油菜籽饼源金属螯合肽、肽金属螯合物的制备方法及用途

摘要

本发明属于油菜籽饼副产物深加工技术领域，具体是涉及一种油菜籽饼源金属螯合肽、肽金属螯合物的制备方法及用途。油菜籽饼依次采用乙醇和水浸泡、清洗、固液分离保留滤饼，得到油菜籽蛋白粗品；向油菜籽蛋白粗品中加入水，调节pH值，再加入蛋白酶水解反应，再将反应液置于沸水中煮，进行灭酶，获得水解液；或者再加入蛋白酶水解反应，再将反应液置于高压锅内高压处理，获得水解度更高的水解液；将水解液离心，上清液经干燥得金属螯合肽的粗品粉末。本发明制备的金属螯合肽可直接用做天然的抗氧化剂来使用，减缓衰老。此外还可用于制备肽金属螯合物的优良母体，能够与不同的微量元素螯合，制备成用于补充机体对营养元素缺乏症状的微量金属螯合剂。

说明书

技术领域

本发明属于油菜籽饼副产物深加工技术领域，具体是涉及一种油菜籽饼源 金属螯合肽、肽金属螯合物的制备方法及用途。

背景技术

金属螯合肽(Metal chelating peptide)是指能够螯合金属离子的生物活 性肽类。金属离子如铜、锌、铁等广泛存在于机体的器官和组织内。当机体内 存在过量的金属离子时，容易导致活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的 产生，进而损伤机体内的生物大分子，产生一些退行性疾病，如心脑血管疾病、 胃肠炎症和癌症等。金属螯合肽本身能够螯合机体内游离的金属离子，起到抑 制或降低体内活性氧致氧化损伤的作用。此外，许多微量金属元素是机体代谢 用酶的重要组成部分，当机体内微量金属元素不足时，也会产生一系列疾病。 例如，缺锌时，会影响机体内的DNA聚合酶、RNA合成酶和超氧化物歧化酶等 的合成及转化，对人体的生长发育产生不利影响。

金属螯合肽能够通过与金属离子发生螯合作用，制备形成肽金属螯合物 (Peptide-metal chelator)。该螯合物被称为第四代微量元素补充剂，它是相 对于第一代以无机盐类添加剂，如硫酸铜、硫酸锌等，第二代以简单的有机酸 盐，如葡萄糖酸锌、富马酸亚铁等，第三代氨基酸微量元素螯合盐来说的。

肽金属螯合物，可以通过肽的吸收途径转运进入机体内。肽的吸收具有速 率快、路径多和与氨基酸无竞争性的优点。因而，螯合物能够显著地提高微量 金属元素的生物利用率，并有效地达到补充机体所需微量元素的目的。目前， 关于金属螯合肽及其螯合物的研究是科学家们广泛关注的热点，尤其是具有优 异的金属螯合能力的活性肽的制备，更是该领域研究的重点。

菜籽饼是油菜籽榨油后的副产物，其中含有30％～50％的蛋白质，目前，关 于蛋白提取的方法较多，例如，在中国专利CN1962671A和CN102296099中公布 了碱溶酸提法提取菜籽蛋白的方法，在CN200510056753.5中，公布了先后用水 和乙醇制备菜籽蛋白的方法。此外，还有制备第三代微量元素螯合物的方法， 如在CN1115311A中，申请者将菜籽饼进行水解、中和和螯合反应，制备出氨基 酸及氨基酸螯合物。

可见，以菜籽饼加工副产物中的蛋白资源为原料，进行精深加工，制备肽 金属螯合物，可以进一步解决高值化利用菜籽饼副产物的问题，制备出高效的 微量元素补充剂。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的之一在于提供一种油菜籽 饼源金属螯合肽。

为了实现该目的，本发明所采用的技术方案是：一种油菜籽饼源金属螯合 肽的制备方法，步骤如下：

①、油菜籽饼依次采用乙醇和水浸泡、清洗，固液分离保留滤饼，得到油 菜籽蛋白粗品；

②、按料液重量比为1∶2～1∶30向油菜籽蛋白粗品中加入水，调节pH值至 1.5～10.0；

③、按蛋白酶与底物重量比为1∶200～1∶20再加入蛋白酶，调节温度至37～ 60℃，进行水解反应0.5～6h，再将反应液置于沸水中煮5～10min，进行灭 酶，获得水解液；

