-CLA得率是共轭亚油酸 t10,c12-CLA的含量（g/L）与添加红花籽油量（g/L）的比值。

通过前面描述与实施例可以清楚地知道，采用本发明方法制备的 脂肪酸甲酯中共轭亚油酸t10,c12-CLA的含量远高于现有技术所达 到的含量。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明使用红花籽油（SaO）时，t10， c12-CLA的产量最高达到2.44g/L，是不添加植物油时t10，c12-CLA 含量的55倍之多，比添加价格昂贵的游离LA的产量还要高约30% 以上。添加红花籽油的终浓度为30g/L、50g/L、70g/L时，在发酵 84h时t10，c12-CLA产量分别达到9.1g/L、9.7g/L及8.6g/L。使用 较廉价的红花籽油代替昂贵的游离LA作为发酵用底物，既能提高 t10，c12-CLA的产量，又能很大程度降低发酵成本，因此，本发明 使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的 脂肪酸甲酯的方法具有非常好的应用前景。

【附图说明】

图1是重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9在发酵培养过程中 的生长曲线。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：使用不同植物油制备含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯

该实施例的实施步骤如下：

A、平板活化培养

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫 酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸 铵溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得 到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下 灭菌20min，得到平板固体培养基。

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装 在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃ 的条件下平板活化培养4天，得到所述的平板培养物；

B、种子培养

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L 硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏 水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调 节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种 子培养基中，然后置于试管中，在温度28℃与200rpm的条件下培养 46小时；

C、发酵培养

按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、 酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用2.0mol/L硫酸或氢氧化钠 水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭 菌20min，得到发酵培养基。

把小麦胚芽油、大豆油、红花籽油、亚麻油、菜籽油、葵花籽油 或核桃仁油植物油分别添加到以重量计0.6%吐温80水溶液中，直到 所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条 件下进行超声处理5分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到 相应的乳化植物油。

按照以发酵培养基体积计1.0%接种量，将步骤B得到的种子培 养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与 200rpm的条件下震荡培养，在发酵0-45小时期间添加终浓度为10g/L 的乳化植物油，震荡培养72小时，得到一种发酵培养物，它在8000rpm 的条件下离心分离15分钟，得到菌体与发酵上清液。

所述的菌体使用以重量计0.85%NaCl水溶液洗涤2次，得到的 洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理； 洗涤的菌体接着在温度-20℃与真空度5.0Pa的条件下进行冻干。

D、由菌体提取脂肪

按照以mg计冻干菌体与以ml计10%盐酸-甲醇溶液之比为35： 1.0，让步骤C所得到的冻干菌体与10%盐酸-甲醇溶液在温度50℃的 条件下进行甲酯化3.0小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己 烷提取10分钟，接着在6000rpm的条件下离心分离3分钟，在分离 上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1次，分离上清液合 并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯，采用常 规气相色谱定量分析脂肪酸甲酯，确定产物10t，12c–CLA的含量；

E、由发酵上清液提取脂肪

按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:10.0，用按 照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液3次，提取 液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的10%盐酸- 甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化1小时，然后加入与盐酸- 甲醇溶液等体积的正己烷提取10分钟，接着在6000rpm的条件下离 心分离3分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作 1次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的 脂肪酸甲酯。

采用本说明书描述的气相色谱定量分析方法测定了，本实施例制 备所使用的植物油的主要脂肪酸组成，其结果列于表1中，本实施例 制备所得到的脂肪酸甲酯中的10t，12c–CLA含量，其结果列于表2 中。

表1：不同植物油的主要脂肪酸组成（重量%）

a：两次平行试验所得的数据    ND：未检测到

表2：不同植物油对生物量、脂质含量和CLA产量的影响

a：两次平行试验所得的数据    ND：未检测到

由表1和表2可以看出，由于不同植物油含有的底物LA的量不 同，因此添加不同植物油时t10，c12-CLA的产量也不相同。植物油 中随着底物LA含量的增加，t10，c12-CLA的产量也随之增加。添加 红花籽油（SaO）时，t10，c12-CLA的产量最高达到2.44g/L，是不 添加植物油时t10，c12-CLA含量的55倍之多，比添加价格昂贵的游 离LA的产量还要高得多，约30%以上。如果用廉价红花籽油代替昂 贵的游离LA作为发酵用底物，既能提高t10，c12-CLA的产量，又 能很大程度降低发酵成本。

