利用乳清蛋白肽降低血清胆固醇水平的产品和制备方法

摘要

本发明旨在研究以乳清浓缩蛋白为原料，对具有降低血清胆固醇水平的活性肽进行深入、系统的研究，研究生物酶技术、膜分级分离浓缩和多级色谱分离纯化技术，制出一些小分子量并具有降胆固醇功能乳清蛋白水解肽，为工业化生产提供理论基础和技术支撑。本发明采用多级色谱进行分离纯化，所得组分纯度以及胆固醇胶束溶解度抑制率更高，在凝胶过滤时采用去离子水作为洗脱液，与以往的盐类洗脱液相比更加温和，能很好的达到分离效果，并且不会带来盐离子，避免带来健康隐患。本发明所得产品安全性极高，无毒副作用，具有降低血清胆固醇水平的功能，易作为功能因子添加到各类保健食品中，可用于食品和医药行业，具有良好的市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及利用乳清蛋白肽降低血清胆固醇水平的产品和制备方法，属于生物技术领域，涉及的是具有降低血清胆固醇功能的乳清蛋白肽的制备方法以及分离纯化技术。

背景技术

近年来，随着人类社会的进步和科技的发展，人们的生活水平和膳食营养水平都得到的大幅度提高，但随之而来的人们的健康隐患也在无形中提升，其中就包括心脑血管疾病。高血压、冠心病、脑血栓就是心脑血管疾病的常见症状，他们主要是由高血脂症引发的动脉硬化引起的。由于高胆固醇对人类健康危害极大，医药业人工合成的降胆固醇药物又不可避免的会给人体带来副作用，因此，寻找天然的、安全可靠的降胆固醇肽意义重大。

目前很多研究学者把目标指向了天然的降胆固醇活性因子，研究发现，许多食物蛋白源生物活性肽都具有降低血液胆固醇水平的功能，继而掀起了研究开发降胆固醇活性肽的热潮。

实际上，一直以来研究食物源蛋白生物活性肽对动物或人类血清胆固醇水平的影响更多的是采用大豆蛋白和酪蛋白。而对于牛乳清蛋白源生物活性肽对血液胆固醇水平的影响则相对研究较少。尽管如此，乳清蛋白源活性肽仍具有潜在的巨大研究价值。Nagaoka通过小鼠生物实验研究表明，相比大豆蛋白质或酪蛋白，牛乳清蛋白源生物活性肽具有更强的降血清胆固醇的功能。

然而，在体内很多活性肽不能够抵抗胃肠道的消化作用，也就不能到达靶部位发挥生理学作用。因此，要开发出能抵抗胃肠道的消化作用的降胆固醇肽至关重要。但是，在既往各种研究中未发现同时具有胆固醇胶束溶解度抑制活性和胃肠道稳定性的乳清蛋白活性肽，本发明所述的胆固醇胶束溶解度抑制活性较高的降胆固醇肽，同时具有较强的人体胃肠道稳定性，有利于其在体内吸收和转运，继而发挥降低血清胆固醇的作用。

发明内容

为了弥补利用乳清蛋白分离纯化具有降胆固醇功能的活性肽的技术参数不成熟和活性、稳定性较低的缺陷，本发明的目的是提供利用乳清蛋白肽降低血清降胆固醇水平的产品和制备方法。

为了实现上一目的，本发明的发明思路为：

本发明旨在以乳清浓缩蛋白为原料，对具有降低血清胆固醇水平的活性肽进行深入、系统的研究，建立生物酶技术生产乳源降胆固醇肽的工艺过程和工艺参数，研究膜分离浓缩与树脂吸附，结合多级色谱分离纯化技术，制出一些小分子量并具有降胆固醇功能的乳清蛋白水解肽，并采用模拟人体胃肠道试验研究表明其稳定性较强，为工业化生产提供理论基础和技术支撑。

本发明利用的生物酶是具有专一切割性的碱性蛋白酶，获得所需肽段优势更强。采用多级色谱进行分离纯化，所得组分纯度以及胆固醇胶束溶解度抑制率更高，在凝胶过滤时采用去离子水作为洗脱液，与以往的盐类洗脱液相比更加温和，能很好的达到分离效果，并且不会带来盐离子，避免带来健康隐患。本发明所得产品安全性极高，无毒副作用，与降胆固醇功能有关，对体内胆固醇溶解度具有抑制作用，可以作为制备降胆固醇药物、保健食品或功能性食品的用途。

本发明所述的是利用乳清蛋白肽降低血清降胆固醇水平的产品和方法，其步骤如下：

（1）用适宜蛋白酶水解乳清蛋白粉；

（2）利用超滤技术初分离乳清蛋白水解肽，冷冻干燥，得到粗多肽；

（3）将水解肽经大孔吸附树脂脱盐处理；

（4）用凝胶过滤色谱（SepHadex G-50）对水解的肽进行分离纯化；

（5）使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对步骤（4）中得到的胆固醇胶束溶解度抑制率较高的洗脱组分进行进一步分离纯化。

