华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因 VpSBP16

摘要

本发明中公开了华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，该基因完整开放阅读框序列全长1674bp，编码558个氨基酸。申请人构建了pCAMBIA2300-35S-VpSBP16过量表达载体，通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。结果表明在拟南芥中过量表达VpSBP16明显提高了拟南芥对于渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫的耐受力。此外，在胁迫条件下，转基因株系中的活性氧（ROS）的积累也是明显少于野生对照。在含有氯化钠（NaCl）和甘露醇（Mannitol）的培养基上，VpSBP16转基因株系的萌发率显著高于野生对照。在盐胁迫培养基上，转基因株系的根长也明显长于对照。以上结果都表明VpSBP16基因在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫和干旱胁迫的能力。

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗逆基因鉴定及基因工程技术领域，特别涉及华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16。 

背景技术

Squamosa启动子结合蛋白（Squamosa promoter Binding Protein,SBP）是一类植物特有的转录因子。它最初是由金鱼草（Antirrhinum majus）中分离。之后，SBP基因陆续从拟南芥、白桦树，衣藻、水稻、苔藓、玉米和番茄中分离。这些SBP转录因子家族具有许多重要的生物学功能，包括孢子发生、枝条发育、花发育、叶原基的形成、营养生长和生殖生长之间的转换、叶片的发育、环境信号和病原菌应答。 

在自然生长环境中，植物经常暴露于复杂多变的生物与非生物胁迫中。为了改善植物对胁迫和疾病的抵抗能力，研究各种胁迫途径中抗逆基因的功能是很重要的。但现有的关于SBP基因的研究主要集中在植物的生长发育方面，关于SBP基因在抗逆方面的研究还很少。因此，在本研究中，我们通过收集分析公开可用的葡萄芯片数据库研究了了葡萄中SBP-box基因对各种生物和非生物胁迫以及激素处理的反应 

干旱、盐碱、寒冷，高温以及病原菌的侵害等一系列生物和非生物胁迫对植物的生长发育和农作物的产量造成了不可逆的伤害。调控各种胁迫应答基因的转录表达是植物对一系列的生物和非生物胁迫 的响应的一种重要方式。很多转录因子如WRKY，bZip，AP2/ERF和MYB等都响应干旱、盐碱、寒冷等逆境胁迫，从而提高植物体对逆境胁迫的耐受力。 

迄今为止，关于SBP-box基因功能方面的研究主要集中在一些重要的生物发育过程中。而对于SBP基因在胁迫中发挥作用的研究还很少。但也有研究表明，在拟南芥中，SBP-box基因可以通过与参与防御反应途径的基因相互作用来对各类的生物和非生物胁迫做出响应。此外，已有研究表明AtSPL14基因参与了细胞程序性死亡，且在伏马毒素B1的敏感性方面有重要作用。在研究中，申请人也发现第1组葡萄SBP-box基因可能在抵抗病原菌感染方面起到了关键作用，如VvSBP17基因在欧洲葡萄品种霞多丽感染黑木病后，表达量上调表达；葡萄VvSBP7基因在高抗株系感染霜霉病后出现下调表达；VvSBP17，VvSBP7和VvSBP5基因在成熟葡萄果实感染葡萄卷叶病毒Ⅲ后，基因的表达水平都显著增加。此外，对野生葡萄进行盐胁迫和外源激素处理结果显示，处于第二组中VvSBP3和VvSBP16的基因表达量也发生了明显的改变。 

细胞膜具有选择透过性，这是植物维持正常生理功能的重要条件之一。他可以阻止不需要或对细胞有害的物质进入细胞，是植物的一种自我保护。但当植物长期处于逆境时，细胞膜的选择透性降低甚至消失，细胞内物质就会大量外渗，从而引起植株电导率的变化。可以通过这种变化来了解植株细胞膜的受伤害程度进而说明所测植株的抗逆性强弱。 

