毛萼乙素环糊精包合物、含有该包合物的药物组合物、其制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种毛萼乙素环糊精包合物、其制备方法及在抗肿瘤方面的应用。本发明所述的一种毛萼乙素环糊精包合物，包括：a)毛萼乙素，和b)环糊精，该包合物指毛萼乙素分子在溶媒介质中进入环糊精分子空腔内部，形成一种比较稳定的、具体优异的溶解性和生物利用度的包合物。所述的毛萼乙素环糊精包合物的制备方法，指称取毛萼乙素，以有机溶媒溶解，过滤，得滤液1；再称取相当于毛萼乙素5-100倍量（w/w）的环糊精，以溶媒溶解，过滤，得滤液2；滤液1加入滤液2中，搅拌混合溶液使环糊精对毛萼乙素进行包合；包合完成后除去溶媒，干燥、粉碎，得毛萼乙素环糊精包合物。本发明对制备得到的毛萼乙素环糊精包合物进行了体内抗肿瘤活性研究，结果表明：这种毛萼乙素环糊精包合物具有显著的抗肿瘤作用。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种毛萼乙素环糊精包合 物、含其的药物组合物及其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

本申请人经过二十多年的深入研究，从民间用作抗肿瘤的唇形科植物毛萼 香茶菜中分离提取得到抗肿瘤有效的单体二萜化合物——毛萼乙素，并对其抗肿 瘤活性进行了深入研究，发现毛萼乙素在抗肿瘤、抗菌等方面具有很好的生物活 性，尤其在抗肿瘤方面，通过大量的体外、体内药理试验，证明毛萼乙素对乳腺 癌、胃癌、白血病等瘤株有显著的抑制作用。毛萼乙素可提高过氧化物的水平， 影响IkBa的磷酸化和降解，阻止NF-kB进核，从而抑制NF-kB信号通路；下调 ERK1/2的磷酸化水平，抑制MAPK信号通路。此外，毛萼乙素能够抑制细胞中 端粒酶的活性，且具有一定的抗新血管生成作用。

但是，毛萼乙素不仅水溶性差，而且也不溶于油中，生物半衰期短，粘膜 透过性差，口服给药生物利用度低。毛萼乙素在水中的饱和溶解度(25℃)仅约为 0.1mg/ml，受pH和缓冲盐影响小；在植物油中的饱和溶解度小于0.5mg/ml；在 无水乙醇、丙二醇、聚乙二醇、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)等可注射溶剂中 的溶解度均小于10mg/ml；仅在二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、吡 啶、氯仿及二氧六环等溶剂中溶解较好；在正辛醇-水体系中的表观油水分配系 数(logPoct)约为2，属水、油均不易溶解之药物。

鉴于毛萼乙素的上述物理性质，选择何种给药途径成为制约毛萼乙素临床 应用的难题。中国专利2009102010026公开了一种毛萼乙素纳米混悬剂，该混悬 剂中包含毛萼乙素、表面活性剂、附加剂和干燥支架剂，但该制剂为非水溶性的 脂质体制剂，只能制成脂质体注射剂，注射给药后，血药浓度依然难以满足临床 用药要求，而且生产成本也较高。中国专利CN101318965A中，公开了毛萼乙 素的三种晶型，这三种晶型相对于毛萼乙素无定型粉末，水溶性有所提高，但其 血药浓度仍然比较低，生物利用度不高，限制了毛萼乙素抑制肿瘤的作用。

众所周知，一个药物在进入体内后，血药浓度在一定的数值范围，才能发 挥正常的治疗作用，浓度低了无效或达不到效果，即由于该药物的溶解性差，阻 碍了其在体内由生物利用度所反映的生物活性和治疗价值。

环糊精（Cyclodextrin，CD）是一种由D-吡喃葡萄糖通过α-(1,4)糖苷键相连 而成的呈环状结构的化合物。其环状结构的内腔具有一定的疏水性，环状结构外 部具有一定的亲水性，可以很好的溶解于水中。水溶性差的非极性药物分子，可 以进入环糊精疏水性的内腔，形成比较稳定的药物/环糊精包合物，这种包合物 可以很好的溶解于水中。所以环糊精在辅助解决非极性药物分子的溶解性方面， 越来越受到重视和应用。

中国专利2009102010026也提及“虽然采用环糊精包合技术、表面活性剂增 溶(胶束)、乳剂、微乳、脂质体及固体分散技术等均可解决一些难溶性药物的溶 解度和溶出度问题，但对水、油均不易溶解的毛萼乙素，这些方法和技术仍具有 较大的局限，而且所用的增溶剂、乳化剂等常带来一些安全问题”。因此，如何 通过简单的方法解决毛萼乙素的水溶性差的问题，并且减少增溶剂、乳化剂的使 用依然是亟待解决的技术问题。

