一种用于细胞富集与提取的微流体生物芯片

摘要

一种用于细胞富集与提取的微流体生物芯片，由盖片层和置于盖片层下的载片组成；盖片层上开设有加液区、和加液区连通的富集通道以及与富集通道连通的目标细胞收集区和剩余液体排液区；富集通道的一侧为平直壁面，另一侧带有向富集通道内凸出的尖角结构或其它内凸型结构，富集通道尾部为二分叉结构，用于与目标细胞收集区和剩余液体排液区连通；加液区、目标细胞收集区和剩余液体排液区为在盖片层上开设的通孔，富集通道为在盖片层上开设的盲道，底部和载片表面相通；本发明的生物芯片可以高效地实现目标细胞的富集与提取，具有结构简单，操作方便，低能耗，无污染，成本低，便于携带和推广等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物芯片，具体涉及一种用于细胞富集与提取的微流体生 物芯片。

背景技术

微流体生物芯片诞生于20世纪末，近年来发展迅速，成为一种有效的检测 手段，并被广泛应用于医学、生物等领域。它体现了将分析实验室的功能转移 到微型芯片上的思想，具有便携性和高度集成性。鉴于长期以来微流体生物芯 片相关技术富有成就性地发展，美国科学促进会将微流体生物芯片评选为1998 年的十大科技突破之一，认为微流体生物芯片技术将是继大规模集成电路之后 的又一次具有深远意义的科学技术革命。微流体生物芯片是利用微加工技术，在 硅、玻璃、塑料等基片上刻蚀出预先设计的微通道和其它功能单元，然后用盖 片将其封闭，通过不同的通道网络、反应器、检测单元等组成部件的设计和布 局，以实现集微量样品的制备、进样、反应、分离、检测等功能于一体的快速、 高效、低能耗的微型实验装置。微流体生物芯片在高效快速的分离、灵活性的 设计和多功能单元集成等方面的潜力引人注目，成为当今的研究热点之一。

最近几年，大批学者尝试利用微流体生物芯片对微纳米生物分子和细胞进 行富集与提取。生物分子（如蛋白质、核酸、抗原和抗体）或细胞的富集与提 取在生物医学、食品与环境监测等领域有重要作用，如疾病诊断、食品安全检 测和水质监测等。在生物医学的研究中，首先需要将目标细胞从全血中富集并 提取出来，以便排除其他细胞或微粒的干扰。例如对癌症的诊断和治疗中，需 要将恶性肿瘤细胞（俗称癌细胞）从血液中进行有效的富集与提取。癌细胞在 发病晚期会产生转移，由初始病灶区脱离并进入血液循环系统，而后依附于另 一个器官或组织，形成新的癌症发病点，但是在癌细胞扩散期，血液中的癌细 胞含量只占到血液细胞总量的亿分之一，相当于一毫升血液中最多只有一个癌 细胞，因此将转移期血液中极低浓度的癌细胞进行有效的富集与提取，对癌症 的监测治疗和病情的预估有着重要的意义。另一方面，癌细胞的富集与提取， 可以用于对用药前后血液中癌细胞的浓度水平进行检测和对比，对抗癌药效和 治疗效果的评估意义重大。

传统的用于细胞富集与提取的设备，按照原理不同，主要分为离心力富集、 介电力富集、速度沉降富集、固相萃取和声波表面富集。目前被广泛采用的是 离心力富集，如干细胞处理系统，它是基于不同种类细胞的密度差异，在离心 力的作用下将目标细胞进行有效的富集和提取。其细胞提取物包括造血干细胞、 红细胞、血浆、血小板等，为下一步的临床诊断或科学研究奠定基础。介电力 细胞富集，是利用不同细胞的介电常数差异，在外加电场作用下实现目标细胞 的富集与提取，其结构较离心式细胞富集提取设备简单，但无法排除极化现象 对细胞的影响。此外，电场强弱、流体粘度、细胞尺寸和电特性都会对介电力 细胞富集与提取效果产生影响，因而难于广泛推广应用。速度沉降富集基于细 胞尺寸的差异，使不同细胞在具有十分平缓的密度梯度的介质中以不同的速度 沉降而达到富集与提取的目的。需要指出的是，此种方法富集不同目标细胞时， 需要不同密度的沉降介质从而保证目标细胞在沉降介质中发生有效沉降。此外， 速度沉降细胞提取十分缓慢，不便应用于细胞快速分析场合。其余诸如固相萃 取、表面声波富集等尚处于理论研究阶段，鲜见有实际应用与推广。由于传统 细胞提取设备一般都需要如电机、流量控制阀、特制的流动闭合回路等精密元 件，制造难度较大，机构异常复杂。而且价格昂贵，不利于医疗技术的快速进 步，有悖于家庭医疗和个人保健等先进的健康理念。