活性氧是一类具有比氧分子活泼的氧的某些衍生物，如过氧化氢（H₂O₂）、超氧化物的阴离子（O₂.-）和羟基（-OH）等。正常条件下， 植物细胞中的活性氧（ROS）并不会对植物产生严重的伤害，但是髙盐和干旱胁迫条件下，活性氧平衡被打破，植物细胞产生过量的ROS而无法被及时清除，造成了严重氧化伤害，进而影响到了植物正常的生理代谢。所以及时清除过量的ROS，维持植物体内氧平衡，对于改善植物抗逆性具有重要的作用。最近的研究已经表明，各类转录因子在活性氧清除方面都有重要的调控作用。水稻中过量表达OsMYB2基因能够降低ROS含量，从而提高了转基因水稻的抗旱能力。在H₂O₂胁迫条件下，香蕉幼苗中MusaWRKY71基因的表达增强，过表达MusaWRKY71可以激活ROS清除系统中过氧化物酶基因的表达。AP2/ERF转录因子也参与了清除ROS的过程。在烟草中过量表达JERF3和SlERF3，水稻中过量表达TERF2和SUB1A都可以增强植株清除活性氧能力，提高对各种胁迫的耐受能力。长期的高盐胁迫会导致盐分沉积，通常会使植株体内水势降低而无法从土壤中吸取水分。这样就迫使植株处于缺水状态，构成了生理学上的干旱胁迫。 

植物根系的形成与植物的抗旱和抗盐性密切相关，有研究表明，在干旱胁迫时，过量表达MYB96可以使拟南芥的根系更加发达。 

发明内容

本发明的目的在于，提供华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，并证明了该基因在抗逆方面的功能。 

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案： 

华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，其特征在于，该华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的编码区序列如下： 

