利用基因芯片结合Real time PCR筛选的烟草内参基因及其方法

摘要

本发明公开了一种利用基因芯片结合Real time PCR筛选的烟草内参基因及其方法，应用本发明的方法，筛选得到烟草新的内参基因烟草磷酸核酮糖激酶基因和烟草双半乳糖二酰甘油合酶基因，其中磷酸核酮糖激酶基因的稳定性高于目前所有报道的烟草内参基因，而烟草双半乳糖二酰甘油合酶基因的稳定性仅次于目前报道烟草内参基因EF-1-a。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是利用基因芯片结合Real time PCR筛选 烟草内参的方法及应用。

背景技术

利用real time PCR分析基因表达水平是现在分子生物学中重要的研究手段，而 此项技术实施的关键是选择合适的内参，因此内参的选择一直都是研究者关注的热点。 传统的内参基因的确定都是先经过文献检索、预测，然后通过实验验证基因之间相对的 稳定性，具有很大的局限性。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用基因芯片结合 Real time PCR筛选烟草内参的方法及应用。

本发明的技术方案如下：

一种在全基因组水平上筛选内参基因的方法，该方法包括以下2个步骤：

首先利用NimbleGen双通道基因芯片分析栽培品种K326的3个部位根、茎、叶， 每个部位6个时期，以及花的3个时期，共21个样本的基因的表达量，利用geNorm（3.5） 计算出每个基因在21个样本中的变异系数，表征其稳定性，变异系数小于目前应用的 内参的基因作为内参的候选基因。

利用Real time PCR验证芯片杂交的结果，即用Real time PCR验证烟草3个部位 根、茎、叶，每个部位6个时期，以及花的3个时期，共21个样本的基因的表达量， 利用geNorm（3.5）计算出每个基因在21个样本中的变异系数，表征其稳定性，变异系 数小于目前应用的内参的基因作为新筛选的烟草内参。

应用上述方法，筛选得到烟草新的内参基因烟草磷酸核酮糖激酶基因和烟草双半 乳糖二酰甘油合酶基因，其中磷酸核酮糖激酶基因的稳定性高于目前所有报道的烟草内 参基因，而烟草双半乳糖二酰甘油合酶基因的稳定性仅次于目前报道烟草内参基因 EF-1-a。

附图说明

图1中1～21分别为Gene3基因在21个组织中的扩增情况；

图2中1～21分别为Gene5基因在21个组织中的扩增情况；

图3中1～21分别为Gene6基因在21个组织中的扩增情况；

图4中1～21分别为Gene7基因在21个组织中的扩增情况；

图5中1～21分别为Gene8基因在21个组织中的扩增情况；

图6中1～21分别为Gene9基因在21个组织中的扩增情况；

图7中1～21分别为Gene12基因在21个组织中的扩增情况；

图8中1～21分别为Gene13基因在21个组织中的扩增情况；

图9中1～21分别为Gene14基因在21个组织中的扩增情况；

图10中1～21分别为Gene15基因在21个组织中的扩增情况；

图11中1～21分别为Gene16基因在21个组织中的扩增情况；

图12中1～21分别为Gene17基因在21个组织中的扩增情况；

图13中1～21分别为Gene18基因在21个组织中的扩增情况；

图14中1～21分别为Gene19基因在21个组织中的扩增情况；

图15中1～21分别为Gene20基因在21个组织中的扩增情况；

图16中1～21分别为Gene21基因在21个组织中的扩增情况；

图17中1～21分别为Gene22基因在21个组织中的扩增情况；

Marker TaKaRaDL2000，条带大小：从下往上100bp,250bp,500bp,750bp, 1000bp,2000bp。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1试验取样

1.1实验材料：烟草栽培品种K326

1.2实验取材：根、茎、叶分别于移栽时、移栽后20天，40天，60天，70天（打 顶后10天），100天（打顶后40天）取烟草的叶片、茎和根。烟草的花分别于现蕾、现 蕾后5天、现蕾后10天进行取样，所有收获的组织立即在液氮中冷冻并储存于-80℃直 至使用。

2芯片杂交

2.1实验主要技术流程如下：

（1）用Trizol法提取烟草样品的总RNA;

（2）反转录合成单链cDNA;

（3）荧光标记及标记cDNA的纯化;

（4）芯片杂交;

（5）芯片清洗和扫描;

（6）数据的采集与分析;