发明内容

针对毛萼乙素水溶性差、生物利用度低的问题，本发明人经过深入研究，发 现可以通过简单的方法制备得到毛萼乙素环糊精包合物，以间接增加毛萼乙素的 水溶解性，提高其生物利用度。发明研究人员提供的一种毛萼乙素环糊精包合物， 该包合物具有很好的水溶性，经过动物体内的抗肿瘤药效学试验表明：这种毛萼 乙素环糊精包合物具有显著的抗肿瘤作用，与毛萼乙素相比，生物利用度大为提 高。

本发明的目的之一是提供一种毛萼乙素环糊精包合物，它的特征是：在溶媒 介质中时，毛萼乙素分子进入环糊精空腔并形成一种结构相对比较稳定的包合 物，大大提高了毛萼乙素的溶解性和生物利用度，充分发挥了其药效作用，从而 有效的抑制了肿细胞瘤的正常生长。这种毛萼乙素环糊精包合物，其基本组成包 括：a)毛萼乙素，和b)环糊精。所述的包合物是在溶媒介质中，使毛萼乙素分 子进入环糊精分子空腔内而形成的包合物。本发明的环糊精选自α-环糊精、β- 环糊精、γ-环糊精和羟丙基-β-环糊精的一种或多种，优选为羟丙基-β-环糊精。 其中毛萼乙素与环糊精的重量配比为1:3～100，优选为1:5～30，更优选1:5～15， 最优选为1:10～15。根据本发明，其中所述的溶媒介质是指可以和水以任意比混 溶的有机溶媒，或者所述有机溶媒与水的混合溶液，有机溶媒选自丙酮、甲醇、 乙醇、丙二醇和丙三醇中的一种或多种，优选为甲醇或乙醇，更优选为乙醇；有 机溶媒与水的体积比为1～99:99～1，优选为5～90:95～10，更优选为10～30:90～70。

本发明提供一种毛萼乙素环糊精包合物的制备方法，该方法包括：将毛萼乙 素用10～500倍量（v/w）的有机溶媒溶解，过滤，得滤液1；再将毛萼乙素5～100 倍量（w/w）的环糊精，以环糊精1～100倍量（v/w）的溶媒溶解，过滤，得滤 液2；滤液1加入滤液2中，搅拌混合溶液使环糊精对毛萼乙素进行包合0.5～20 小时；包合完成后除去溶媒，干燥、粉碎，得毛萼乙素环糊精包合物。其中所述 的溶解毛萼乙素的有机溶媒选自丙酮、甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇的一种或多 种，优选为甲醇、乙醇，更优选为乙醇；有机溶媒的体积与毛萼乙素的质量配比 为10～500:1，优选为50～300:1，更优选为100～200:1。其中所述的环糊精选自α- 环糊精、β-环糊精、γ-环糊精和羟丙基-β-环糊精的一种或多种，优选所述环糊精 为羟丙基-β-环糊精；毛萼乙素与环糊精的重量配比为1:3～100，优选为1:5～30， 更优选1:5～15，最优选1:10～15。其中所述的溶解环糊精的溶媒选自水或者丙酮、 甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇的水溶液，优选为水或者甲醇或乙醇的水溶液；环 糊精的重量与溶媒的体积比为1:1～100，优选为1:3～50，更优选为1:10～20。 其中的水与选自丙酮、甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇的有机溶媒的体积配比为 1～99:99～1，优选为10～90:5～95，更优选为70～50:30～50。本发明的包合时间为 0.5～20小时，优选为1～12小时，更优选为4～8小时。本发明中除去溶媒、干燥 的方法为减压真空干燥、冷冻干燥或喷雾干燥，优化为冷冻干燥。

本发明还提供一种含有毛萼乙素环糊精包合物的药物组合物。该药物组合物 可以通过在毛萼乙素环糊精包合物中加入药用辅料制备而成。

本发明的又一目的是提供上述毛萼乙素环糊精包合物在抗肿瘤方面的应用。 本发明对毛萼乙素环糊精包合物进行了体内抗肿瘤的药理试验，试验结果表明， 这种毛萼乙素环糊精包合物有明显抗肿瘤作用。

