一株不利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌

摘要

本发明公开了一株不利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）BBE C3，已于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013479。这株嗜盐四联球菌BBE C3不能够利用精氨酸，并且不积累瓜氨酸，在降低发酵食品中氨基甲酸乙酯含量方面有潜在应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一株不利用精氨酸且不积累瓜氨酸的嗜盐四联球菌，属于微生物领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate,EC）是一种致癌物质，主要会引发肺癌、肝癌等严重性 肿瘤疾病，并且对人体的免疫系统造成伤害。研究发现，不仅酒类中含有氨基甲酸乙酯，而 且在大豆发酵制品如酱油中同样不同程度的含有此类物质。

酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质是瓜氨酸与乙醇。因此降低酱油中瓜氨酸的含 量是我们降低酱油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。

在酱油生产中，酵母产生乙醇，一大类厌氧或兼性厌氧的乳酸菌可以把精氨酸通过精氨 酸脱亚氨基途径（ADI途径）转化成瓜氨酸。ADI途径主要由三个基因控制，arcA基因， arcB基因，arcC基因。具体反应如下面的反应式所示。

酱醪中的主要微生物有乳酸足球菌，嗜盐四联球菌，魏斯氏菌，链球菌，葡萄球菌，乳 酸菌。乳酸菌是酱油生产过程中的优势菌株，也是香味物质产生菌，但也是瓜氨酸积累量很 高的菌株。

本发明旨在筛选一株不能利用精氨酸且不产瓜氨酸的乳酸菌，从而降低酱油中氨基甲酸 乙酯的含量。

发明内容

本发明提供了一株嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）BBE C3，已于2013年 10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是中国武汉，武汉大学，保 藏编号为CCTCC NO:M2013479。

T.halophilus BBE C3在高盐环境下不利用精氨酸且不积累瓜氨酸。

所述嗜盐四联球菌分离自传统酱油工艺的酱醪，其保藏条件如下：从生长良好的平板上 挑取单菌落转接入含100g/lNacl的MRS培养基中，在30℃静置培养四天，取500μL培养液 移入含有500μL30%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。

所述MRS培养基为培养乳酸杆菌专用，购于OXIOD公司。

嗜盐四联球菌分离培养基为改良MRS培养基：100g/l NaCl,溴甲酚紫0.06g/l，50u/ml 制霉菌素，100g/l生酱油；30℃，5-7天。

氨基酸检测培养基：酵母膏5g/l，牛肉膏5g/l，胰蛋白胨5g/l，NaCl180g/l，葡萄糖 0.5g/l，Tween-801g/l，MgSO₄·7H₂O0.2g/l，MnSO₄·H₂O0.05g/l，FeSO₄0.4g/l，柠檬酸三 胺2g/l，CaCO₃0.1g/l，吡哆醛-5-磷酸0.05g/l，K₂HPO₄2g/l，pH6.0，根据检测需要添加相 应氨基酸。

将保藏的所述嗜盐四联球菌在含100g/l NaCl的MRS固体培养基上划线，于30℃静置培 养4天，挑取单菌落接入含100g/l NaCl的MRS液体培养基，30℃静置培养四天，离心10min （6000rpm，4℃）后去上清，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）悬浮菌体。向5mL离心管中 加入4mL含5g/L精氨酸的氨基酸检测培养基，接种400μL的悬浮菌液，接种后OD₆₀₀为 10.0；30℃静置培养5天后精氨酸没有消耗，瓜氨酸生成量为0，鸟氨酸无积累。

向5mL离心管中加入4mL含3g/L瓜氨酸的氨基酸检测培养基，接种400μL的悬浮菌 液；30℃静置培养5天后瓜氨酸部分转化成鸟氨酸。因此，在高盐条件下这株嗜盐四联球菌 不利用精氨酸产生瓜氨酸。

本发明的有益效果是找到一株不利于精氨酸且不会积累氨基甲酸乙酯的前体物瓜氨酸的 嗜盐四联球菌，在降低发酵食品中氨基甲酸乙酯含量方面有很大的潜在应用价值。

生物材料保藏

嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）BBE C3，已于2013年10月20日保藏于中 国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013479。

