马铃薯腐烂茎线虫快速PCR分子检测方法及其应用

摘要

本发明为“马铃薯腐烂茎线虫快速PCR分子检测方法及其应用”，属植物线虫分子检测技术领域。马铃薯腐烂茎线虫快速PCR分子检测方法，包括PCR反应体系，其特征在于所述PCR反应体系中有一组特异性引物，所述特异性引物为DdF1和DdR1，上述引物能够从A型和B型的马铃薯腐烂茎线虫中特异的扩增出长度为495bp的片段，从而实现对马铃薯腐烂茎线虫的快速分子检测。本发明具有灵敏度高，特异性强且快速准确，在作物腐烂茎线虫病的早期诊断和田间监测预警等方面，具有很高的实际应用价值。

说明书

技术领域

本发明属植物线虫分子检测技术领域，涉及马铃薯腐烂茎线虫快速PCR分子检测方法及其应用。 

背景技术

马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne）是引起马铃薯和甘薯的的主要病原物之一，该线虫是一种迁移性内寄生线虫，主要危害作物的地下部分。我国早在1937年就报道发生甘薯茎线虫病,曾一度认为是由D.dipsaci引起的（刘先宝,葛建军,谭志琼,曹爱新.马铃薯腐烂茎线虫在国内危害马铃薯的首次报道.植物保护,2006,32(6):157-158），直至1979年，张香蓉认为病原是马铃薯腐烂茎线虫(张香蓉.地瓜茎线虫病.济南:山东科技出版社,1979),以后丁再福和林茂松、尹光德和张云美对病原进行了系统的鉴定,证实山东、江苏甘薯上的茎线虫病原为马铃薯腐烂茎线虫（丁再福,林茂松.甘薯马铃薯和薄荷上的茎线虫的鉴定.植物保护,1982,9(3):169172;尹光德,张云美.甘薯茎线虫病病原线虫的订正.山东农大学报(自然科学版),1983,4,117-127）。陈品三等报道该线虫引起当归麻口病（陈品三,郑经武.当归麻口病致病茎线虫的鉴定研究.植物保护,1988,14(6):12-14）。马铃薯腐烂茎线虫寄主范围非常广泛，包括马铃薯、甘薯、豌豆、花生等100多种寄主（Peng H,Gao B-l,Kong L-a,Yu Q,Huang W-k,et al.(2013)Exploring the Host Parasitism of the Migratory Plant-ParasiticNematode Ditylenchus destuctor by Expressed Sequence Tags Analysis.PLoS ONE8(7):e69579.），每年带来巨大的经济损失，且危害在逐年上升，在我国和世界其他国家和地区将其划为检疫性有害生物（中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，2007；EPPO,2008Diagnostics&Diagnostic:Ditylenchus destructor and Ditylenchus dipsaci）。除此之外，马铃薯腐烂茎线虫也侵染花卉的块根和块茎；D.destructor在南非侵染花生，造成巨大的损失(林茂松, 文玲,方中达.马铃薯腐烂线虫与甘薯茎线虫病.江苏农业学报,1999,15(3):186-190)，除此之外，国内外还报道了马铃薯腐烂茎线虫能够危害马铃薯和花生（刘先宝,葛建军,谭志琼,曹爱新.马铃薯腐烂茎线虫在国内危害马铃薯的首次报道.植物保护,2006,32(6):157-158；程云，张绍升.腐烂茎线虫对花生的致病性,福建农林大学学报(自然科学版)，2007，36（5）454-457)。 