本发明的毛萼乙素环糊精包合物，具有良好的稳定性和包封率，能满足制剂 尤其是审批极其严格的注射剂对溶解性的要求，并且能够符合《中国药典》中对 制剂稳定性的要求，又可以节省包合材料，经济实用，工艺简单，生产成本低， 有利于工业化生产。

可以将本发明的毛萼乙素环糊精包合物制备成注射剂，包括注射针剂、静脉 注射液、喷雾粉针或冻干粉针制剂。一般是指无菌水溶性注射针剂和冻干粉针。 对于冻干粉针，其中的药学辅料(赋形剂)可包括低分子右旋糖酐、甘露醇、乳糖、 葡萄糖、蔗糖、氯化钠和山梨醇中的一种或几种。将处方量的毛萼乙素包合物与 辅料按照常规配置处理后，本领域技术人员经过筛选和设置冻干曲线，冷冻干燥 即可完成。

实验证明，本发明的毛萼乙素环糊精包合物具有良好的抗肿瘤活性。

体外试验（毛萼乙素包合物简称EB，实施例1的毛萼乙素包合物简称EB-1， 实施例2的包合物简称EB-2，以此类推)

试验目的

观察受试样品EB对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制 作用及作用强度。

受试物

EB为白色粉末，用0.5%CMC-Na配置成混悬液后使用。

阳性对照药物

丝裂霉素（Mitomycin,MMC）由协和发酵工业株式会社生产（批号 380BHE02）。

剂量设置

EB剂量均为20mg/kg、15mg/kg和10mg/kg。MMC剂量为5mg/kg。

试验动物

BALB/cA裸小鼠，雌性，4-5周龄，体重19±2g，由中国科学院上海药物研 究所提供，生产合格证编号：SCXK（沪）2008-0017。每组动物数：阴性对照组 12只，给药组6只。

细胞株

用人乳腺癌MDA-MB-231细胞株接种裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为 5×10⁶/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传2代后使用。

实验方法

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠 右侧腋窝皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至 100-200mm³后将动物随机分组。EB剂量为20mg/kg、15mg/kg和10mg/kg，均 每天腹腔给药一次，连续给药21天。阳性对照药物MMC5mg/kg组，于实验开 始后第一天、第七天和第十四天，尾静脉注射给药3次。溶剂对照组则给等量生 理盐水。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤 体积(tumor volume,TV)的计算公式为：TV=1/2×a×b²，其中a、b分别表示长、 宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算 公式为：RTV=V_t/V₀。其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每 一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为1）相对肿瘤增殖率T/C(%)， 计算公式如下：T/C(%)=(T_RTV/C_RTV)×100%，T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性 对照组RTV；2）肿瘤体积增长抑制率GI%，计算公式如下： GI%=[1-(TVt-TV₀)/(CVt-CV₀)]×100%，TVt为治疗组每次测量的瘤体积；TV₀为 治疗组分笼给药时所得瘤体积；CVt为对照组每次测量的瘤体积；CV₀为对照组 分笼给药时所得瘤体积；3）瘤重抑制率，计算公式如下：瘤重抑制 率%=(Wc-W_T)/Wc×100%，Wc：对照组瘤重，W_T：治疗组瘤重。

结果与讨论

实验结果如表1-8和图1-3所示。EB20mg/kg组，每天腹腔给药一次，对 人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤有一定的抑制作用，第21天所得T/C百 分数分别为23.87%。第3天有一只小鼠死亡。第4天开始停药。第7天有一只 小鼠死亡。第13天开始给药。第15天有一只小鼠死亡，停药至实验结束。EB 15mg/kg组，每天腹腔给药一次，对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤有显 著的抑制作用，第21天所得T/C百分数分别为28.43%。其中第4天开始停药。 第8天开始给药。第15天停药至实验结束。EB10mg/kg组，每天腹腔给药一次， 对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤无抑制作用，第21天所得T/C百分数 分别为45.78%。其中第17天停药至实验结束。

表1.EB对人乳腺癌MDA-MB-231的实验治疗作用

t student’s test vs溶剂对照组，^*p<0.05，^**p<0.001

EB-120mg/kg组：12月16日（d3）有一只小鼠死亡。12月17日（d4）开始停药。12月20日（d7）有一 只小鼠死亡。12月26日（d13）开始给药。12月28日（d15）有一只小鼠死亡，停药至实验结束。