（6）对（5）中得到的产品进行体外稳定性试验。体外模拟人体胃肠道环境两个阶段的消化过程，并分别测定消化前后其胆固醇胶束溶解度抑制活性的变化，来确定其稳定性。

所述步骤（1）中，原料为浓缩乳清蛋白WPC80，其蛋白质含量（以干重计）不低于 80.0 %，水分低于 5.5 %，乳脂低于9.0 %，乳糖不低于10.0 %。以胆固醇胶束溶解度抑制率为指标，对最佳水解用工具酶进行筛选，最终选定碱性蛋白酶为工具酶。以胆固醇胶束溶解度抑制率为指标，采用单因素和响应面实验设计对水解条件进行筛选。具体如下，按照底物质量浓度5%将其水化，90℃水浴加热10 min，使乳清蛋白变性，冷却至55 ℃，调pH至9.0，加酶量为每1g乳清蛋白加碱性蛋白酶6000-7000U，水解时间为8 h。水解结束后温度升至90 ℃水浴10 min，使酶失活，然后4000×g下离心15 min，取上清液，冷冻干燥，得到水解肽粉。

所述步骤（2）中，根据超滤条件筛选结果，取（1）的水解肽粉配成5 mg/mL的溶液，用截留分子量为10 kDa的膜在30 ℃温度和0.15 MPa的压力条件下进行超滤，收集超滤透过液，并冷冻干燥备用。

所述步骤（3）中，根据脱盐条件的筛选，取（2）中的肽粉配成5mg/ml的多肽溶液，与大孔吸附树脂按照体积比为1:1的比例混合进行静态吸附，在振荡培养箱振荡24 h后取出，在流速为 1 BV/h条件下，先用去离子水洗柱子，洗至流出液电导率与去离子水一致时，用70%的乙醇进行洗脱，收集流出液后冻干成粉。

所述步骤（4）中，利用SepHadex G-50对（3）中的肽粉进行降胆固醇肽的分离，根据最佳洗脱液筛选结果，采用去离子水作为洗脱液，压力为1.0 MPa，流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，样品收集为2.0 mL/管，得到吸收组分峰，通过检测胆固醇胶束溶解度抑制率，收集抑制率高的组分。

所述步骤（5）中，用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对（4）中抑制率较高的组分进一步分离纯化，色谱柱：C₁₈色谱柱，流动相：A，0.1%的三氟乙酸水溶液；B，0.09%的三氟乙酸乙腈溶液；采用梯度洗脱程序，检测波长：215 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 ml/min，进样量：10 μL。多次上样收集各个洗脱峰，检测其胆固醇胶束溶解度抑制率。收集胆固醇胶束溶解度抑制活性最高的洗脱组分，冷冻干燥，得粉末状具有降胆固醇功能的活性肽。

所述步骤（6）中，体外模拟人体胃肠道环境两个阶段的消化过程，将活性肽粉末按照1% (w/v) 的比例加入到 0.1 mol L^-1 的KCl-HCl缓冲溶液（pH 2.0）中，在37 ℃ 条件下处理5 h。胃蛋白酶处理后的肽溶液加入到100 ℃ 保持15 min灭酶活，然后用0.05 mol L^-1的NaOH溶液中和至pH为7.0中，溶液经10000×g 离心40 min，并测定其胆固醇胶束溶解度抑制率。经胃蛋白酶处理后的肽溶液在用2% (w/v)的胰蛋白酶在在37 ℃ 条件下处理4 h，然后加热到100 ℃ 保持15 min，最后反应溶液经10000×g 离心40 min，并测定其胆固醇胶束溶解度抑制率。

本发明所使用的乳清蛋白粉是浓缩乳清蛋白WPC80，其蛋白质含量不少于80%，灰分低于5.5%，乳糖含量为总干物质的10%左右。

所述超滤过程采用SMB-20型超滤设备进行，超滤膜为Millipore(10 kDa)；所述凝胶过滤层析采用的是?KTA?prime蛋白质纯化系统，填料为SepHadex G-50，层析柱为玻璃层析柱Φ1.5×70 cm；所述液相色谱是Agilent LC 1200液相色谱仪，色谱柱为Kromasil C18色谱柱（5μm，250mm×4.6mm）。

