用于在裸子植物树中调节球花发育的方法

摘要

一方面，本发明提供了一种调节在裸子植物树上生长的球花的发育阶段的方法，所述方法包括：（a）在一个或多个球花芽上安装护罩，其中对护罩的类型进行选择以延迟或提早球花发育；以及（b）将所述护罩在所述球花芽上维持足够的时间段，以与自然生长的未加护罩的对照球花的发育阶段相比，延迟或提早安装护罩的球花芽的发育阶段。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请有权享有并要求2011年6月30日提交的美国正式专利申 请序列号13/173,229，题为“用于在裸子植物树中调节球花发育的方法 （Methods for Modulating Strobili Development in Ggymnosperm  Trees）”的优先权权益，所述专利申请的内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于在裸子植物树中调节球花发育的方法。

背景技术

林木例如针叶树的受控授粉，被用于产生世系已知的家族，用于 后代试验和高世代育种。自从二十世纪50年代的树种改良计划开始以 来，在选择后对针叶树（例如火炬松树）进行快速育种已成为一种挑 战（参见例如Zobel和Talbert，《应用林木改良》（Applied Forest Tree  Improvement），Wiley,New York,505pp.（1984））。在野外，在1 岁砧木上制造的嫁接体在5年或更多年中不产生足够用于育种的球花 （花）。在二十世纪70年代中，开发了用于温室育种的技术，其通过 使用各种诱导技术例如激素、剪根、水分胁迫、环状剥皮和异相休眠 来缩短产生球花的时间（Greenwood,M.S.，“用于火炬松的催花技术” （Flower Stimulation Techniques for Loblolly Pine（Pinus taeda L.））， 在第3届世界林木育种商讨会(3rd World Consultation on Forest Tree  Breeding)的会议记录中:CSIRO:1031-1042（1977），Greenwood,M.S, Science210:443-444（1978））。尽管在减少育种时间方面有效，但温 室育种昂贵，并且在火炬松中已被高接替代（Bramlett和Burris，“在 生殖成熟的火炬松中高接幼枝”（Topworking Young Scions Into  Reproductively Mature Loblolly Pine），第23届南方林木改良会议会议 记录（Proceedings:23rd Southern Forest Tree Improvement Conference）, Asheville,N.C.;pp.234-241（1995）；Bramlett,D.L.,Journal of Forestry 95（3）:15-19（1997））。通过在成熟的树园树的顶部进行嫁接，可 以加速球花，并且可以在嫁接后仅仅两年完成给定的所选树木组的育 种。

尽管高接育种与温室育种相比更快并且更廉价，但在2年内完成 育种仍然是一种挑战，因为从足够的雄花及时获得花粉以在雌花发育 过了可授性之前为它们所有进行授粉，是困难的。因此，对于在针叶 树中调节球花发育，以允许在较短时间段内、例如在1年内对高世代 选择进行育种的有效方法，存在着需求。

发明简述

提供本简述的目的是以简化形式介绍在下面的详细描述中进一步 描述的一组概念。本简述不打算确定所要求保护的主题内容的关键特 点，它也不打算用于协助确定所要求保护的主题内容的范围。

综上所述，一方面，本发明提供了调节在裸子植物树上生长的球 花的发育阶段的方法，所述方法包括：（a）在一个或多个球花芽上安 装护罩，其中对护罩的类型进行选择以延迟或提早球花发育；以及（b） 将所述护罩在所述球花芽上维持足够的时间段，以与自然生长的未加 护罩的对照球花的发育阶段相比，延迟或提早安装护罩的球花芽的发 育阶段。在某些实施方式中，所述护罩被选择用于延迟安装护罩的球 花芽的发育阶段，并且包含完全阻断日光照射的材料。在某些实施方 式中，所述护罩在雌球花芽上安装足以延迟所述安装护罩的球花的发 育阶段的时间。在某些实施方式中，所述护罩被选择用于提早所述安 装护罩的球花的发育阶段，并包含维持所述护罩内的温度高于外部环 境温度的材料。在某些实施方式中，所述树是针叶树。

另一方面，本发明提供了在裸子植物树育种计划中使从雄球花收 集花粉和雌球花可授性的时间同步的方法。本发明的这一方面的方法 包括至少一个下述步骤：（a）通过在一个或多个雄球花芽上安装被选 择用于提早雄球花发育的护罩类型，以及将所述护罩维持在所述球花 上直至花粉产生，来提早一棵或多棵树上的一个或多个雄球花的发育 阶段；和/或（b）通过在一个或多个雌球花芽上安装被选择用于延迟雌 球花发育的护罩类型，以及将所述护罩维持在所述雌球花上，直至按 照步骤（a）产生足够的花粉，或直至大部分未加护罩的对照雌花处于 不再接受授粉的发育阶段，来延迟所述育种计划中的一棵或多棵树上 的一个或多个雌球花的发育阶段。在某些实施方式中，所述方法还包 括至少一个下述步骤：（i）将按照步骤（a）产生的花粉施加到按照步 骤（b）产生的雌球花；或（ii）将产生自未提早的雄球花的花粉施加 到按照步骤（b）产生的雌球花。在某些实施方式中，所述裸子植物树 是针叶树。