EB-115mg/kg组：12月17日（d4）开始停药。12月21日（d8）开始给药。12月28日（d15）停药至实 验结束。

EB-110mg/kg组：12月30日（d17）停药至实验结束。

表2.EB-1对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤肿瘤体积的影响

表3.EB-2对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤相对肿瘤体积的影响

注：P value vs溶剂对照

表4.实验治疗中人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤各时间点肿瘤体积的影响

表5.EB-3对人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤鼠体重的影响

表6.EB-3对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的相对肿瘤增殖率

表7.EB-3实验治疗后人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤重

表8.EB对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植瘤的肿瘤体积增长抑制率

附图说明

图1：实施例1毛萼乙素包合物（EB-1）对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植 瘤的生长抑制作用（曲线图）；

图2：实施例3毛萼乙素包合物（EB-3）对人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸小鼠 体重的影响；

图3：实施例3毛萼乙素包合物（EB-3）对人乳腺癌MDA-MB-231裸小鼠移植 瘤生长抑制作用；

图4：实施例1毛萼乙素羟丙基-β-环糊精包合物粉末X-衍射图谱；

图5：毛萼乙素、羟丙基-β-环糊精物理混合物粉末X-衍射图谱；

图6：毛萼乙素粉末X-衍射图谱；

图7：羟丙基-β-环糊精粉末X-衍射图谱。

具体制备实施方案

实施例1

称取毛萼乙素10g，以100ml乙醇溶解，过滤，得滤液1；再称取200g羟丙 基-β-环糊精，用4000ml水溶解，过滤，得滤液2；滤液1加入滤液2中，搅拌 包合12小时；包合溶液过滤后冷冻干燥，得毛萼乙素羟丙基-β-环糊精包合物粉 末200.3g。该包合物具有比毛萼乙素优异的水溶性，室温下在1ml水中的溶解度 为210mg的包合物（其中含毛萼乙素为10.5mg），而纯的毛萼乙素几乎不溶解于 水。同时，该包合物具有如图4的粉末X-衍射图谱，图5为毛萼乙素与羟丙基 -β-环糊精混合物的粉末X-衍射图谱，图6为毛萼乙素的粉末X-衍射图谱，图7 为羟丙基-β-环糊精的粉末X-衍射图谱。

实施例2

称取毛萼乙素1g，以100ml乙醇溶解，过滤，得滤液1；再称取15g羟丙基 -β-环糊精，用400ml20%乙醇溶解，过滤，得滤液2；滤液1加入滤液2中，搅 拌包合16小时；包合溶液过滤后冷冻干燥，得毛萼乙素羟丙基-β-环糊精包合物 粉末16.2g。该包合物室温下在1ml水中的溶解度为220mg的包合物（其中含毛 萼乙素为10.7mg）。

实施例3

称取毛萼乙素1g，以100ml乙醇溶解，过滤，得滤液1；再称取12g羟丙基 -β-环糊精，用500ml10%乙醇溶解，过滤，得滤液2；滤液1加入滤液2中，搅 拌包合13小时；包合溶液过滤后冷冻干燥，得毛萼乙素羟丙基-β-环糊精包合物 粉末12.5g。该包合物室温下在1ml水中的溶解度为205mg的包合物（其中含毛 萼乙素为10.4mg）。

实施例4

称取毛萼乙素1g，以100ml乙醇溶解，过滤，得滤液1；再称取55gβ-环糊 精，用500ml5%乙醇溶解，过滤，得滤液2；滤液1加入滤液2中，搅拌包合 13小时；包合溶液过滤后冷冻干燥，得毛萼乙素羟丙基-β-环糊精包合物粉末 55.4g。该包合物室温下在1ml水中的溶解度为195mg的包合物（其中含毛萼乙 素为9.4mg）。

实施例5

将75g实施例1制备的毛萼乙素环糊精包合物溶解在100ml水中，于55±2℃ 条件下搅拌45分钟，加入8g甘露醇，溶解，调节pH至7.0，加注射用水至400ml， 加入活性炭0.08g，加热至50℃，搅拌30min，过滤脱炭，经0.22μm微孔滤膜， 滤过，检测检品含量，计算装量，分装，冷冻干燥即得毛萼乙素环糊精包合物冻 干粉针剂。冻干粉针剂经过6个月的稳定性考察，其稳定性符合药典要求。

实施例6

将75g实施例1制备的毛萼乙素环糊精包合物溶解在100ml水中，于55±2℃ 条件下搅拌45分钟，调节pH至7.0，加注射用水至400ml，加入活性炭0.08g， 加热至50℃，搅拌30min，过滤脱炭，经0.22μm微孔滤膜，滤过，检测中检品 含量，计算装量，灌封于安培瓶中，115℃热压灭菌30min，即得，可供肌肉注 射或加葡萄糖静脉注射。