传统的细胞富集与提取设备主要存在以下问题：

1）体积庞大，不便携带；

2）需要外加动力，耗能高；

3）流量需要精确控制，容易受各种因素影响；

4）组件多，结构复杂，如需要电机、流量控制装置等精密元器件，生产 制造较为困难；

5）单台设备价格昂贵，不利于在基层医疗机构中的推广和使用。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于细胞 富集与提取的微流体生物芯片，能对细胞进行高效富集与提取，也可用于血浆 的萃取，具有操作方便、结构简单、成本低、精度高、便于携带等优点，具有 很好的应用前景。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于细胞富集与提取的微流体生物芯片，所述微流体生物芯片由盖片 层5和置于盖片层5下的载片6组成；所述盖片层5上开设有加液区1、和加液 区1连通的富集通道2以及与富集通道2连通的目标细胞收集区4和剩余液体 排液区3；所述富集通道2的一侧为平直壁面，另一侧带有向富集通道2内凸出 的尖角结构或其它内凸型结构，所述富集通道2尾部为二分叉结构，用于与目 标细胞收集区4和剩余液体排液区3连通；所述加液区1、目标细胞收集区4和 剩余液体排液区3为在盖片层5上开设的通孔，所述富集通道2为在盖片层5 上开设的盲道，底部和载片6表面相通。

所述盖片层5和载片6通过等离子不可逆处理结合在一起。

所述富集通道2位于盖片层5和载片6相结合处的中央位置。

所述加液区1、目标细胞收集区4和剩余液体排液区3均为圆柱形孔。

所述富集通道2内凸出的尖角结构为80个。

还包括用于使细胞产生流动动力的手动挤压塞7，所述手动挤压塞7包括和 加液区1形状相适配的柱体7-1，设置在柱体7-1一端的挤压头7-2，在所述柱 体7-1上和挤压头7-2接触处套有密封圈7-3。

所述柱体7-1采用PDMS或其它软质材料。

所述柱体7-1底部为斜面。

所述盖片层5的材料为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。

所述载片6的材料为玻璃或硅。

本发明和现有技术相比较，具有如下优点：

1）、体积小，结构简单，便于携带，操作方便。采用简单的手动挤压或动 力驱动等方式进行样本加注，方便地进行目标细胞的采集，适合在中小型医疗 机构与科研院所使用，具有极大的应用价值与市场前景。配置的手动挤压塞， 可以高效方便地将生物样本挤压进入微通道中。

2）、精度高，适用性广。本发明中一系列的尖角结构引发的惯性离心作用， 可以将各类目标细胞进行精确地富集与提取。与其他的微流体细胞富集和提取 技术相比，本发明的生物芯片中的细胞富集对流量不敏感，极大的增加了该通 道的适用性。

3）、不对目标提取物产生污染，本发明中用于细胞富集的微通道与外界环 境不直接接触，避免了富集过程中生物样本的污染。

4）、效率高，耗时少。本发明便于临床应用，方便快速做出诊断。

5）、成本低，制作容易。与其他传统及微流体细胞富集与提取技术相比， 无需复杂的结构和昂贵的辅助设备，因而本发明适合于大规模生产和市场推广。

附图说明

图1为用于细胞富集与提取的微流体生物芯片俯视图。

图2为图1沿A-A向的剖视图。

图3为图1沿B-B向的剖视图。

图4为用于细胞富集与提取的微流体生物芯片的三维示意图。

图5为手动挤压塞的三维示意图。

图6为本发明对颗粒的富集与提取实验结果图，其中图6a为不同流量下通 道出口颗粒运动轨迹，图6b为不同流量下颗粒位置的统计结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

如图1至图4所示，本发明一种用于细胞富集与提取的微流体生物芯片， 该生物芯片由标准软光刻技术加工，由盖片层5和置于盖片层5下的载片6组 成；盖片层5上开设有加液区1、和加液区1连通的富集通道2以及与富集通道 2连通的目标细胞收集区4和剩余液体排液区3；富集通道2的一侧为平直壁面， 另一侧带有向富集通道2内凸出的尖角结构或其它内凸型结构，富集通道2尾 部为二分叉结构，用于与目标细胞收集区4和剩余液体排液区3连通；加液区1、 目标细胞收集区4和剩余液体排液区3为在盖片层5上开设的通孔，富集通道2 为在盖片层5上开设的盲道，底部和载片6表面相通。本实施例加液区1腔体 直径为10mm，高度与盖片层5高度一致。加液区1、富集通道2、目标细胞收 集区4和剩余液体排液区3形成的微通道位于盖片层5与载片6相结合的中央 位置，宽度为80μm，深度为50μm，设计总长约为16.6mm。包括80个位于通 道一侧的尖角结构，尖角为45度，尖角结构宽度和长度约在40-45μm，相邻尖 角距离约为120μm。