附图说明

通过结合随附的图参考下面的详细描述，本发明的上述方面和许 多随之产生的优点将被更好地理解，因此也更容易认识到这些方面和 优点，在所述图中：

图1A-G示出了如表1中所述的球花发育的不同阶段；

图2是代表性野外试验的照片，其示出了如实施例1和2中所描 述的覆盖火炬松小球果的各种类型的护罩（隔离袋）；

图3图示了如实施例2中所述，在2007年育种季中3月份中的一 周时间段中，8种不同类型隔离袋中的3种的内部温度和相应的袋子外 部温度（对照）；

图4图示了如实施例3中所描述的代表性花（球花）发育试验的 结果，其示出了在使用各种类型的铝箔隔离袋后观察到的花（球花） 发育延迟；并且

图5图示了如实施例5中所描述的代表性花（球花）发育试验的 结果，其示出了观察到的花（球花）发育延迟对各种处理的响应。

详细描述

除非在本文中特别定义，否则在本文中使用的所有术语的意义与 本发明所属领域的技术人员所理解的意义相同。

为了明确在说明书和权利要求书中用于描述本发明的某些术语， 提供了下列定义。

当在本文中使用时，在针叶树（例如松树或花旗松）的情形中， 术语“雄花”是指小孢子囊球花。

当在本文中使用时，在针叶树（例如松树或花旗松）的情形中， 术语“雌花”是指大孢子囊球花。

当在本文中使用时，术语“育种组”是指根据至少一种所需表型 性状选择的多个植物。通常将该组进行异种交配，对得到的后代进行 试验，并将其用于对将来的育种和试验世代做出选择。

在裸子植物育种计划例如针叶树高世代育种计划中，使用林木的 受控授粉来产生世系已知的家族。简单来说，在下面的表2中概括的 这一过程，包括根据所需判据例如一种或多种所需性状的高表型分值 来选择树木。然后将所选树木的接穗嫁接在克隆库和生产树园（即用 于育种目的的性成熟的树）中。嫁接的小树（ramlet）在几年后开始产 生球花。被保护性芽鳞包封的球花原基在冬季月份中缓慢发育。随着 球花发育，它们从芽鳞中露出，达到可授阶段，此时它们可以捕获风 传播的花粉。球花发育的阶段详细描述在表1中并图示在图1A-G中。

嫁接的树木产生分开的大孢子囊球花（雌性）和小孢子囊球花（雄 性），其具有原始所选树木的遗传特征。在花粉从嫁接树木脱落的时 间附近收集雄球花。通过干燥至低于10%的水分含量对球花进行加工， 然后将花粉从球花振摇下来，储存并任选地冷冻，以备将来使用。

将嫁接物上的大孢子囊球花套上隔离袋，以防止来自于不同来源 的花粉的污染。然后在苞鳞处于可授阶段时，将花粉施加到嫁接材料 上的大孢子囊球花。对于火炬松来说在授粉后约18个月，授粉的球花 成熟成为球果，并在秋季收获。

表1：在《花粉管理手册》，农业手册587号（“Pollen Management  Handbook”，Agriculture Handbook Number587）,第44-51页（1981） 中描述的球花发育的发育阶段（基于Cumming和Righter1948）

正如在本文的实施例1-5中所述，本发明人发现了通过在处于发 育早期阶段的球花芽上安装护罩例如袋子，来调节在针叶树上生长的 球花（花）的发育阶段的方法，其中对护罩的类型进行选择，以延迟 （即迟滞）球花发育或提早球花发育。例如，可以将被选择用于延迟 球花发育的护罩类型安装在大孢子囊球花（雌花）芽上，以将大孢子 囊球花的发育延迟到例如花粉可用时。在另一个实例中，可以将被选 择用于提早球花发育的护罩类型安装在球花芽上，以将花提早到所需 阶段（例如将雌花提早到可授阶段，或将雄花提早到花粉产生阶段）。

根据上述，一方面，本发明提供了一种调节在裸子植物树上生长 的球花的发育阶段的方法，所述方法包括：（a）在一个或多个球花芽 上安装护罩，其中对护罩的类型进行选择以延迟或提早球花发育；以 及（b）将所述护罩在所述球花芽上维持足够的时间段，以与自然生长 的未加护罩的对照球花的发育阶段相比，延迟或提早所述安装护罩的 球花芽的发育阶段。