由马铃薯腐烂茎线虫引起的甘薯茎线虫病是我国甘薯产区的重要病害之一，一般发病田块减产20%～50%,重病田块基本上绝产无收（陈品三.甘薯糠腐茎线虫病.1995,512-517）。在我国的北京、天津、山东、山西、河北、河南、江苏、浙江、福建、辽宁、甘肃等省市均有发生，以山东、河北两省发生最为严重，部分地区的甘薯产区发病面积达25%，发病率在30%左右，严重者发病率可高达80%，发病地块一般减产20-30%，严重者达50%以上，甚至绝产；该病不仅在田间为害直接造成减产，而且还引起储藏后期烂窖（陈发炜,韩祥红,李祥升.甘薯茎线虫病的综合防治技术.植保技术与推广,1996:16(6):12）。1977年山东调查，全省该病害已遍及9个地区（市）57个县。有的地区田间种薯腐烂减产达80%以上，储藏烂窖的损失在50%以上(李建中，彭德良，刘淑艳，黄文坤.马铃薯腐烂茎线虫在中国的适生性风险分析.廖金铃，彭德良，郑经武等.中国线虫学研究（第二卷）.北京：中国农业科学技术出版社,20082:137-142)。因此，马铃薯腐烂茎线虫已成为我国华北和华东甘薯上毁灭性线虫病害，严重制约了我国甘薯产业的发展（范文中,孙淑云,孙艳梅.警惕甘薯茎线虫病流行.吉林农业科学,1999,24(4):32；叶松枝，李跃杰,刘海元.甘薯茎线虫病的发生与防治技术.植保技术与推广,1997,17(3),20-21）。该线虫侵入甘薯后，食道腺分泌一些果胶酶、淀粉酶和蛋白酶等细胞壁降解酶类，通过口针注入甘薯体内，使甘薯细胞崩溃、组织腐烂，伴随着其它真菌和细菌加剧危害，常形成“糠心”或龟裂，使甘薯失去食用价值(林茂松,文玲,方中达.马铃薯腐烂线虫与甘薯茎线虫病.江苏农业学报,1999,15(3):186-190.)。 

以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为植物线虫的快速诊断和检测提供了强有 力的工具。特异性引物PCR分子检测技术在植物线虫的分子检测中取得了很大的发展，通过一次PCR扩增即可检测出样本中的一个或多个植物线虫的种群，极大的缩短了检测时间，提高了检测效率。在植物线虫的快速分子检测中，基于植物线虫的核糖体DNA（rDNA）为靶标而构建的特异性检测方法取得了巨大的进展。Bulman&Marshall（Bulman SR,Marshall JW.Differentiation of Australasian potato cyst nematode(PCN)populations using the polymerase chain reaction(PCR)New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science.1997;25:123–129）在分析了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSr3和马铃薯白线虫的特异性引物PITSp4，通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，与PITSp4可以扩增出265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出马铃薯金线虫。Subbotin 等（Subbotin,S.A.,Peng,D.and Moens,M.2001A rapid method for the identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines using duplex PCR.Nematology3,365–370）构建了基于rDNA-ITS区域上的大豆孢囊线虫特异性引物GlyF1，应用两组引物D3A和D3B及大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1和引物rDNA2成功地对大豆孢囊线虫进行了分子诊断研究。大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1灵敏性非常高，能从单条幼虫的微量DNA中扩增出大豆孢囊线虫种特异性片段。彭德良等（彭德良，王琼，耿丽凤，李佳，彭焕，张东升.一种香蕉穿孔线虫早期分子检测方法，专利号ZL201010113930.X）根据香蕉穿孔线虫ITS的序列差异设计了香蕉穿孔线虫的特异性引物RsF1/RsR1，结合28S区的D3扩展区的通用引物（D3A/D3B）作为内标，采用一步双重PCR方法能够特异地检测出香蕉穿孔线虫，同时该方法能够用于土壤样本和罹病植物的直接检测。 

在马铃薯腐烂茎线虫的分子检测中，Wendt等（Wendt,K.,Vrain,T.C.&Webster,J.M.1993.Separation of three species of Ditylenchus and some host races of D.dipsaci by Restriction Fragment Length Polymorphism.Journal of Nematology25,555-563）开发了ITS-RFLP的技术， 利用多种限制性内切酶酶切ITS序列，能够准确的区分马铃薯腐烂茎线虫和鳞球茎线虫。本实验室在前期的研究中发现，马铃薯腐烂茎线虫的ITS具有明显差异，可以分为明显的2种类型：A型和B型，据此设计出2对特异性引物检测A型和B型，A型马铃薯腐烂茎线虫特异引物为DDS1/DDS2，特异扩增片段为252bp；B型马铃薯腐烂茎线虫特异引物为DDL1/DDL2，特异扩增片段为485bp；引入线虫通用引物D3A/D3B作内标，研究出一步双重PCR特异性检测马铃薯腐烂茎线虫不同类型群体的分子技术和方法，该分子检测技术具有特异性强、方法可靠、灵敏性高、操作简便，检测的精确度达到单条线虫的水平。（宛菲,彭德良,杨玉文,何月秋.马铃薯腐烂茎线虫特异性分子检测技术研究.2008植物病理学报，38(3):263-270）。Marek等(M.Marek,M.Zouhar,O.Douda,J.Mazakova and P.Rysanek 2010.Bioinformatics-assisted characterization of the ITS1-5·8S-ITS2segments of nuclear rRNA gene clusters,and its exploitation in molecular diagnostics of European crop-parasitic nematodes of the genus Ditylenchus.Plant Pathology59,931-943)等根据D.destructor和D.dipsaci的差异开发出能够同时检测上述两种线虫的特异性引物DipU-F/DipU-R，Des2-F/Des1-R，其中DipU-F/DipU-R能够特异的从D.dipsaci检测出333bp的片段，Des2-F/Des1-R能够特异的从马铃薯腐烂茎线虫中检测出453bp的片段。但后期的研究结果表明Des2-F/Des1-R只能够检测B型的马铃薯腐烂茎线虫（Subbotin S.A.,Inserra R.N.,Marais M.,Mullin P.,Powers T.,Roberts P.A.,Van den Berg E.,Yeates G.W.&Baldwin,J.G.2011.Diversity and phylogenetic relationships within the spiral nematodes of Helicotylenchus Steiner,1945(Tylenchida:Hoplolaimidae)as inferred from analysis of the D2-D3expansion segments of28S rRNA gene sequences.Nematology,13:773-785）。刘斌等(刘斌,梅圆圆,郑经武.2007.腐烂茎线虫种内群体特异性检测研究.浙江大学学报(农业与生命科学版),33(5):490-496)根据马铃薯腐烂茎线虫的ITS序列设计了一组特异性引物，能够扩增出346bp的片段，但是检测的样本只包括了马铃薯腐烂茎线虫。刘倩等（刘倩,牛俊海,简恒,郭全新,陈昌龙.基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及其应用，CN102260746A）开发了马铃薯腐烂茎线虫的LAMP检测 技术。 