上述方法分离纯化的具有降低血清胆固醇功能的乳清蛋白肽分子量为2454 Da。

本发明分离纯化的具有降胆固醇功能的乳清蛋白肽的分子量为2454 Da，胆固醇胶束溶解度抑制率为58.77%。

上述方法分离纯化的乳清蛋白降胆固醇肽可用于降低动物血清胆固醇水平。

本发明的优点：本发明分离纯化的乳清蛋白降胆固醇活性肽，经体外实验证实胆固醇胶束溶解度抑制率为58.77%，经模拟胃肠道实验证明其稳定性较强。本发明分离纯化的乳清蛋白降胆固醇活性肽可用于降胆固醇保健食品和药品的制备，并且可以得到显著效果，具有很好的应用前景和市场前景。

附图说明

图1为采用SepHadex G-50凝胶过滤色谱纯化乳清蛋白降胆固醇肽图谱；

图2为反相高效液相色谱纯化乳清蛋白降胆固醇肽图谱。

具体实施方式

原料：乳清浓缩蛋白WPC80；碱性蛋白酶：2×10⁵ U/g。

1.取乳清浓缩蛋白原料25 g，溶于500 mL蒸馏水中，加热至90 ℃水浴10 min。降温至55 ℃，用1M NaOH调节pH为9.0，加入1 g碱性蛋白酶，水解过程中不断加入1M NaOH维持pH为9.0不变，水解时间为8 h。水解完成后升温至90 ℃保持10 min灭酶活，4000×g下离心15 min，取上清液，得到粗多肽液冷冻干燥得到水解肽粉。

2.将步骤1得到的水解肽粉配成5 mg/mL的溶液，在30 ℃温度和0.15 MPa的压力条件下利用截留分子量为10 kDa的膜进行超滤，收集超滤透过液和截留液，并测定它们的胆固醇胶束溶解度抑制率。将抑制活性较高的透过液冷冻干燥，备用。

3.将步骤2得到的多肽配制成5 mg/mL的溶液，利用DA201-C型大孔吸附树脂对其进行脱盐，静态吸附选择水解液与湿树脂体积比为1:1，在振荡培养箱振荡24h，以四倍柱体积去离子水洗柱子，流速为1 BV/h，洗至流出液电导率与去离子水一致时，用70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱组分冷冻干燥，备用。

4. 用去离子水将步骤3中得到的多肽配制成20 mg/mL的溶液，利用SepHadex G-50对其进行纯化，调节压力为1.0 MPa，流速为1 mL/min，样品收集为2.0 mL/管，一次上样6 mL，紫外检测器波长选择280 nm进行检测，收集各个洗脱峰，筛选胆固醇胶束溶解度抑制活性较高的组分。结果见表1，表明FB组分的胆固醇胶束溶解度抑制活性较高，所以对FB组分进行下一步分离纯化。

表1凝胶过滤色谱洗脱组分的降胆固醇活性

注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P <0.05）。

5. 利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对步骤4中得到的FB多肽组分进行进一步分离纯化，流动相：A，0.1%的三氟乙酸水溶液；B，0.09%的三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱程序，检测波长：215nm；柱温：30℃；进样量：10μL。收集各个洗脱峰，筛选胆固醇胶束溶解度抑制活性较高的组分。结果见表2，没有检测到胆固醇胶束溶解度抑制活性的组分未列出。结果表明F5组分表现出了最高的胆固醇胶束溶解度抑制活性，是我们实验的目标组分，即具有降低胆固醇功能的乳清蛋白肽。

表2反相液相色谱分离组分的降胆固醇活性

洗脱组分胆固醇胶束溶解度抑制率(%)组分210.05±0.77^>组分34.58±0.94^>组分414.48±0.81^c组分558.77±1.14^>组分616.36±0.82^>组分76.59±1.19^>

注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P <0.05）。

6. 体外模拟人体胃肠道环境两个阶段的消化过程，将步骤5得到的F5活性肽粉末按照1% (w/v) 的比例加入到 0.1 mol L^-1 的KCl-HCl缓冲溶液（pH 2.0）中，在37 ℃ 条件下处理5 h。胃蛋白酶处理后的肽溶液加入到100 ℃ 保持15 min灭酶活，然后用0.05 mol L^-1的NaOH溶液中和至pH为7.0中，溶液经10000×g 离心40 min，并测定其胆固醇胶束溶解度抑制率。经胃蛋白酶处理后的肽溶液在用2% (w/v)的胰蛋白酶在在37 ℃ 条件下处理4 h，然后加热到100 ℃ 保持15 min，最后反应溶液经10000×g 离心40 min，并测定其胆固醇胶束溶解度抑制率。结果见表3，可知产品的胆固醇胶束溶解度抑制率从58.77%下降到53.52%，活性降低不明显，证明了产品的稳定性较好。

表3经模拟胃肠道消化前后活性肽的降胆固醇活性的变化

处理方式胆固醇胶束溶解度抑制率(%)原降胆固醇肽58.77 ± 1.14^>胃蛋白酶消化55.29 ± 0.91^>胰蛋白酶消化53.52 ± 1.03^>

注：在同一列数据中的字母，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P <0.05）。