在本发明中使用的护罩可以由能够安装以覆盖并包绕活树枝上的 一个或多个球花芽的任何适合的材料来构造。在某些实施方式中，护 罩采取由刚性或非刚性材料形成的袋子或套筒的形式。在某些实施方 式中，护罩采取包裹在包含一个或多个球花芽的枝条上并紧固在位的 材料（例如铝箔）的形式。在某些实施方式中，护罩包含完全阻断日 光照射并将护罩内部的空气温度维持在与护罩外部的环境温度接近 （即在5至10℉之内）的材料，或由所述材料构成。

在某些实施方式中，护罩包含可以拆除的外层和内层。在某些实 施方式中，使用适合的紧固件例如塑料系带、线绳、金属丝等将护罩 围绕枝条紧固，以便将日光照射排除在护罩内部之外。

通过选择用于将护罩例如袋子附连到枝条的位置，例如枝条上的 天然结节，来进行护罩的安装。在使用针叶树的实施方式中，可以任 选地修剪针叶。然后将护罩置于嫩枝和球花芽上，并在底部用金属丝 或其他适合的捆绑材料（绳索、夹子、塑料系带等）束紧，以便排除 日光用于延迟球花发育；或保留热量以提早球花发育。采取袋子形式 的代表性的护罩示出在图2中。

根据本发明的方法，在一种实施方式中，对护罩进行选择以延迟 球花（花）发育。如本文中的实施例1-5中所描述，本发明人已确定， 包含完全阻断日光照射的材料的护罩能够有效延迟球花发育。在某些 实施方式中，护罩包含反射性外表面或层。在某些实施方式中，护罩 包含铝（例如铝箔）或镀铝材料，或由它们构成。在某些实施方式中， 被选择用于延迟球花发育的护罩，包含将护罩内部的温度维持在外部 环境温度的5至10℉之内的材料。

在方法的其他实施方式中，对护罩进行选择以提早安装护罩的球 花（花）的发育阶段，并且所述护罩包含维持护罩内部的温度高于外 部环境温度（例如高15至30度）的材料。在某些实施方式中，被选 择用于提早安装护罩的球花的发育阶段的护罩，包含无纺布、纸、塑 料材料，或由其构成，并且还可以包含非反射性表面例如深色或黑色 非反射性表面。在某些实施方式中，被选择用于提早发育阶段的护罩 包含透明材料例如肠衣，或由其构成。

本发明的方法可以在所有类型的裸子植物树上用于延迟和/或提 早在树上生长的球花的球花发育，以便促进树木育种计划。在某些实 施方式中，本发明的方法被用于延迟和/或提早来自任何针叶树物种的 针叶树上的球花发育，所述物种例如松科的成员、包括松属的成员（例 如火炬松（Pinus taeda）），或例如黄杉属的成员（例如花旗松 （Pseudotsuga menziesii）），或例如冷杉属的成员（例如白冷杉（Abies  concolor）），或例如云杉属的成员（例如黑云杉（Picea mariana））。

在某些实施方式中，被选择用于延迟安装护罩的球花芽的发育阶 段的护罩，在球花可授性之前的时间点（即阶段1-2）安装在针叶树上 的雌球花上，并维持在所述球花上，直至大部分未加护罩的对照雌球 花处于不再接受授粉的发育阶段。

正如本文中所述，在一种代表性实施方式中，本发明人发现，与 热狗包装袋类似的铝袋，通过在十二月份的前三周内将所述袋子（即 护罩）固定在发育中的雌球花芽上，以便将袋子密封以阻断光，可用 于延迟雌球花发育。然后在同一株树上的未延迟的球花达到最大可授 性的时间附近，将袋子移除。然后，为了控制授粉以用于进一步的育 种计划，将球花隔离在正常的授粉袋中。可以从具有花粉球花的枝条 收集并加工花粉，使其随时可用于授粉。当延迟的雌球花变得具有可 授性时，可以将花粉导入到授粉袋中。通常，通过将袋子保持在直立 位置并用空气递送系统分发花粉，将花粉注入到袋子的顶部中并允许 它沉降在球花上，来进行袋中的授粉。随后，在袋子中的球花达到阶 段6后移除袋子（通常在阶段5开始后7至10天，因此袋子通常在授 粉后2周移除）。这一过程允许在一年内完成高世代选择的育种。