国内外已有马铃薯腐烂茎线虫核糖体DNA的ITS区域的研究报道，但是目前已开发的引物大部分只能够检测马铃薯腐烂茎线虫某一种类型，目前还没有能够同时检测A类和B型马铃薯腐烂茎线虫的特异性PCR检测方法。 

发明内容

本发明的主要发明内容是提供一种基于ITS序列差异的马铃薯腐烂茎线虫快速PCR分子检测方法及其应用，为制定线虫的快速分子检测、作物腐烂茎线虫病的早期诊断和辅助鉴定等服务。 

马铃薯腐烂茎线虫快速PCR分子检测方法，包括PCR反应体系，其特征在于所述PCR反应体系中有一组特异性引物，所述特异性引物为DdF1和DdR1， 

DdF1:5’-GCTCTGTGCCTGGCTAATTTGTG-3’， 

DdR1:5’-ACCAAACACTGGACAGCATTATC-3’。 

所述PCR反应体系中还含有通用引物D2A和D3B， 

D2A:5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’， 

D3B:5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’。 

所述的PCR反应体系为2.5μl的10×PCR含Mg2+的Buffer；2μl10mM dNTP；1.5μl引物对DdF1/DdR1；0.2μl Taq DNA聚合酶；2μl模板DNA；灭菌ddH2O补足至25μl。 

PCR反应条件为95℃预变性8min，95℃，45s，55℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。 

上述马铃薯腐烂茎线虫快速PCR分子检测方法在送检样本中是否带有马铃薯腐烂茎线虫及辅助鉴定中的应用。 

本发明利用ITS通用引物扩增获得7个不同国家和地区的马铃薯腐烂茎线虫，其中包括2个B型和5个A型种群。从Genbank下载多个茎线虫属的ITS序列比对后，在马铃薯腐烂 茎线虫ITS特异性区域设计引物，用于马铃薯腐烂茎线虫的快速分子检测。 

本发明开发了马铃薯腐烂茎线虫特异性引物DdF1和DdR1，构建了快速PCR分子检测PCR体系。采用特异性引物DdF1和DdR1能够同时对A型和B型马铃薯腐烂茎线虫进行特异性扩增，扩增片段长度均为495bp，而其他7类茎线虫属14个种群均没有检测到495bp的特异性片段。为了降低检测的假阴性结果，在特异性检测的同时加入28S的通用引物D2A和D3B,用于DNA质量的检测，通用引物D2A和D3B能够从所有的有效的DNA中扩增出长度为780bp左右的片段，阳性的样本将同时出现了495bp的特异性片段和780bp的片段，而非马铃薯腐烂茎线虫只有780bp的片段，从而增加了检测结果的准确性。同时，不同稀释浓度的单头马铃薯腐烂茎线虫DNA和浓度确定的一系列稀释浓度的马铃薯腐烂茎线虫基因组DNA用于本研究开发的马铃薯腐烂茎线虫特异性引物DdF1和DdR1的灵敏度检测，从而确定马铃薯腐烂茎线虫的特异性引物和检测方法的检测阈值为1ng/ul和1/128头线虫DNA。具有很高的灵敏度。由此可以确定本发明构建的特异性引物DdF1和DdR1及其检测方法特异性强、灵敏度高、快速、准确。 