1    ATGGGGTCTT GGAGCTACGT TTCACAGGAA AAGGAATTTA TATCTGATGC AGCCGATTTG CAGCCCAATT 

71   CGCCTGCAAG AAGTAAAAAT GTTTTCATGG GTTGGGAATT GAAAACCCCA TGTAGTTATG  GAAACAGCAT 

141  TTTAGTGTCA AGTCAACAGA TCATTCAGAA TCAGGGTTTT GGGGAATTTG GTATCCCTGA AATGGTCAGA 

211  AAACAATTGC CAGACAATTC AATTAGGGAT GTTTCATGTG GCAAGGGTGG TGATGGAATA ATGGTTAATT 

281  CGATTATGGT ATCCCCAAAT GTCTTTCCCA GAGATGACGA GTCAAGTTCG AAGCTCTCTA GCTCTGTTAT 

351  GGAATCTAAC AGCCAGGACT CTTTGCTCAT TGATTTGAAG CTCGGAAGGT TTGCTGATCA TAGTGATTTC 

421  CAAAATTGTA AACCATCCAA AGCAAACCCC AGTTTGCCAT CGGCTGAGTC CTCTACACCA GCAAAGAGAG 

491  TTCGAGCTGT GGGGTTGAAC TCTCAGACTG CCTTTTGCCA AGTTCATGGT TGTAACAAGG ATCTTAGCAG 

561  CTCAAAAGAC TACCACAAGA GGCACAAAGT TTGTGAAGTT CATTCCAAGA CTGCCAAAGT CATTGTGAAT 

631  GGCATTGAAC AAAGGTTTTG TCAGCAATGC AGCAGGTTTC ATTTGCTGGC TGAGTTTGAT GATGGTAAGC 

701  GCAGCTGTCG CAAACGCCTT GCAGGCCACA ATGAACGTCG GAGGAAACCC CAAGTTGGTA TTCACCCTGG 

771  CAGGGCAGGG AGGTTGCTTC AATCATATAA CGGCTATGCA GGTAATAGAT TTCAGGGGAC TACACTAACA 

841  ACCGCATCCT TTATATGTCA AGATATACTC CCCAGTGGTC TATTGCCACC AGAGAAATAT GGGATGAGTG 

911  ACTGGTGCAA GCGGATAAAA GTTGAAGATG GAACTGACTA TAGTCCTCAA TCAACCATTC CTATAACCAA 

981  TGGGCACCCA CATCCAAAGT CCCTATTCCC TACTTTTGAA TTTGAAAAAC AATATTCTTC CTTTCAAGAC 

1051 AATGGAGCTA ATACAGGAAG TATTTTCAGT GAACACAATA GCCGATATCC ACATGATCTT GCAGATGCAA 

1121 ATTCTGGCCC GCATTCTTTT TTCCAAGACA CCTCATTAGG AAATGAAGAC TTGTCTGTTT  TTGACGCAGG 

1191 ATCTACTGTT CAGGGCTTAT CAGGGATTTC AGACTCTGGT CGTGCTCTCT CTCTTCTGTC ATCTCAATCA 

1261 CAGAACTCTT CCAGCCATTC GTCAGGAATT CCCATGATTC ACCCCCTGAT CATGCCTGGC TGTCATGCCC 

1331 ATTATAATAT AGCTCAAGTC TCTGAGAAGT TCTTGGGAGT CAGCCCCCAG GTTTCAATGA GTAGGGTGCC 

1401 AAATAAGTTT CTTTCATCTG GGATGAATTC TGCAGAAGGG AACCACCTAG GTCCTATACT AATTTCTGAT 

1471 TGTAGTGAGC CAGTGAACTT TGAAGTGACA GATGGGATTT TCCAAGGATC AGATTTTGTA AACACTAAGG 

1541 ATTGTCTTCC TTGTGAAACT GGACCCACCA TTGATTTGCT TCAATTGTCA TCACAACTCCATCGAGTTGA 

1611 GCATCAGAGG CAATCAATAC ATGTCAAGCA GGAAAATGAT ACTTTCTGCC TCCGGATAAC GTAA 

本发明首次构建了pCAMBIA2300-35S-VpSBP16过量表达载体，并通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。研究了华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16过量表达的转基因株系和野生对照在渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫处理下的生长情况。 

通过申请人的研究表明，本发明的华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，能明显提高拟南芥对于渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫的耐受力。此外，在胁迫条件下，转基因株系中的活性氧（ROS）的积累也是明显少于野生对照。在含有氯化钠（NaCl）和甘露醇（Mannitol）的渗透培养基上，具有华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的株系萌发率显著高于野生对照。在盐胁迫培养基上，具有华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的株系的根长也明显长于对照。以上结果都表明华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫和干旱胁迫 的能力。 

附图说明

图1是氯化钠和甘露醇引起的渗透胁迫对野生对照（WT）和转基因株系VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47萌发的影响。其中，A图是在MS培养基的图片，B图是在MS培养基+150mM的NaCl渗透培养基图片，C图是在MS培养基+400mM甘露醇（Mannitol）渗透培养基图片，图D是野生对照WT、转基因株系VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47在图A、B、C中的相应位置示意。 

图2是转基因拟南芥种子分别在MS培养基（左图），MS培养基+150mM氯化钠的渗透培养基和MS培养基+400mM甘露醇的渗透培养基（右图）上的萌发率。 

图3是VpSBP16转基因拟南芥增强了对渗透胁迫的抗性。野生对照（WT）和转基因株系VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47在MS培养基（A图），MS培养基+150mM氯化钠的渗透培养基（B图）以及MS培养基+400mM甘露醇的渗透培养基（C图）上分别培养14天，35天，20天后的生长情况。 

图4是在MS培养基（A图）和盐胁迫培养基（B、C图，即MS培养基+150mM氯化钠、MS培养基+400mM甘露醇的渗透培养基）上生长14天和35天的野生对照，VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47转基因株系拟南芥根长的代表图。 

图5是MS培养基中野生对照（WT）和转基因株系VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47幼苗的失水处理及电导率测定（A图）在50min内，野生对照（WT）和转基因株系VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47培养基幼苗的失水过程比较。将苗龄十天的无菌苗从 萌发培养基中拔出放于自然环境中进行失水处理。每隔十分钟称量一次鲜重，失水量通过两次时间的鲜重差来计算。（B图）失水处理50min时，WT，VpSBP16-1，VpSBP16-14and VpSBP16-47幼苗的电导率。星号表示与野生对照相比有显著差异（*P<0.05）。 