对于控制混合授粉（control mass pollination，CMP）来说，允许 延迟的雌球花自然发育。由于延迟的球花与树园不同期，因此不必将 它们用授粉袋装袋，因为当延迟的球花达到可授性时，在树园中不存 在天然的散花粉。CMP花粉可以通过多种方法来施加。这一过程中的 价值来自于更大的球花保留（没有由于授粉袋损伤造成的花的损失） 和较廉价的进行授粉的方法（即不需要向授粉袋分别地添加花粉）。

在一种实施方式中，方法包括选择在上冠部中处于直立位置的带 有强壮球花的枝，当球花处于阶段1时安装被选择用于延迟雌球花发 育的护罩（例如袋子）并任选地用棍棒或金属丝支撑袋子；当未装袋 的雌球花达到阶段5时移除延迟袋；将延迟袋用标准的CMP隔离袋代 替；监测袋子中球花的可授性，并且在阶段5时当大部分球花具有最 大可授性时，施加约0.5cm³花粉。然后在授粉后约2周移除袋子，球 花成熟并产生种子。

另一方面，提供了在裸子植物树育种计划例如针叶树育种计划中使 从雄花收集花粉和雌花可授性的时间同步的方法。本发明的这一方面 的方法包括（a）提早育种计划中的一棵或多棵树上的一个或多个雄球 花的发育阶段，其包括在一个或多个雄球花芽上安装被选择用于提早 雄球花发育的护罩类型，以及将护罩维持在所述球花上直至花粉产生； 和/或（b）延迟所述育种计划中的一棵或多棵树上的一个或多个雌球花 的发育阶段，其包括在一个或多个雌球花芽上安装被选择用于延迟雌 球花发育的护罩类型，以及将护罩维持在所述雌球花上，直至按照步 骤（a）产生足够的花粉，或直至大部分未加护罩的对照雌花处于不再 接受授粉的发育阶段。

在一种实施方式中，方法还包括向按照步骤（b）处理的雌球花施 加按照步骤（a）产生的花粉。在一种实施方式中，方法还包括向按照 步骤（b）处理的雌球花施加产生自未提早球花的花粉。在一种实施方 式中，当雌球花仍被护罩覆盖时施加花粉。在另一种实施方式中，在 授粉、例如控制混合授粉之前移除护罩。

下面的实施例仅仅说明目前设想用于实践本发明的最佳方式，而 不应被解释为限制本发明。

实施例

背景/基本原理

在被选择以包含在高世代育种计划中之后对火炬松树进行快速育 种，可能是一种挑战。下面的表2示出了用于高接育种的典型时间线。 相当多的研究产生了用于诱导开花的技术，因为在1岁砧木上制造的 嫁接，在5年或更多年中在野外不产生足够用于育种的花。例如，当 使用高接来诱导开花时，已经确定，通过在成熟树园树的顶部进行嫁 接，可以提早球花产生，并且对于给定的所选树木组，可以在嫁接后2 至3年完成育种。然而，即使在存在雄球花和雌球花时，获得及时处 理的花粉以在同一季节中在雌花过了可授阶段之前为它们授粉，仍然 是困难的。

表2：以前用于高接育种的方法

如果可以发现在例如通过使用肠衣提早花粉脱落的同时显著延迟 雌球花发育的方法，如果产生足够的雌球花和花粉，可能可以在嫁接 后的第1年中完成育种。这将世代时间从10年减少到9年。

为了在第1年完成育种，可能必需对每种选择物做出更多嫁接， 以便具有足够的球花来完成交配设计。在第2年，由于尺寸更大，每 个嫁接物具有更多球花。从野外育种提前一年获得遗传增益，对于树 木改良计划具有非常大的经济回报，因此，如果需要，为了在第1年 完成育种而投入更多是值得的。至少，这样的方法使得从大多数或所 有雄花及时获得花粉用于在第二年中育种更加容易。育种的目的是准 备好花粉用于在可授性高峰或阶段4晚期至阶段5早期时对雌花授粉。 在鳞打开之前的阶段3和鳞膨大后的阶段6时球花一般不具有可授性， 并且花粉不能进入发生胚珠受精的贮粉室中。

在本文中描述的实施例中，进行了一系列顺序研究以（1）确定袋 子材料（即护罩）是否可用于足够长地延迟雌球花发育，以允许花粉 加工和随后的授粉；（2）确定安装袋子的最适时间，用于最大的雌球 花延迟；以及（3）确定雌球花的发育，和对延迟的雌花授粉后，确定 随后的种子形成。

在本文描述的研究中，雌球花的发育阶段按照Bramlett和 O'Gwynn，“识别南方松花的发育阶段：受控授粉的关键”（Recognizing  Developmental Stages in Southern Pine Flowers:the Key to Controlled  Pollination），Gen Tech Rep SE-18.Asheville,N.C.:USDA Forest Service, Southeastern For Exp Station.14p（1980）中所描述的判据来评分，如图 1A-G中所示。