3数据处理

首先用NImbleGen官方软件NimbleScan2.6进行数据提取，得到原始.Pair文件，将 图像信号转换为数字信号，然后用RobustMutichipAnalysis(RMA)算法得到归一化和背 景扣除，得到每个基因归一化后的信号值。

利用geNorm（3.5）计算出每个基因在21个样本中的变异系数，表征其稳定性，变 异系数小于目前应用的内参的基因作为内参的候选基因。共得到14个候选基因，其变 异系数小于目前使用的烟草内参（Gene21和Gene22），所有基因的变异系数和序列如 下：

表1候选内参基因和目前使用内参的变异系数

Gene geNorm Gnen3 0.90716 Gnen5 0.872182 Gnen6 0.805497 Gnen7 0.42937 Gnen8 0.983199 Gnen9 0.944466 Gnen13 0.71579 Gnen14 0.720343 Gnen15 0.777146 Gnen16 0.91013 Gnen17 0.931 Gnen18 0.874 Gnen19 0.991 Gnen20 0.979 Gene21（EF-1-a） 1.0095 Gnen22（L25ribosomal protein） 0.9962

表1中所列Gnen3-Gnen20序列见序列表，同时增加烟草已经报道内参（Gene21 >AF120093，Gene22>L18908）作为对照，序列见序列表所示。

4RealTime RT-PCR验证

4.1引物设计

根据每个基因的序列设计引物进行初步验证，其中1,2,4,10,115个基因未得到克隆 产物，其余基因均得到理想克隆片段（图1-17），每个基因的引物如下：

表2

Gene   Primer Sequence5'→3' Gene3 F TTAGGCATCCTTTCCCTCCT   R CAATACTGCAGCCATAGTGC Gene5 F GTCTCAATAACCGGAAGAGC   R CTAACAACACCAAGCCCACC Gene6 F TTGGTGGATCTGACCTAGTG   R ATGGTGTGAAAGAGCGTTCG Gene7 F AGCACTAGGCATTGCCATTG   R ATGGCACTCTTGATGGGTTC Gene8 F TCTCAGGACACGCCAATATC   R TAGGTTGAGTTCCGCTTCAC Gene9 F GAGGAGGCGCAACATTACAG   R GGCAGGATCATAACCAAGAC Gene12 F ATGGACTCGAATCCGAGTTG   R ATTACGTCTTTTGCCGGACC Gene13 F TCCGGATGGACTAGCAGAAG   R GGAACGCATAAGCAAGTCCA Gene14 F GATATGAGCCAACTCGACTG   R AAGACATCGAGCTGTGAGTG Gene15 F CCTGACTCTAGGTGGCATGT   R TCCAACCACTGACGGACACA Gene16 F GCTTGAGTAGCCTTTGAGAG   R ACTCACACTGTGCTCATTCA Gene17 F TTGAGGCATTGGAGAGTGAG   R CTCCACTTTTCTCAAGCCCA

Gene18 F CACCTATAGTCCGACTTCTG   R GCACGATGCTGAATTGAGAG Gene19 F GTGATACTGGTGGTGGTCAT   R AGTGTATCCACCGAGGTGAC Gene20 F TCAACCGCCACCTCTTCAAT   R TCAACAGCTCGAGATCTACG Gene21 F CAAGCGGTCATTCAAGTATGC   R TGTCCAGGACGATCAATCACA Gene22 F TTGAGGACAACAACACCCTTG   R TGCTTTCTTCGTCCCATCAG

利用geNorm（3.5）计算出每个基因在21个样本中的变异系数，表征其稳定性，所 有基因的变异系数如下表：

表3

Gene geNorm Gnen3 2.210 Gnen5 0.972 Gnen6 0.915 Gnen7 0.509 Gnen8 1.083 Gnen9 4.144 Gnen13 1.281 Gnen14 1.171 Gnen15 0.830 Gnen16 2.010 Gnen17 1.041

Gnen18 1.760 Gnen19 1.535 Gnen20 2.169 Gene21（EF-1-a） 0.855 Gnen22（L25ribosomalprotein） 0.578

变异系数小于目前应用的内参的基因作为新筛选的烟草内参。应用上述方法，筛选 得到烟草新的内参基因烟草磷酸核酮糖激酶基因（gene7）和烟草双半乳糖二酰甘油合 酶基因（gene15），其中磷酸核酮糖激酶基因的稳定性高于目前所有报道的烟草内参基 因，而烟草双半乳糖二酰甘油合酶基因的稳定性仅次于目前报道烟草内参基因EF-1-a。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。