图6是野生对照，转基因株系VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47的盆栽苗对盐胁迫的反应。左图为处理以前的植株代表图，右图为盐胁迫一周后的植株代表图。 

图7是野生对照和转基因株系VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47盆栽苗对干旱胁迫的反应。左图为处理以前的植株代表图，中间图为干旱处理18天后植株代表，右图为复水3天后的植株代表。 

图8是野生对照和转基因株系VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47盆栽苗在非生物胁迫条件下活性氧积累的染色图。 

图9是胁迫相关基因在野生对照和转基因株系（VpSBP16-1，VpSBP16-14，VpSBP16-47）中的表达。选取在MS培养基上生长两周的幼苗提RNA并反转录后利用实时定量PCR技术测定胁迫基因表达量。 

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。 

具体实施方式

申请人利用同源克隆技术，根据欧洲葡萄黑比诺基因组序列采用反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR），以华东葡萄白河-35-1叶片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，首次扩增了华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，该基因完整开放阅读框序列全长1674bp，编码558个氨基酸。 

分析表明它们均包括一个高度保守的SBP结构域，该结构域包含两个C2HCH型的锌指结构和一个双向核定位信号。经过亚细胞定位和转录活性分析表明，它们都可以定位到核里且都具有转录激活活性。 

为了一步研究华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16在植物抵御各种胁迫中的具体功能，申请人构建了pCAMBIA2300-35S-VpSBP16过量表达载体，将其在野生拟南芥植株中过量表达。发现具有华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的株系在渗透胁迫培养基上的种子萌发率显著高于野生对照，而且经过长期培养后，发现具有华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的植株可以在渗透培养基上长出强壮根系，健康的子叶和真叶，而野生对照在种子萌发后，子叶和根系无法正常生长直至植株枯黄变褐死亡。在研究中，申请人对成苗转基因植株进行了盐胁迫和干旱处理并利用化学染色的方法分别检测了在失水处理以及盐胁迫处理后叶片或植株中超氧阴离子自由基（O₂.-）和过氧化氢（H₂O₂）的水平。结果表明在胁迫处理后，与野生对照相比转基因株系中活性氧积累较少，受的氧化胁迫也较小。说明华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的过量表达可能参与了ROS的清除过程从而增强了植株的抗胁迫能力。 

对失水50min的所有植株测定电导率发现，野生植株的电导率明显高于转基因株系，说明在胁迫条件下，华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的转入，改善了拟南芥株系的抗逆性。拟南芥中过量表达华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16后，在遭受盐胁迫时，与对照相比，转基因株系拥有更长和更强壮的根系，这将有利于植株 吸收更多的水分，提高植株的抗盐，抗旱性。 

以下是华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的编码区序列以及抗各种非生物胁迫功能实验验证的具体步骤。 

A、在前期研究获得18个欧洲葡萄SBP家族基因的基础上，利用同源克隆技术，以华东葡萄白河-35-1叶片总RNA反转录合成cDNA第一链为模板，扩增得到了华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16序列，该华东葡萄白河-35-1抗逆基因VpSBP16的编码区序列如下： 