实施例1

本实施例描述了在2006年进行的研究（#1研究），用于试验不 同尺寸、颜色和构造材料的7种隔离（即保护）袋类型，以确定它们 在火炬松中延迟雌球花发育的有效性是否存在任何差异。

方法和材料（#1研究（2006））

在2006年2月初，将7种袋子类型每种各2个育种袋安装在种子 园中两个亲本火炬松树的每个上：亲本A（发育中期）和亲本B（发育 晚期）。在本研究中，选择“中晚期”亲本是由于开始所述研究所需 的某些袋子材料的获得被延误。安装的袋子总数为2个亲代x7种袋 子类型x每棵树2个袋子=28个袋子。7种袋子类型和对照处理描述 在下面的表3中。

表3：在#1研究（2006）中使用的隔离袋材料

图2是示出了在1#研究中使用的各种袋子的照片。如图2中所示， 将袋子各自在底部用尼龙扎带系紧，并用所述尼龙扎带将袋子系在枝 条上。然而，可以使用适合于系紧袋子底部以排除日光的任何类型的 紧固件，例如绳索、金属丝等。

选择使用表3中描述的隔离袋类型的不同处理，以在袋子内提供 良好的温度范围，并在袋子内部提供不同水平的日光照射（日光）。 据认为，温度和日光照射两者能够影响球花发育。然而，在这个初步 研究中，袋子内部和外部的温度和日光照射都没有测量。

在2/3/2006将隔离袋安装在两棵树园亲本（A和B）上，并在 3/8/2006从亲本A取下，在3/15/2006从亲本B取下。在袋子安装时， 所有雌球花处于阶段1或2（即芽闭合并且没有花露出，如表1中所述 和图1A和1B中所示）。当在白色无纺布袋中的花（通过透明窗观察） 处于可授性峰值（即阶段5，如表1中所述和图1F中所示）时，将隔 离袋取下并对袋内花的发育进行评分。

在取下袋子后，如Bramlett和O'Gwynn，“识别南方松花的发育 阶段：受控授粉的关键”，Gen Tech Rep SE-18.Asheville,N.C.:USDA  Forest Service,Southeastern For Exp Station.14p（1980）中所述，按照 表1中所示的判据并如图1A-G中所示，对所有雌球花的发育阶段进行 评分。

结果：

到袋子取下时为止，所有袋子类型与未装袋的对照相比具有提早 的雌球花阶段发育，例外的是铝箔袋，其事实上延迟发育，如针对亲 本A和B的表4A-C中所示，并概括在表5中。表4A-C中示出的计数 针对的是每个亲本每种袋子类型2个袋子的计数。

表4A：针对来自于亲本树B的7种袋子类型和未装袋对照的雌球 花阶段，对每个袋子内的球花进行评分

注：袋子在2/3/06安装，在3/15/06取下；花阶段在3/15/06测量。

表4B：针对来自于亲本树A的7种袋子类型和未装袋对照的雌球 花阶段，对每个袋子内的球花进行评分

注：袋子在2/3/06安装，在3/8/06取下；花阶段在3/8/06测量。

表4C：针对来自于亲本A和B两者的7种袋子类型和未装袋对 照的雌球花阶段，对每个袋子内的球花进行评分

表5：7种不同袋子类型与未装袋对照相比的雌球花阶段。结果是 在#1研究（2006）中每种类型袋子（2棵树园亲本树的每棵各两个） 的平均值

结果讨论：

到袋子取下时为止，所有袋子类型与未装袋对照相比具有提早的 雌花阶段发育，例外的是两种类型的铝箔袋（处理F和G），其事实 上延迟发育（参见表4和5）。

在延迟袋被取下后，所有雌球花看起来健康，并在袋子取下后继 续正常发育。

肠衣袋类型与其他袋类型相比更快地提早球花发育阶段，紧接其 后是涂成黑色的无纺布。除了带有铝的袋子之外的所有袋子类型将花 提早到可授性或其后（即阶段4至6），此时对照和铝袋尚未达到可授 性（即阶段2和3），其中铝袋中约70%的花仍处于阶段2。

如表4和5中所示，用于控制混合授粉（CMP）的棕色牛皮纸袋 提早雌球花阶段发育。这种现象加上牛皮纸袋内部在夜间更凉（数据 未示出）这一事实，将花置于晚霜的高风险中。以前已确定，棕色牛 皮纸袋内部的花与袋子外的花相比具有相当高的死亡率（数据未示 出）。

