中国野生华东葡萄白河-35-1抗白粉病PR10基因的克隆与表达分析

摘要

在前期的研究中，实验室以多年鉴定为高抗白粉病的中国野生华东葡萄白河-35-1为材料，构建了cDNA文库，并测序获得了与抗病有关的一些EST序列。本试验是在此基础上，对所获得的病程相关蛋白基因(PR10)的EST序列进行进一步地研究，以阐明该病程相关蛋白基因的结构，与其它物种中病程相关蛋白基因的同源关系，考察其拷贝数，表达特点及在葡萄抗白粉病过程中的表现，取得的主要研究结果有： 1．白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPPR10)cDNA及DNA序列的克隆和分析在已有PR10 EST、序列的基础之上，设计特异引物，通过RACE技术，克隆获得了华东葡萄白河-35-1 PR10基因的完整cDNA序列，长827 bp组成，暂命名为VpPR10。根据该完整序列的开放阅读框区域设计引物，克隆获得了VpPR10的部分DNA序列，长602 bp。两条序列登录GenBank．数据库，登录号分别为：DQ336289和DQ396808。序列分析表明，VpPR10基因序列除具有PRlO基因普遍具有的Bet v1 family signature和P-loop模体外，还具有其它多个模体。序列比对表明，VpPR10蛋白序列与欧洲葡萄白玉霓的两个PR10蛋白分别具有79％和89％的相似性，和毛葡萄的一个PR10蛋白具有96％的序列相似性，和华东葡萄的另外一个PR10蛋白具有98％的相似性。 2．白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)基因的Southem blot分析将白河-35-1基因组DNA分别用EcoR I，HindlⅢ，Xba I三种限制性内切酶进行单酶切，以获得的VpPR10 DNA序列为探针，进行Southern blot分析。结果表明，在每个泳道上，至少有4条杂交带，大小位于2.0至10.0 kb之间，因而VpPR10属于一个多基因家族。对白河-35-2、广西-2、湖南-1、玫瑰香、无核白、河岸葡萄和山平氏葡萄7个葡萄品种或株系的Southern blot分析表明，PR10基因在葡萄中均以多拷贝广泛存在。 3．白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)在mRNA水平的表达变化情况用实时荧光定量PCR技术，对对照及白粉菌接种后不同时间白河-35-1叶片中VpPR10在mRNA水平的表达变化情况进行分析。结果表明，在对照叶片中，VpPR10是组成性表达的，在接种过的叶片中，接种24 h后，VpPR10的表达量与对照相比稍微有所降低，在接种48和72 h后，VpPR10的表达量明显降低，并在72 h时达到最低值。在接种96 h后，VpPR10的表达量恢复到对照的水平。说明在白河-35-1抗白粉病的过程中，VpPR10在转录水平即受到调节，参与抗病反应。 4．白河-35-l病程相关蛋白基因(VpPR10)的原核表达、重组蛋白的纯化及多克隆抗体的制备将VpPR10的编码序列与原核表达载体pGEX-4T-1连接，构建重组表达载体。重组表达载体转入宿主菌Ecoli BL21(DE3)后，用0.1 mM IPTG分别于30℃和37℃诱导3 h进行重组蛋白的表达，结果表明，重组蛋白在两种温度下都能够表达，但在30℃时大部分以可溶形式表达，在37℃时大部分以包涵体形式表达。 用O.1 mM的IPTG在30℃诱导3 h，使重组蛋白大部分以可溶形式表达。诱导后的菌体用细菌裂解液裂解后，收集可溶性蛋白，用GST亲和树脂进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫家兔制备了抗VpPR10融合蛋白的多克隆抗体。 5．白河-35-1叶片中病程相关蛋白(VpPR10)的表达变化情况用制备的多克隆抗体对对照及白粉菌接种后不同时间白河-35-1叶片中VVpPR10蛋白的表达变化情况进行分析。结果表明该抗体能够特异识别电泳迁移位置在17 kDa的蛋白，在未经白粉菌诱导的叶片中，VpPR10蛋白的表达量较高；在经白粉菌诱导后的叶片中，VpPR10蛋白的表达量在诱导24 h后仅有少量降低，但在诱导48 h和72 h后，VpPRl0蛋白的表达量迅速降低，仅能够微弱地被检测到。在诱导96 h后，VpPR10蛋白的表达量迅速恢复到了诱导24 h后的水平，之后又有所提高。这说明，VpPR10在蛋白水平积极参与白河-35-1的抗白粉病的过程。 综上所述，我们研究获得的VpPR10基因全长序列、制备的探针和抗体、该基因在人工接种诱导后在华东葡萄中的一系列表现为进一步深入研究中国野生华东葡萄VpPR10基因提供了重要依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1植物抗病性的分子机制

1.1.1植物抗病性

1.1.2植物抗病的分子机制

1.1.3植物系统获得抗性及信号转导

1.2葡萄白粉病的研究概况

1.2.1葡萄白粉病的起源与分布

1.2.2葡萄白粉病的发病过程

1.2.3葡萄属植物对白粉病的抗性

1.3病程相关蛋白10(PR10)的研究进展

1.3.1病程相关蛋白及其分类

1.3.2病程相关蛋白10(PR10)的表达情况

1.3.3病程相关蛋白10(PR10)的生物学功能

1.4本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1葡萄材料

2.1.2质粒和菌株

2.1.3试剂与仪器

2.2方法

2.2.1葡萄基因组DNA的提取及纯化

2.2.2葡萄叶片的白粉菌接种处理

2.2.3葡萄叶片RNA的提取及纯化

2.2.4白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)cDNA序列的5'-RACE扩增

2.2.5白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)DNA序列的克隆

2.2.6核酸及蛋白序列的生物信息学分析

2.2.7白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)的Southern blot分析

2.2.8白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)mRNA表达的实时荧光定量分析

2.2.9白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)在大肠杆菌中的表达

2.2.10白河-35-1病程相关蛋白(VpPR10)多克隆抗体的制备

2.2.11葡萄叶片总蛋白的提取

2.2.12白河-35-1叶片中病程相关蛋白(VpPR10)的Western blot分析

第三章结果与分析

3.1白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)cDNA序列及DNA序列的克隆

3.2白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)的生物信息学分析

3.3白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)的Southern blot分析

3.4白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)的实时荧光定量分析

3.5白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)的原核表达

3.5.1白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)表达载体的构建

3.5.2白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)的诱导表达

3.5.3白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

3.5.4白河-35-1叶片中病程相关蛋白(VpPR10)的Western blot分析

第四章讨论

4.1白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)的序列特征

4.2白河-35-1病程相关蛋白基因(VpPR10)在白粉菌诱导后的反应

第五章结论

参考文献

致谢

作者简介