1    ATGGGGTCTT GGAGCTACGT TTCACAGGAA AAGGAATTTA TATCTGATGC AGCCGATTTG CAGCCCAATT 

71   CGCCTGCAAG AAGTAAAAAT GTTTTCATGG GTTGGGAATT GAAAACCCCA TGTAGTTATG GAAACAGCAT 

141   TTTAGTGTCA AGTCAACAGA TCATTCAGAA TCAGGGTTTT GGGGAATTTG GTATCCCTGA AATGGTCAGA 

211   AAACAATTGC CAGACAATTC AATTAGGGAT GTTTCATGTG GCAAGGGTGG TGATGGAATA ATGGTTAATT 

281   CGATTATGGT ATCCCCAAAT GTCTTTCCCA GAGATGACGA GTCAAGTTCG AAGCTCTCTA GCTCTGTTAT 

351   GGAATCTAAC AGCCAGGACT CTTTGCTCAT TGATTTGAAG CTCGGAAGGT TTGCTGATCA TAGTGATTTC 

421   CAAAATTGTA AACCATCCAA AGCAAACCCC AGTTTGCCAT CGGCTGAGTC CTCTACACCA GCAAAGAGAG 

491   TTCGAGCTGT GGGGTTGAAC TCTCAGACTG CCTTTTGCCA AGTTCATGGT TGTAACAAGG ATCTTAGCAG 

561   CTCAAAAGAC TACCACAAGA GGCACAAAGT TTGTGAAGTT CATTCCAAGA CTGCCAAAGT CATTGTGAAT 

631   GGCATTGAAC AAAGGTTTTG TCAGCAATGC AGCAGGTTTC ATTTGCTGGC TGAGTTTGAT GATGGTAAGC 

701   GCAGCTGTCG CAAACGCCTT GCAGGCCACA ATGAACGTCG GAGGAAACCC CAAGTTGGTA TTCACCCTGG 

771   CAGGGCAGGG AGGTTGCTTC AATCATATAA CGGCTATGCA GGTAATAGAT TTCAGGGGAC TACACTAACA 

841   ACCGCATCCT TTATATGTCA AGATATACTC CCCAGTGGTC TATTGCCACC AGAGAAATAT GGGATGAGTG 

911   ACTGGTGCAA GCGGATAAAA GTTGAAGATG GAACTGACTA TAGTCCTCAA TCAACCATTC CTATAACCAA 

981   TGGGCACCCA CATCCAAAGT CCCTATTCCC TACTTTTGAA TTTGAAAAAC AATATTCTTC CTTTCAAGAC 

1051 AATGGAGCTA ATACAGGAAG TATTTTCAGT GAACACAATA GCCGATATCC ACATGATCTT GCAGATGCAA 

1121 ATTCTGGCCC GCATTCTTTT TTCCAAGACA CCTCATTAGG AAATGAAGAC TTGTCTGTTT TTGACGCAGG 

1191 ATCTACTGTT CAGGGCTTAT CAGGGATTTC AGACTCTGGT CGTGCTCTCT CTCTTCTGTC ATCTCAATCA 

1261 CAGAACTCTT CCAGCCATTC GTCAGGAATT CCCATGATTC ACCCCCTGAT CATGCCTGGC TGTCATGCCC 

1331 ATTATAATAT AGCTCAAGTC TCTGAGAAGT TCTTGGGAGT CAGCCCCCAG GTTTCAATGA GTAGGGTGCC 

1401 AAATAAGTTT CTTTCATCTG GGATGAATTC TGCAGAAGGG AACCACCTAG GTCCTATACT AATTTCTGAT 

1471 TGTAGTGAGC CAGTGAACTT TGAAGTGACA GATGGGATTT TCCAAGGATC AGATTTTGTA AACACTAAGG 

1541 ATTGTCTTCC TTGTGAAACT GGACCCACCA TTGATTTGCT TCAATTGTCA TCACAACTCC ATCGAGTTGA 

1611 GCATCAGAGG CAATCAATAC ATGTCAAGCA GGAAAATGAT ACTTTCTGCC TCCGGATAAC GTAA 

B、将华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16序列的完整开放阅读框插入CaMV35S启动子下游，构建了植株过量表达载体并将 其通过农杆菌介导的花絮浸染法将其导入野生型拟南芥哥伦比亚C0。筛选获得了表现型良好的VpSBP16转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）。 