实施例2：在不同发酵时间添加红花籽油制备含有共轭亚油酸的 脂肪酸甲酯

该实施例的实施步骤如下：

A、平板活化培养

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫 酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸 铵溶解于蒸馏水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得 到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下 灭菌20min，得到平板固体培养基。

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装 在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃ 的条件下平板活化培养4天，得到所述的平板培养物；

B、种子培养

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L 硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏 水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠水溶液将所得到溶液的pH调 节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种 子培养基中，然后置于试管中，在温度28℃与200rpm的条件下培养 48小时；

C、发酵培养

按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、 酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用4.0mol/L硫酸或氢氧化钠 水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭 菌20min，得到发酵培养基。

把红花籽油植物油添加到以重量计0.6%吐温80水溶液中，直到 所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条 件下进行超声处理6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到 相应的乳化植物油。

按照以发酵培养基体积计2.0%接种量，将步骤B得到的种子培 养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与 200rpm的条件下震荡培养，在发酵0h、24h、33h、36h（即发酵开始、 对数期中期、对数期末期、稳定期前期，参见附图1，菌体量分别达 到总菌体量的0%、60%、90%、100%）添加终浓度为10g/L的乳化 植物油，震荡培养60—72小时，得到一种发酵培养物，它在8500rpm 的条件下离心分离10分钟，得到菌体与发酵上清液。

所述的菌体使用以重量计0.85%NaCl水溶液洗涤2次，得到的 洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理； 洗涤的菌体接着在温度-30℃与真空度1.0Pa的条件下进行冻干。

D、由菌体提取脂肪

按照以mg计冻干菌体与以ml计10%盐酸-甲醇溶液之比为50： 0.5，让步骤C所得到的冻干菌体与10%盐酸-甲醇溶液在温度50℃的 条件下进行甲酯化3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己 烷提取15分钟，接着在7000rpm的条件下离心分离2分钟，在分离 上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1次，分离上清液合 并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯，采用常 规气相色谱定量分析脂肪酸甲酯，确定产物10t，12c–CLA的含量；

E、由发酵上清液提取脂肪

按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:12.0，用按 照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液3次，提取 液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的10%盐酸- 甲醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化1小时，然后加入与盐酸- 甲醇溶液等体积的正己烷提取15分钟，接着在7000rpm的条件下离 心分离2分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作 1次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的 脂肪酸甲酯。

采用本说明书描述的气相色谱定量分析方法测定了本实施例制 备所得到的脂肪酸甲酯中的10t，12c–CLA含量，其结果列于表3 中。

表3：红花籽油添加时间对生物量、脂质含量及CLA产量的影响

a：两次平行试验所得的数据

如表3所示，在菌体进入稳定期（36h）添加10g/L红花籽油时， t10，c12-CLA的产量在发酵60h时达到最高4.2g/L，而在发酵开始 （0h）、对数期中期(24h)及对数期末期（33h）添加10g/L红花籽油， 则在发酵72h左右产量达到最高分别为2.5g/L、2.6g/L及3.3g/L； 随着红花籽油添加时间的推迟，t10，c12-CLA的产量逐渐增加，而 无脂质生物量则呈现递减的趋势，说明在PAI蛋白量积累最多时添加 红花籽油使更多的底物LA流向t10，c12-CLA合成途径。

实施例3：使用不同量的红花籽油制备含有共轭亚油酸的脂肪酸 甲酯

该实施例的实施步骤如下：

A、平板活化培养

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源、5g/L硫 酸铵和20g/L琼脂粉，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸 铵溶解于蒸馏水中，再使用3.0mol/L盐酸或氢氧化钾水溶液将所得 到溶液的pH调节至5.5，再加入琼脂粉，然后在温度115℃的条件下 灭菌20min，得到平板固体培养基。