作为本发明的优选实施方式，本发明中微流体生物芯片使用标准软光刻技 术加工，所述盖片层5和载片6通过等离子不可逆处理结合在一起。也可以使 用其他材料或方法加工本发明的微通道。

作为本发明的优选实施方式，所述加液区1、目标细胞收集区4和剩余液体 排液区3均为圆柱形孔。则相应的，所述手动挤压塞7的柱体7-1也为圆柱体。

作为本发明的优选实施方式，所述富集通道2内凸出的尖角结构为80个。

作为本发明的优选实施方式，如图5所示，还包括用于使细胞产生流动动 力的手动挤压塞7，所述手动挤压塞7包括和加液区1形状相适配的柱体7-1， 设置在柱体7-1一端的挤压头7-2，在所述柱体7-1上和挤压头7-2接触处套有 密封圈7-3。手动挤压塞7于加液腔上方施加，且和加液区圆柱面内部紧密配合， 防止配合面存在缝隙而导致的密封问题。手动挤压塞7设计高度需保证待测液 体被完全挤压至微通道中，从而使目标细胞被完全地富集与提取，本实施例柱 体7-1直径为10mm，塞体上端附有一内径为10mm的环形密封圈7-3，该密封 圈由弹性极高的材料制备，可以绝对避免生物样本在受挤压过程中发生外溢。 也可通过人力或其他设备（如注射泵）驱动的注射器注入生物样本。

作为本发明进一步的优选实施方式，所述柱体7-1采用PDMS或其它软质 材料。

作为本发明进一步的优选实施方式，所述柱体7-1底部为斜面，使加液时 生物芯片中形成较为平稳的流动，同时防止样本液外溢。

所述柱体7-1采用PDMS或其它软质材料。

所述柱体7-1底部为斜面。

作为本发明的优选实施方式，所述盖片层5的材料为聚甲基丙烯酸甲酯 PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。

作为本发明的优选实施方式，所述载片6的材料为玻璃或硅。

下面以实施例说明本发明的实施过程：

癌细胞的富集与提取具体操作如下，首先采集病人血液，而后将待处理血 液加注到加液区1内，手动挤压塞7置于加液区1上，且保证密封圈7-3作用， 防止血液外溢。按压挤压头7-2从而施压于加液区1中的血液，使血液流入富 集通道2，当血液中的癌细胞流经富集通道2的尖角结构时，会受到尖角结构引 发的惯性离心力，该力与流量正相关，使细胞趋向于平直壁面一侧。每经过一 个尖角结构，癌细胞会在远离尖角的方向上产生一个位移，经过80个相同的尖 角结构后，由于累积效应，所有癌细胞将被挤压在平直壁面一侧，并进入细胞 收集区4。通过移液枪等手段将高浓度的癌细胞从细胞收集区4中提取出来， 用于后续的检测和诊断。如癌细胞一次富集浓度不满足后续检测的需要，可以 使之多次通过本发明的生物芯片，以不断地实现癌细胞的富集，从而提高癌细 胞的富集浓度。另外，也可以使用手动或其他驱动设备（如注射泵）驱动的注 射器来将病人的血液注入微通道中，以实现癌细胞的富集与提取。

为验证本发明的富集过程对流量不敏感，从而证明手动挤压塞使用的可行 性，使用本发明对直径为9.94微米的荧光聚苯乙烯颗粒（尺寸与血细胞相当） 进行了富集实验验证。将颗粒溶于去离子水中，并采用可以精确控制流量的注 射泵来注入颗粒液，利用荧光显微镜和CCD摄相机跟踪拍摄颗粒群轨迹。实验 证明本发明在流量为300微升每分钟到700微升每分钟的范围内，可以将颗粒 完全地富集在平直壁面一侧。图6中：（a）在不同流量下的颗粒富集现象图；（b） 不同流量下，通道出口处的颗粒的荧光强度分布曲线。实验验证了本发明在目 标物富集过程中对流量不敏感，具有广泛地适用性。因此手动挤压塞的应用完 全能够满足对目标物富集过程中对流量的要求。