C、参见图1～图9，申请人鉴定了VpSBP16转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）能明显提高拟南芥对于渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫的耐受力。此外，在胁迫条件下，转基因株系中的活性氧（ROS）的积累也是明显少于野生对照。在ＭS萌发培养基中添加氯化钠（NaCl）和甘露醇（Mannitol），VpSBP16转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）的萌发率显著高于野生对照。在盐胁迫培养基上，转基因株系的根长也明显长于对照。 

以上结果都表明华东葡萄白河-35-1抗逆基因VpSBP16在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫和干旱胁迫的能力。 

以下是申请人给出的具体实施例。 

实施例1：过量表达的转基因株系和野生对照在渗透胁迫情况下的萌发 

三个转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）和野生对照（WT）在MS培养基上2d时开始萌发，4d后萌芽率都能达到100%。而在含有氯化钠和甘露醇的MS渗透培养基上培养14d后，含有氯化钠的渗透培养基上的转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）的萌发率分别达到了81.48%、86.67%、75%，而野生对照（WT）的萌发率只有56.41%，明显低于转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）。在含有甘露醇的渗透培养基上，转基因株系（VpSBP16-1，VpSBP16-14，VpSBP16-47）的萌发率分别达到了 89.09%，95.08%，95.91%，而野生对照（WT）的萌发率只有72%（图1，图2）。 

实施例2：华东葡萄白河-35-1抗逆基因VpSBP16转基因拟南芥T3代幼苗对渗透胁迫的抗性 

为了进一步测定VpSBP16转基因株系（VpSBP16-1，VpSBP16-14，VpSBP16-47）的抗胁迫能力，申请人将播种在渗透培养基中的幼苗继续生长直至转基因株系和野生对照出现明显不同的特征。结果表明，转基因株系和野生对照在MS培养基上一直都可以正常萌发生长（图3A）。而在盐胁迫培养基中，所有植株萌发后都生长比较缓慢。35d后观察所有植株的生长情况，除了萌发率显著低于转基因株系外，还发现野生对照在盐胁迫培养基上根系较短，生长矮小，幼苗枯黄，基本不能形成正常的子叶且随着时间的延长，对照不再生长逐渐枯死。而转基因株系虽然比MS培养基上的苗子生长缓慢，但根系强壮，叶片墨绿，基本可以正常生长（图3B）。播种在MS培养基+400mM甘露醇渗透培养基中所有种子也均表现出和盐胁迫类似的特征（图3C）。表明华东葡萄白河-35-1抗逆基因VpSBP16的过量表达显著提高了拟南芥植株对渗透胁迫的抗性。 

为了确定VpSBP16基因株系（VpSBP16-1，VpSBP16-14，VpSBP16-47）的抗盐能力是否与根系的伸长有关，将转基因株系（VpSBP16-1，VpSBP16-14，VpSBP16-47）和野生对照分别种植于培养皿中垂直培养来观察根的生长情况。植株生长14d后，在MS培养基中，转基因株系和野生对照的根系长度没有明显的变化，所有植株根系都已达到4.5cm（图4A），而盐胁迫培养基（即MS培养基+150mM氯化钠、MS培养基+400mM甘露醇的渗透培养基）虽然所 有植株的根系伸长都被抑制（图4B，图4C），但转基因株系（VpSBP16-1，VpSBP16-14，VpSBP16-47）的根系还是明显长于对照，表明华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的过量表达抵消了部分盐胁迫对植株根系伸长的抑制作用。 

由于前面研究已经表明华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16过量表达提高了拟南芥对甘露醇胁迫的抗性。而甘露醇是一种组织吸收剂，被认为是一种可以模拟干旱的水分胁迫因子。为了进一步测定VpSBP16转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）对水分胁迫的响应，申请人对培养基中的转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）和野生对照进行了失水处理并测定了处理结束时的电导率。结果表明三个转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）在整个失水处理过程中，失水率都低于野生对照（图5A）。在50min时，转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）的失水率分别为56.99%、54.22%、53.09%，而野生对照（WT）失水率达到了68.71%，明显髙于转基因植株（图3-12A）。此外，对失水50min的所有植株测定电导率发现，转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）的电导率分别为40.04%、33.52%、29.37%，而野生对照（WT）电导率达到了60.26%，显著髙于转基因株系（图5B）。这些结果表明在失水过程中，转基因株系受到的渗透伤害显著低于对照，过量表达的华东葡萄株系白河-35-1抗逆VpSBP16基因提高了植株对失水处理的耐受力。 