本发明待测的植物线虫包括A型马铃薯腐烂茎线虫、B型马铃薯腐烂茎线虫、2个国外马铃薯腐烂茎线虫种群、鳞球茎线虫、非洲茎线虫、D.gagis、D.weischeri和3个茎线虫未知种。 

本发明采用通用引物TW81和AB28扩增出马铃薯腐烂茎线虫的ITS序列，通过和其他茎线虫的ITS序列比对设计出一对特异性引物DdF1和DdR1,，实现了对A型和B型马铃薯茎线虫的同时检测和诊断。具有极高的特异性和灵敏度，降低了对检测样本的误判。同时该方法将可以应用于马铃薯腐烂茎线虫的田间样品检测和发生分布的监测预警等方面，具有实际的应用价值。 

附图说明

图1：不同茎线虫种的ITS序列比对及特异性引物设计， 

图2：马铃薯腐烂茎线虫特异性检测结果， 

M为标准DNA分子标记（DNA marker III）；1-7分别为马铃薯腐烂茎线虫不同群体（编码为Dd01，Dd02，Dd03，Dd04，Dd05，Dd06，Dd07）；8-14分别为鳞球茎线虫不同群体（Dp01，Dp02，Dp03，Dp04，Dp05，Dp06，Dp07）；15为非洲茎线虫（编码为Da01）；16为D.weischeri群体（Dw01）17为D.gagis群体(Dg01)，18-20为3个未知种的茎线虫（Dity01，Dity02和Dity03）;CK为阴性对照； 

图3：不同稀释浓度的单头马铃薯腐烂茎线虫DNA灵敏度检测结果， 

M为标准DNA分子标记（DNA marker III）；1-8分别为1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128条马铃薯腐烂茎线虫；CK为阴性对照。 

图4：不同浓度的马铃薯腐烂茎线虫基因组DNA灵敏度检测结果， 

M为标准DNA分子标记（DNA marker III）；1-8为马铃薯腐烂茎线虫基因组DNA（100μg/μl、10μg/μl、1μg/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10pg/μl和1pg/μl）；CK：阴性对照。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。 

本发明的实验选用的材料： 

7个马铃薯腐烂茎线虫群体为本实验室从内蒙古、河南、吉林、山东和美国和加拿大等地收集，13个鳞球茎线虫、非洲茎线虫、D.weishceri，D.gagis和其他未知种的茎线虫DNA为本实验室工作人员从外国收集(见表1)。上述马铃薯腐烂茎线虫DNA本实验室均有保存，可以对公众发放。 

表1检测的茎线虫样品代码及群体来源 

主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、DNA marker和PMD18-T vector购自TaKaRa公司，引物由上海生工生物技术有限公司合成。 

实施例1:马铃薯腐烂茎线虫特异性PCR分子检测方法的建立 

1.1线虫DNA的提取 

手挑茎线虫种群单头线虫，放入盛有7μl的10×的PCR buffer，3μl蛋白酶K溶液(600μg/ml)和10μl灭菌的重蒸水中的离心管中，-20℃冰箱中冷冻1h。用75％酒精消毒的玻 璃棒转动至冰融化，然后在-20℃下冷冻至少2h。2h后，将离心管从冰箱中取出，置65℃下温育1.5h，接着在95℃10min，，最后10000rpm下离心1min，上清液于-20℃保存备用。 

1.2马铃薯腐烂茎线虫特异性引物设计和筛选 

采用通用引物TW81（5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’）和AB28（5’TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’），以上述提取的茎线虫的DNA为模板，扩增马铃薯腐烂茎线虫ITS序列。PCR的反应体系为10×Buffer(含Mg²⁺)5μl，10mM dNTP4μl，ddH2O32.6μl，引物TW81和AB28（20μMol/L）各1.5μl，Taq酶（5U/μl,Takara）0.4μl，模板DNA5μl，总计50μl。PCR扩增条件为：95℃，8min，56℃，30s，72℃，1min；94℃，45s，50℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min，10℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上，在0.5×TAE电泳缓冲液下电泳40分钟，EB染色，在凝胶成像仪下观测并照相。国内的马铃薯腐烂茎线虫的ITS序列均以提交Genbank注册（EF210367、EF418002、EF210372、EF208211、EF208212）。 