使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接种于装 在平板中的平板固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃ 的条件下平板活化培养4天，得到所述的平板培养物；

B、种子培养

按照20g/L葡萄糖、1.7g/L无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与5g/L 硫酸铵，将葡萄糖、无硫酸铵无氨基酸酵母氮源与硫酸铵溶解于蒸馏 水中，再使用3.0mol/L盐酸或氢氧化钾水溶液将所得到溶液的pH调 节至5.5，然后在温度115℃的条件下灭菌20min，得到种子培养基。

使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种 子培养基中，然后置于试管中，在温度28℃与200rpm的条件下培养 48小时；

C、发酵培养

按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉与20g/L蛋白胨，将葡萄糖、 酵母粉与蛋白胨溶解于蒸馏水中，再使用3.0mol/L盐酸或氢氧化钾 水溶液将所得到溶液的pH调节至6.5，然后在温度115℃的条件下灭 菌20min，得到发酵培养基。

把红花籽油植物油添加到以重量计0.6%吐温80水溶液中，直到 所述植物油的浓度达到200g/L，接着使用超声设备在功率200W的条 件下进行超声处理6分钟，再使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，得到 相应的乳化植物油。

按照以发酵培养基体积计1%接种量，将步骤B得到的种子培养 物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度28℃与 200rpm的条件下震荡培养，在发酵36h（即稳定期）添加终浓度为 10g/L、20g/L、30g/L、50g/L、70g/L乳化红花籽油，震荡培养48小 时，得到一种发酵培养物，它在7500rpm的条件下离心分离18分钟， 得到菌体与发酵上清液。

所述的菌体使用以重量计0.85%NaCl水溶液洗涤3次，得到的 洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理； 洗涤的菌体接着在温度-10℃与真空度10.0Pa的条件下进行冻干。

D、由菌体提取脂肪

按照以mg计冻干菌体与以ml计10%盐酸-甲醇溶液之比为50： 0.5，让步骤C所得到的冻干菌体与10%盐酸-甲醇溶液在温度50℃的 条件下进行甲酯化3小时，然后加入与盐酸-甲醇溶液等体积的正己 烷提取5分钟，接着在5000rpm的条件下离心分离5分钟，在分离上 清液后所得到的残余物再重复上述提取操作2次，分离上清液合并， 用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯，采用常规气 相色谱定量分析脂肪酸甲酯，确定产物10t，12c–CLA的含量；

E、由发酵上清液提取脂肪

按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0，用按照 体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2次，提取液 合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的10%盐酸-甲 醇溶液在温度50℃的条件下进行甲酯化1.0小时，然后加入与盐酸- 甲醇溶液等体积的正己烷提取5分钟，接着在3000rpm的条件下离心 分离5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作2 次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂 肪酸甲酯。

采用本说明书描述的气相色谱定量分析方法测定了本实施例制 备所得到的脂肪酸甲酯中的10t，12c–CLA含量，其结果列于表4 中。

表3：红花籽油添加量对生物量、脂质含量及CLA产量的影响

a：两次平行试验所得的数据

由表4可以看出，添加红花籽油的终浓度为10g/L、20g/L时， 在发酵60h和72h时t10，c12-CLA产量分别达到最高（4.3g/L与 6.8g/L）；添加红花籽油的终浓度为30g/L、50g/L、70g/L时，在发 酵84h时t10，c12-CLA产量达到最高分别为9.1g/L、9.7g/L及8.6g/L； 当添加红花籽油的终浓度从10g/L增加到70g/L时，t10，c12-CLA 产量先逐渐增加而后降低，而t10，c12-CLA的得率则从43%逐渐降 低到12.3%。从产量及得率双重因素考虑，当生物量在12g/L左右时 添加终浓度为30g/L的红花籽油为最适底物添加量，加入红花籽油后 继续发酵48h收菌。