在外部包有铝的白色无纺布袋（处理G）以及单独的铝袋（F）延 迟花的发育。这些结果与育种工作的关联之处在于，可以使用处理F （铝箔袋）或G（双重袋）来延迟雌球花发育，直至例如花粉到手时。 例如，使用双重袋（处理G），可以取下外部铝层以使育种能够向前 发展。或者，如果需要，将袋子涂成黑色可以加速育种工作，因为黑 色袋子比白色袋子更快地提早花。在开始时进行双重袋装袋，比在育 种季中间从铝改变成无纺布更加容易。

本研究的结果显示，袋子材料和颜色可用于调节（即加速或减缓） 雌球花发育，使季内育种更加可管理。例如，调节雌球花发育以便延 迟或提早某些树园亲本并由此分配工作量，将使育种更加可管理；特 别是在由于反常天气条件造成花发育压缩的年份中。铝袋基本上将球 花保持在它们被装袋时的阶段中超过一个月。除了带有铝的袋子之外 的所有袋子（例如肠衣、无纺布、牛皮纸）将花提早到可授性或更晚 阶段，此时未装袋的对照和铝袋尚未达到可授性，并可用于加速花粉 加工。根据这些结果，假设存在足够的雌花和雄花，育种可以在嫁接 后一季内完成。过去，我们不得不依赖在第一年收集花粉，用于在第 二年为雌花授粉。

实施例2

本实施例描述了后续研究#2（2007），进行所述研究是为了试验 其他隔离（即保护）袋类型以便确定它们延迟雌花发育中的有效性， 所述袋子类型都是铝袋的衍生物。

基本原理：

进行实施例1中描述的研究的后续研究#2（2007）是为了（1）试 验其他袋子类型，其中某些具有隔绝型；（2）向“中期”亲本A和“晚 期”亲本B表型的亲本增添“早期”表型亲本C，以便具有全表型范 围；以及（3）测量袋子内部与袋子外部的温度差。

方法：在2006年2月初，在三棵亲本树（A、B、C）的每棵上安 装7种袋子类型每种各2个育种袋。安装的袋子的总数为：（3个亲本 x袋子类型x每棵树2个袋子）=42个袋子。在本研究中使用的7 种袋子类型如下表6中所述，并如图2所提供的照片中所示。

表6：在#2研究中使用的材料（2007）

表6中描述的袋子在2/01和2/07安装在3棵亲本树（A、B、C） 上，并在3/9/07从亲本C取下，在3/12/07从亲本A取下，并在3/23/07 从亲本B取下。在安装时，所有雌球花处于阶段2（即芽关闭并且球花 未露出，如表1中所述和图1B中所示）。当通过透明窗观察时白色无 纺布袋子中的球花处于可授性高峰（即处于阶段5，如图1F中所示） 时，将袋子取下并评分。在取下袋子后，按照图1A-G（Bramlett和 O'Gwynn1980）中示出的阶段对所有雌球花进行发育阶段评分。

在实验期间，将温度记录器（由Dallas Semiconductor制造的 )安装在所有类型袋子的内部和袋子外部，并保留在树上。 随后，对从2007年2月3日至3月20日的昼间温度情况进行作图。

结果：

表7A：亲本树C，树18-6，袋子在2/1/07安装并在3/9/07取下

表7B：亲本树A，树37-55，袋子在2/1/07安装并在3/12/06取下

表7C：亲本树B，树34-53，袋子在2/2/07安装并在3/23/06取下

表7D：所有3个亲本（A、B、C），袋子在2/1/07安装，并且当 袋中的花处于最大可授性时对阶段进行评分

表8：在2007年研究中7种不同袋子类型与未装袋对照相比的花 阶段。结果是每种类型6个袋子（3棵树园亲本树A、B、C每棵各2 个）的平均值

图3图示了在2007年生长季期间的一周时间段内（3/5/07至 3/12/07），每日在6:30AM和3:30PM记录的牛皮纸袋（处理I）、白 色无纺布（处理K）和铝箔（处理L）袋子类型内部和袋子外部（对照） 的温度。如图3中所示，铝箔袋内部的温度与袋子外部的温度（环境、 未装袋温度）没有显著差异，并且在对照的5至10℉内。大多数铝袋 具有类似的温度分布情况。相反，在白天，牛皮纸袋（CMP）和白色 无纺布袋（育种）内部的温度明显高于袋子外部的温度，并且具有高 得多的最高温度。尽管不希望受到任何特定理论的限制，但似乎铝箔 装袋的花的阶段提前不如未装袋的花快的原因，可能与铝袋中缺乏光 相关，因为它们的温度分布情况与未装袋的对照类似。