或者；

按蛋白酶与底物重量比为1∶200～1∶20再加入蛋白酶，调节温度至37～60 ℃，进行水解反应0.5～6h，再将反应液置于沸水中煮5～10min，进行灭酶， 然后置于高压锅内于121℃高压处理2～20min，获得水解度更高的水解液；

④、将水解液离心去除残渣，获得的上清液经干燥制得金属螯合肽的粗品 粉末。

优选的，油菜籽蛋白粗品的制备方法为：先将油菜籽饼粉碎成细粉，4～60 ℃温度条件下，按料液重量比为1∶5～1∶50将该细粉先经体积百分比为60～90％ 的乙醇水溶液搅拌浸泡1～48h，期间每隔一段时间更换液体，直至过滤后的 液体颜色无棕色或黄色为止；去除上清液，将沉淀物采用至少5倍体积的清水 进行清洗，然后过滤，直至过滤后的清水无棕色或黄色为止，进而得到呈褐色 或浅黄色的油菜籽蛋白粗品。

优选的，水解反应用蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、风味蛋白酶、 Alcalase酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种的复配。

优选的，干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。

进一步的，油菜籽饼源金属螯合肽的制备方法还包括将制得的金属螯合肽 粗品粉末通过金属螯合填料进一步进行分离获得高纯度金属螯合肽的步骤，金 属螯合填料采用亲和琼脂糖填料。

优选的，所述亲和琼脂糖填料包括螯合琼脂糖凝胶FF、高效亲和琼脂糖凝 胶(IMAC sepharose high performance)、琼脂糖亲和介质(Ni-IDA QZT6FF 和Ni-NTA QZT6FF)、金属镍螯合琼脂糖凝胶6FF(Ni sepharose6fast flow)。

该金属螯合肽粗品(或高纯度金属螯合肽)具有螯合Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、 Cu²⁺离子的能力，从而制备肽金属螯合物，螯合能力为4.6％～96.39％，是同质 量还原型谷胱甘肽的0.62～10.19倍。螯合时金属螯合肽与金属元素之间的料 液重量比为1∶10～10∶1，反应pH值为1.5～10，反应温度为4～80℃，反应 时间1～480min。

Ca²⁺离子采用CaCl₂或(和)CaSO₄作为离子源；Fe²⁺采用FeCl₂或(和) FeSO₄·7H₂O作为离子源；Fe³⁺采用FeCl₃·6H₂O或(和)Fe₂(SO4)₃作为离子源； Zn²⁺采用ZnSO₄·7H₂O或(和)ZnCl₂作为离子源；Cu²⁺离子采用CuCl₂·2H₂O或(和) CuSO₄·5H₂O作为离子源。

本发明制备的金属螯合肽可直接用做天然的抗氧化剂来使用，减缓衰老， 此外，还可用于制备肽金属螯合物的优良母体，能够与不同的微量元素螯合， 制备成微量金属螯合剂，用于补充机体对营养元素缺乏症状。

附图说明

图1是IMAC-Zn²⁺分离菜籽蛋白水解物图谱。

具体实施方式

以下将结合实施例，对本发明进行进一步、详细的说明，所有原料均购自 于市场或依现有技术制备。

实施例1：

采用高速粉碎机，将菜籽饼进行粉碎处理，取500g原料，添加75％(体 积百分比)的乙醇水溶液3L，搅拌浸泡24h，期间每隔6h换一次液体。过 滤后，将沉淀物采用3L清水进行清洗再过滤，干燥后，获得浅褐色的油菜籽 蛋白粗品。蛋白粗品平均得率为21.46％。

实施例2：

取4g菜籽粗蛋白，添加100ml去离子水，采用1mol/L的NaOH溶液调 节pH至8.0，添加0.08g Alcalase酶，将反应混合液于55℃进行酶解反应， 期间每隔15min采用1mol/L的NaOH溶液调节pH，使反应体系维持在pH为8.0。 反应时间达到4h时，将反应液于沸水浴灭酶，随后，再将蛋白水解液置于高 压锅内，于121℃高压处理10min，得水解液。