这些结果都表明华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16在拟南芥中的过量表达明显提高了植株对渗透胁迫的抗性。 

实施例3：华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16转基因拟南芥T3代植株对盐胁迫和干旱胁迫的抗性 

在前面的研究中已经证明华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16对模拟盐胁迫和干旱胁迫处理以及失水处理都有积极的响应。所以申请人着重研究了拟南芥成年植株对各种胁迫的反应。 

为了避免外界和人为因素的影响，申请人将转基因植株（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）和野生对照种植于同一营养钵中。对生长三周的成苗植株进行盐胁迫处理后，结果显示盐胁迫处理一周后，转基因植株（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）和野生对照出现了明显不同的性状表现。未转基因的野生植株都出现了较为严重的枯黄和皱缩现象，而转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）虽然也出现了不同程度的黄斑，但生长状态明显好于对照（图6）。 

前面所进行的失水处理属于短期干旱胁迫。为了进一步证明该基因在抗旱方面的功能，申请人对正常浇水生长14d的转基因植株和野生对照盆栽苗进行了为期18d的干旱胁迫处理。18d后发现野生对照出现了明显的枯萎凋零，而转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）虽然也表现出了失水萎蔫，但症状比对照要轻。复水三天后，所有转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）都开始复活，但野生对照全部死亡（图7）。 

实施例4：VpSBP16转基因拟南芥在非生物胁迫下活性氧的产生 

植物细胞长期处于逆境胁迫时，活性氧就会大量积累造成氧化伤害，导致细胞损伤甚至死亡。为了验证华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16对于氧化胁迫的作用，申请人利用化学染色的方法分 别检测了在失水处理以及盐胁迫处理后叶片或植株中超氧阴离子自由基（O_2.^-）和过氧化氢（H₂O₂）的水平。由图可以明显的看出在各种非生物胁迫下，用氯化硝基四氮唑蓝液（NBT）和二氨基联苯胺（DAB）染色后各个转基因株系（VpSBP16-1、VpSBP16-14、VpSBP16-47）都呈现出较浅的颜色，而野生对照染色较重（图8）。表明在胁迫处理后，与野生对照相比较转基因株系中活性氧积累比较少，受的氧化胁迫也较小。说明华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的过量表达增强了植株的抗氧化胁迫能力。 

实施例5：胁迫相关基因在野生对照和VpSBP16转基因株系中的表达 

干旱，高盐，冷胁迫等都会引起植物缺水使植物处于水分胁迫下。为了进一步了解VpSBP16转录因子在植物响应各种胁迫过程中的调控作用，通过实时定量PCR检测了一些已知功能的胁迫相关基因AtSOS2，AtSOS3，AtFRY1，AtSAD1，AtADH，AtCOR15a，AtKIN2，AtP5CS1，AtRD29B，AtCDPK1和AtCDPK2在野生对照及转基因株系中的表达量（图9）。 

实时定量结果表明，在拟南芥中过量表达华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16提高了AtSOS2，AtSOS3，AtCOR15a和AtKIN2的表达量，特别是AtCOR15a。在三个转基因株系（VpSBP16-1，VpSBP16-14和VpSBP16-47）中，AtCOR15a基因的表达量分别达到了野生对照的80倍，65倍和35倍；AtSOS3基因的表达量均达到了对照的10倍左右；AtSOS2基因的表达量达到了对照的4倍以上；AtKIN2基因的表达量也比对照上调了2倍左右。而华东葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16过量表达对于AtFRY1，AtSAD1，AtADH，AtP5CS1， AtRD29B，AtCDPK1和AtCDPK2的基因表达表现出了不同程度的抑制作用。