在能够杀死松树花的临界寒冷期（低于30℉）期间，铝袋与无铝 袋相比事实上可能提供2至3度的保护。牛皮纸袋和白色无纺布袋内 部的最高温度比环境温度和铝袋内部的温度高得多，通常高出多达 15-30℉。这些结果解释了这些袋子中的花比对照的阶段提前快得多的 原因，这是由于花的物候与总热量强烈相关。

来自于2007研究（#2研究）的结论：

确定了具有铝箔的隔离袋（除了来自于Reynolds Corporation的“热 袋”之外）与其他袋子类型相比延迟雌球花发育，而所述其他袋子类 型与对照相比提早球花发育。还观察到与自然（未装袋）球花发育相 比，球花发育可以被明显提早（即使用肠衣）或延迟（即使用铝箔）。

还确定了将牛皮纸袋涂成银色（处理J）对球花阶段发育几乎没有 影响。除了在外部使用泡沫聚苯乙烯（在亲本A的情形中）之外，在 铝的内部或外部隔热几乎没有影响。仅在亲本A的情形中，外部隔热 提早而不是延迟球花发育。

来自于1#和2#研究的总体结论

确定了可以选择袋子类型以在火炬松中延迟或提早花的阶段发 育。通过提早花粉发育并同时延迟雌花可授性直至可以从所需雄性亲 本获得花粉，从而使从所有雄花及时加工花粉用于在同一季中为雌花 授粉成为可能，这一发现可用于促进在同一季中完成育种工作。

对于被发现可用于提早花发育的特定袋子类型来说，确定了肠衣 这种产生温室效应的无色/透明材料对于提早雌花阶段最为有效。在肠 衣下的雌花比未装袋的对照提前2个阶段以上。用于控制混合授粉 （CMP）的牛皮纸袋和用于谱系繁育的白色无纺布，也将花提早到对 照之前。将白色袋子的外表面涂成黑色进一步提早所述袋子类型中的 花发育。

对于被发现可用于延迟花发育的特定袋子类型来说，确定了只有 铝类型的袋子将雌花发育延迟到比未装袋对照更晚。从二月初至三月 中，在铝袋内超过一个月后，发现花基本上处于它们一开始装袋时所 处于的相同阶段，或当在阶段1或更早期装袋时仅仅略微向前发育。 确定了将棕色牛皮纸的外表面涂成银色对延迟花发育的影响小。

根据这些结果，本发明人确定了对于火炬松来说，不同袋子类型 可用于使花粉收集和雌花可授性的时间同步，以便在短的育种窗口中 有效地完成交配设计。例如，可以将雄花提早以尽早收集花粉，同时 可以延迟雌花可授性直至准备好花粉。这种方法使得在嫁接后仅仅一 年内完成育种成为可能。

实施例3

本实施例描述了后续研究#3（2008），进行所述研究是为了确定 安装隔离袋以延迟花发育的最适时间。

基本原理：在#1研究和#2研究中，如分别在实施例1和2中所述， 我们注意到花的发育没有被完全延迟，并且某些亲本上的花的延迟不 如其他亲本那样多。因此，进行本后续研究#3（2008）以确定安装花 延迟处理以实现完全延迟的最适时间。

方法：

在本研究中使用的4种铝袋类型是：

（1）薄铝箔层压的纸质热狗袋；

（2）厚铝箔层压的纸质热狗袋；

（3）铝箔包装；以及

（4）热狗袋罩着的铝箔包装。

处理在2008年1月10日和2月7日进行，并在2008年3月6日 观察花的发育。在装袋时所有花处于阶段1。在本研究中使用的亲本是 早至中季开花的克隆D和E两个克隆。

结果：

图4图示了花发育试验#3的结果，示出了在使用各种类型的铝箔 隔离袋后观察到的延迟的花发育。如图4中所示，只有在1月份进行 的处理延迟了雌花发育。在1月份进行的不同处理对于延迟雌花发育 来说效果同样好。

因此，这些结果证实了安装日期对于有效延迟雌花发育来说是重 要的。

实施例4

本实施例描述了另一项后续研究#4（2009），进行该研究是为了 确定（a）施加时间，和（b）由8种不同类型的铝材料构成的袋子在延 迟雌花发育中的有效性。

基本原理：从实施例3中描述的研究（#3研究），确定了安装日 期是有效延迟雌花发育的重要参数。在本#4后续研究中，我们还想尝 试一些不同袋子材料。

方法：

表9：在#4研究（2009）中使用的材料

处理 袋子类型 1 对照：未装袋的雌花 2 铝箔包装包在用胶带绑住的针叶上 3 厚铝箔层压的纸质热狗袋包在用胶带绑住的针叶上 4 泡沫铝箔-仅仅2层 5 泡沫铝箔-2层和铝箔包装 6 泡沫铝箔-仅仅1层 7 泡沫铝箔-1层和乙烯吸收性包装 8 铝箔袋套铝箔袋在自然针叶上 9 铝箔袋套铝箔袋在用胶带绑住的针叶上