从NCBI基因库中下载起绒草茎线虫、水稻茎线虫、食菌茎线虫、多叶茎线虫、D.askenasyi、非洲茎线虫、D.gagis、D.weisheri等多个近缘种线虫的rDNA-ITS区域序列，使用MEGA5.0对上述序列及我国马铃薯腐烂茎线虫不同型群体的ITS测序结果进行比对分析，采用primer5.0设计特异性引物DdF1和DdR1用于马铃薯腐烂茎线虫的特异性检测（图1）。 

根据多种茎线虫的ITS序列比对结果，选取马铃薯腐烂茎线虫的特异区域设计一组特异性引物，该组引物的长度均为23碱基。马铃薯腐烂茎线虫特异性引物上游引物和下游引物分别命名为DdF1和DdR1，其序列特征如下： 

DdF1:5’-GCTCTGTGCCTGGCTAATTTGTG-3’， 

DdR1:5’-ACCAAACACTGGACAGCATTATC-3’。 

1.3马铃薯腐烂茎线虫特异性PCR分子检测体系的建立 

采用本发明设计的特异性引物DdF1/DdR1，以马铃薯腐烂茎线虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系：2.5μl10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2μl10mM dNTP（2.5mM），1.5μl引物对DdF1/DdR1(20uM)，0.2μl Taq DNA聚合酶（5U/ul），2μl模板DNA，灭菌 ddH2O补足至25μl。采用无线虫DNA模板为阴性对照。在PCR扩增仪上进行扩增。PCR反应条件如下：95℃，8min，95℃，45s，55℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。取5μl扩增产物加1μl上样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，120V/40min，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。 

实施例2：马铃薯腐烂茎线虫PCR分子检测方法特异性和灵敏度检测。 

2.1马铃薯腐烂茎线虫PCR分子检测方法特异性检测。 

本发明设计的特异性引物DdF1/DdR1和通用引物D2A/D3B交由上海生物工程有限公司合成，PCR反应体系：2.5μl10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2μl10mM dNTP（2.5mM），1.5μl引物对DdF1/DdR1(20μM)，0.2μl Taq DNA聚合酶（5U/μl），2μl模板DNA，灭菌ddH2O补足至25μl。采用无线虫DNA模板为阴性对照。在Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。PCR反应条件如下：95℃，8min，95℃，45s，55℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。取5μl扩增产物加1μl上样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用0.5×TAE作为电泳缓冲液，120V/40min，用EB染色，在紫光灯下观测并照相。同时我们采用通用引物D2A和D3B和上述相同的PCR反应体系和扩增条件以上述DNA为模板进行扩增，检测DNA的质量。 

D2A:5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’， 

D3B:5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’。 

7个马铃薯腐烂茎线虫种群经特异性引物DdF1和DdR1扩增出一条稳定的条带，长度为495bp，其他茎线虫种群和阴性对照中无扩增条带出现，DNA质量检测发现，本发明采用的DNA模板均完好，通用引物D2A和D3B均能够扩增出稳定的条带，如图2所示，说明设计的特异性引物符合要求。 

2.2马铃薯腐烂茎线虫PCR分子检测方法灵敏度检测。 

提取单条马铃薯腐烂茎线虫的DNA，采用2倍稀释法，对DNA进行稀释得到1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、条马铃薯腐烂茎线虫的DNA，各取1μl马铃薯腐烂茎线虫DNA做模板用特异性引物DdF1/DdR1进行PCR扩增，以检验特异性引物的的灵敏度。 

采用酚/氯仿抽提法马铃薯腐烂茎线虫的基因组DNA，采用Nanodrop2000测定其基因组 DNA浓度，采用水将其稀释成100μg/μl、10μg/μl、1μg/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、10pg/μl和1pg/μl8个浓度，各取1μl马铃薯腐烂茎线虫DNA做模板用特异性引物DdF1/DdR1进行PCR扩增以检验特异性引物的的灵敏度。马铃薯腐烂茎线虫ITS特异性引物DdF1/DdR1由上海生工生物技术有限公司合成。特异性引物灵敏度检测扩增反应体系和扩增程序如2.1所述，在PCR扩增仪上进行扩增。电泳结果如图3和图4所示。 

图3的结果表明，从1-1/64条线虫都能够扩增出清晰的条带（泳道1－6），而1/64、1/128条线虫的条带也能隐约可见，阴性对照没有扩增条带。图4的结果说明，该马铃薯腐烂茎线虫的特异性引物和检测方法的检测阈值为1ng/μl，这说明该特异性引物及检测方法的灵敏度非常高，因此说明该方法非常可靠。