获得的高压处理水解液经过冷冻干燥处理，获得金属螯合肽粗品粉末。采 用TNBS法检测4h时水解液的水解度为22.31％。当肽浓度为5mg/ml时，采 用EDTA滴定法检测其Zn²⁺平均螯合率为84.36％。

实施例3：

取4g菜籽粗蛋白，添加100ml去离子水，采用1mol/L的NaOH溶液调 节pH至7.0，添加0.08g木瓜蛋白酶，将反应混合液于60℃进行酶解反应， 期间每隔15min采用1mol/L的NaOH溶液调节pH，使反应体系维持在pH为7.0。 反应时间达到1h时，将水解液于沸水中，灭酶处理10min。

获得的水解液经过冷冻干燥处理，获得金属螯合肽粗品粉末。采用TNBS 法检测1h时水解液的水解度为20.82％。当肽浓度为5mg/ml时，采用EDTA 滴定法检测其Zn²⁺平均螯合率为29.79％。

实施例4：

取4g菜籽粗蛋白，添加100ml去离子水，采用1mol/L的HCl溶液调节 pH至1.5，添加0.08g胃蛋白酶，将反应混合液于37℃进行酶解反应，期间 每隔15min采用1mol/L的HCl溶液调节pH，使反应体系维持在pH为1.5。反 应时间达到2h时，将水解液于沸水中，灭酶处理10min。

获得的水解液经过冷冻干燥处理，获得金属螯合肽粗品粉末。采用TNBS 法检测2h时水解液的水解度为15.77％。当肽浓度为5mg/ml时，采用EDTA 滴定法检测其Zn²⁺平均螯合率为43.02％。

实施例5：

取Alcalase酶制备的金属螯合肽粉末4g，添加100ml去离子水，调节pH 值到8.0，将该肽溶液于121℃高压处理10min，获得的水解液的水解度平均 为33.71％，Zn²⁺平均螯合率为91.36％。

实施例6：

IMAC-Zn²⁺层析柱制备：

(1)将25ml琼脂糖亲和介质(Ni-IDA QZT6FF)填料装柱后，用100ml 去离子水进行淋洗层析柱，然后再用250ml20mM PBS(含0.1M NaCl和50mM  EDTA，pH7.4)进行淋洗，之后再分别用250ml20mM PBS(含0.1M NaCl， pH7.4)和250ml去离子水清洗柱子，以去除残留的EDTA。

(2)采用0.2M ZnCl₂溶液250ml淋洗柱子，使Zn²⁺能与填料上的基团结 合，之后再用250ml去离子水清洗层析柱，去除游离的Zn²⁺离子，制成IMAC-Zn²⁺层析柱。

柱层析过程：取Alcalase酶制备的金属螯合肽粗品粉末200mg，采用1ml 的20mM PBS(含0.1M NaCl，pH7.4)溶解，之后用0.45μm水系滤膜过滤， 将过滤液上IMAC-Zn²⁺层析柱进行层析分离。

柱层析条件为：柱体积：45ml；流速1ml/min；检测波长220nm；0-90min， 平衡缓冲液20mM PBS(含0.1M NaCl，pH7.4)；90-180min，洗脱缓冲液20 mM PBS(含0.1M NaCl，pH3.5)。

洗脱图谱结果请参阅图1：其中，F3组分为具有Zn²⁺离子螯合能力的高纯 度肽。该样品的Zn²⁺离子螯合量(浓度为2mg/ml时)是螯合肽粗品(浓度为5 mg/ml时)的4.62倍，也是还原型谷胱甘肽(浓度为5mg/ml时)的3.13倍。

实施例7：

取Alcalase酶制备的锌离子螯合肽粗品，采用去离子水配制成5mg/ml 的肽溶液。取1ml该溶液，添加4ml无水乙醇溶液，使乙醇的终浓度为80％。 将该混合液室温放置30min，之后用离心机进行离心处理，获得的沉淀为肽-锌 离子螯合物。

以上实施例是对本发明的油菜籽饼源金属螯合肽、肽金属螯合物的制备方 法所作出的具体说明，但本发明的范围不受此限制。