#4研究：在下述3个时间段，安装在表9中描述的8种铝袋类型： 12月14-15日，1月19-22日和2月6-7日。在12月14-15日，花的阶 段为阶段1前期。芽是明显的，但是尚未如阶段1中那样与主芽分开。 对于1月和2月的安装来说，所有的花处于阶段1。

在本研究中使用的亲本是3株早开花克隆（F、G、H）以及3株 正常开花克隆（I、J、K）。

结果：所有处理工作良好（数据未示出）。12月的安装是在所有 被测试的克隆中一致地延迟雌花发育的唯一安装日期。

实施例5

本实施例描述了另一项后续研究#5（2010），进行该研究是为了 确定在火炬松中光和通风对隔离袋延迟雌花发育的有效性的影响。

基本原理：

进行本后续研究#5的目的是（1）通过使用各种不同袋子材料以 控制进入隔离袋的光，来确定光是否影响雌花发育的延迟；（2）通过 在延迟期中限制袋子内部霉菌的形成，确定隔离袋的通风是否对雌花 延迟处理具有正面影响；（3）评估7种花延迟处理在成熟嫁接树园选 择株上延迟雌花发育中的有效性；（4）确定隔离袋在树冠中的安装位 置（北或南）对延迟雌花芽的有效性的影响；以及（5）确定在早开花 与正常开花亲本克隆之间，在花芽发育的延迟中是否存在差异。

方法：

在本研究中使用的护罩的材料描述在下面的表10中。

表10：在#5研究（2010）中使用的材料

袋子在2009年12月11-16日安装，此时所有花处于阶段1前期 （即芽是明显的，但是尚未如阶段1中那样与主芽分开）。在本研究 中使用的亲本是3株早开花克隆（L、M、N）和3株正常（中季）开 花克隆（O、P、Q）。

结果：

图5图示了花发育试验#5（2010）的结果，其示出了对上面表10 中描述的各种处理的响应。

图5中示出的结果概述在下面的表11中。

表11：花延迟对处理的响应（#5研究）

结果的讨论：

仅有两种被设计将光完全排除在装袋花芽之外的处理：不具孔的 重型铝箔（处理#7）和热狗袋套热狗袋（处理8），产生了可接受用于 研究育种计划和CMP计划的足够水平的花延迟。

在使用具有孔的袋子的处理中，光的渗透造成隔离袋失去其延迟 雌花芽发育的能力。如图5和表11中所示，光通过孔的直接进入或者 甚至过滤通过袋子材料本身的漫射光，使覆盖未发育花芽的隔离袋的 延迟效应无效。对于长时间段来说，即使少量光也可引起花芽在隔离 袋内发育。概括来说，无论使用何种隔离袋材料，如果在长时间段内 允许花芽接受任何光，芽都将在隔离袋内启动发育。

注意到了在克隆和处理之间，在被延迟的花的百分率方面，没有 差异可以归因于延迟处理在树冠中的北或南部位置的放置。还注意到 了在克隆和处理之间，在被延迟的花的百分率方面，没有差异可以与 延迟处理在早开花或者正常开花克隆上的安装相关联。

为了确定延迟处理是否对花的死亡率、小球果发育和种子萌发有 负面影响，使用这些花延迟技术在69株杂交品种上对这些特征进行了 观察。花的死亡率、小球果存活和种子萌发的百分率与正常受控授粉 的花和种子一致（数据未示出）。秧苗在苗圃中生长良好，没有任何 变形或畸形，并且被种植在田间试验中。

总而言之，这些结果证实了使用铝隔离袋延迟雌花发育对随后的 小克隆（clonelet）和克隆发育没有不利影响。种子产率和种子萌发与 其他受控授粉的种子一致。

基于高水平的延迟雌花的有效性、耐用性和低成本，当需要延迟 雌花直至收集到新鲜花粉用于研究育种目的时，#8处理（热狗袋套热 狗袋）隔离袋是优选的处理方法。所述处理对于在CMP操作中应该是 同样有价值的。

例如，可以在一旦可以检测到雌花芽后立即将铝隔离袋施加于枝 条顶端。对于美国南部的火炬松来说，这在春分之前约3周至春分后2 周时。袋子必须将芽和支撑的枝条顶端保持在完全黑暗中，并且不允 许袋子内部的温度升高至显著高于袋子外部的温度。在未装袋花变得 具有可授性或者当花粉已经收集后，可以将袋子取下。

尽管已经对示例性实施方式进行了说明和描述，但应该认识到， 可以在其中做出各种不同改变而不背离本发明的精神和范围。