具体实施方式

分离平板：改良MRS(100g/l NaCl,溴甲酚紫0.06g/l，50u/ml制霉菌素，100g/l生酱油， 琼脂20g/l)。

培养条件：30℃，5-7天。

基因组提取试剂盒:e.Z.N.A Bacterial DNA Kit D3350-01。

所述MRS培养基为培养乳酸杆菌专用，购于OXIOD公司。

嗜盐四联球菌分离培养基：改良MRS(100g/l NaCl,溴甲酚紫0.06g/l，50u/ml制霉菌素， 100g/l生酱油)，30℃，5-7天。

氨基酸检测培养基：酵母膏5g/l，牛肉膏5g/l，胰蛋白胨5g/l，NaCl180g/l，葡萄糖 0.5g/l，Tween-801g/l，MgSO₄·7H₂O0.2g/l，MnSO₄·H₂O0.05g/l，FeSO₄0.4g/l，柠檬酸三 胺2g/l，CaCO₃0.1g/l，吡哆醛-5-磷酸0.05g/l，K₂HPO₄2g/l，pH6.0。根据检测需要添加相 应氨基酸。

嗜盐四联球菌的培养条件为：将保藏的乳酸菌在含100g/l NaCl的MRS固体培养基上划 线，于30℃静置培养4天，挑取单菌落接入含100g/l NaCl的MRS液体培养基，30℃静置培 养四天，离心10min（6000rpm，4℃）后去上清，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）悬浮菌 体。

实施例1嗜盐四联球菌筛选方法

从180天的传统工艺酱醪中取样稀释涂板到嗜盐四联球菌分离平板上，30℃富集培养5 天。挑选表面光滑、不透明、乳白色的小单菌落接种到含有100g/l NaCl的MRS固体培养基 上，划线分离作纯培养。四天后，将纯培养物接种到100g/l NaCl的MRS液体培养基中培养 四天富集菌体，提取基因组，通过PCR筛选得到有groEL基因的菌株。

正向引物：5'-CGTCGTTCAATGCTTAATGG-3'；

反向引物：5'-TGCTGCCAGAAGAAACTTCA-3'；通过16S rDNA测序结果与数据库比对 后确定是嗜盐四联球菌。已于2013年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉， 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013479，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所 示。

实施例2嗜盐四联球菌的arcA基因验证

挑取-80℃甘油管保藏的嗜盐四联球菌在100g/l NaCl的MRS固体培养基上划线，30℃培 养四天后，挑取单菌落进行菌落PCR，验证是否有arcA基因。

正向引物：5'-GTGTTCCAATGTGTCCTCTTCT-3'；

反向引物：5'-GGTATTCGTAGTCATGCGGTAA-3'；验证结果表明这株嗜盐四联球菌无 arcA基因。

实施例3嗜盐四联球菌利用精氨酸能力分析

挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌单菌落接种于100g/l NaCl的MRS液体培养基中， 30℃静置培养四天，离心10min（4000rpm，4℃）取菌体，加入1mL磷酸盐缓冲液（PBS， pH7.0）悬浮菌体。

向5mL离心管中加入4mL含5g/l的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种400μL的悬浮 菌液，接种后OD₆₀₀为10.0。30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸和瓜 氨酸以及鸟氨酸含量，观测到精氨酸没有消耗，瓜氨酸生成量为0，鸟氨酸无积累。因此， 在高盐条件下这株嗜盐四联球菌不能利用精氨酸产生瓜氨酸。具体数值如下：

表1不同盐浓度下精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸代谢变化

ΔArg(g/l）：精氨酸的消耗量  ΔCit(g/l)：瓜氨酸的生成量  ΔOrn(g/l)：鸟氨酸的生成量

实施例4嗜盐四联球菌瓜氨酸能力分析

挑取平板上活化好的嗜盐四联球菌单菌落接种于100g/lNaCl的MRS液体培养基中，30℃ 静置培养四天，离心10min（4000rpm，4℃）取菌体，加入1mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0） 悬浮菌体。

向5mL离心管中加入4mL含3g/l的瓜氨酸的氨基酸检测培养基，接种400μL的悬浮 菌液。30℃静置培养5天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸和瓜氨酸以及鸟氨酸含量， 观测到瓜氨酸部分转化成鸟氨酸。因此，在高盐条件下这株嗜盐四联球菌能利用瓜氨酸产生 鸟氨酸。

表2不同盐浓度下瓜氨酸、鸟氨酸代谢变化

ΔCit(g/l)：瓜氨酸的消耗量  ΔOrn(g/l)：鸟氨酸的生成量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。