一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子及其应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种姜花花部特异和受伤害、虫害诱导的TPS2启动子及其应用。所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明所述TPS2启动子调控的目的基因在转基因烟草中仅在花组织表达，其表达与花发育进程有关，且表达受伤害和虫害的诱导。而且本发明所述TPS2启动子可以连接到任意一种植物转化载体，然后导入姜花或其它植物细胞中，可获得含有所述启动子的转基因花香和抗性，从而用于生产；也可以根据本发明所述启动子序列信息产生特异性的分子标记，用于鉴定姜花或其它植物的花香和抗性基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种姜花花部特异和伤害、虫 害诱导的TPS2启动子及其应用。

背景技术

启动子是位于结构基因5′端上游区的一段能识别并活化RNA聚合酶，使之 与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始的DNA序列。它是植物基 因转录调控的中心，是理解基因转录调控机制和表达模式的关键。

根据启动子的转录模式可将其分为：组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。其中，组织特异型启动子亦称为器官特异启动子，包括果实 特异启动子、根特异启动子、叶特异启动子及花器官特异启动子等。在这类启动 子的调控下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位，并往往表现发 育调控的特性。

花器官特异表达启动子可使目的基因在花中特异性表达，可有效控制目的基 因在花中特异表达且与花发育进程密切相关，此外，花器官基因作用时还会受到 许多诱导型等调控元件的协同作用。矮牵牛CHS的调控元件发现其中的一个 G-box，是相关转录因子的结合域，是光、厌氧生活和ABA应答元件，受光和 紫外线诱导调控，与花特异表达有关（洪亚辉等,2003）。当植物受到人为的创 伤或害虫造成的机械损伤后，会产生一些小分子物质和多糖，它们作为信号物质 诱导一系列防御基因的表达。土豆损伤基因蛋白酶抑制剂基因PinⅡ启动子伤诱 导区域在启动子的近端区域，将-700～-195区段与-90CaMV35S启动子融合，发 现嵌合启动子具有伤诱导的活性，因此认为该区段控制该基因的伤诱导表达。

花器官特异启动子不仅含有所必须的保守性顺式元件外，还含有一些组织特 异型和诱导型启动子的特有序列。并且这种的组织特异性通常以特定的组织细胞 结构和化学物理信号为基础，由这类启动子中同时存在几种控制组织特异性表达 的元件的种类、数目及相对位置等共同决定。

目前对转基因技术中启动子的选择主要采用组成型启动子，在组成型表达启 动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和不同的发育阶段都会表达， 且持续、高效的表达，没有时空特异性，造成了能量的损耗，影响阳性植株的成 活率，引起植株生理和形态发生异常改变，从而影响植物的正常生长发育。由于 组织特异和诱导型启动子能够有效地调控下游基因的表达，最大限度地减少由于 外源蛋白在转基因植物体内的积累对其自身造成的伤害。Kasuga等将 rd29A::DREB1A和35S::DREB1A转化烟草，与rd29A::DREB1A转基因植株相 比，35S::DREB1A转基因烟草明显出现生长滞后现象；rd29A::DREB1A转基因 植株的胁迫耐性也明显高于35S::DREB1A转基因植株。Pellegrineschi用胁迫诱导 型启动子rd29A驱动DREB1A/CBF3的表达，提高了转基因小麦对干旱胁迫的耐 性，而且没有引起明显的畸形。

花作为植物重要的生殖器官，在利用植物杂种优势人工创建不育系、以花器 官的表达元件研究一些基因特别是转录因子的功能等基因工程研究中起重要作 用。其中花药特异表达启动子和花粉启动子起到了十分重要的作用。利用花药绒 毡层特异启动子TA29、A9等构建雄性不育基因，创造雄性不育性植株已在烟草、 油菜等获得成功。常小丽（2009）将从百合中克隆到的花部特异的CHS基因启动 子转入拟南芥中发现，在转化植株的花序部位具有特异性表达。Kobayashi等发 现，从三花龙胆(Getiana triflora)中克隆得到的CHS基因启动子可在矮牵牛的花瓣 唇部特异性表达。Lewinsohn等采用E8启动子，将仙女扇的LIS基因导入番茄，成 熟的果实合成并释放香气明显的S-芳樟醇和8-羟基芳樟醇。Davidovich等（2007） 采用PG启动子，将柠檬罗烯香叶醇合成酶（GES）基因转入番茄，该基因在转 基因番茄果实中过量表达导致香叶醇的积累量增加，成功的改变番茄果实风味。

随着植物基因工程技术的发展，组织特异和诱导型启动子可用于人为控制目 标基因在植株的特定发育时期、特殊组织器官和相关逆境条件下精确表达，在改 良作物的抗性、提高花卉的观赏状、改善果实和蔬菜的风味等方面具有重要的应 用前景。

发明内容

本发明的目的为了克服现有技术中对姜花花部特异和伤害、虫害诱导启动子 的研究鲜见报道的缺陷，提供一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动 子。

本发明的另一个目的是提供一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启 动子在培育改变花色、花香和育性等花部特有性状及提高抗虫能力的植物新品种 的应用。

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：

一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。该启动子总长度为1922bp，分段长度分别为782bp和321bp。 TPS2启动子赋予姜花花香基因HcTPS2花部特异和伤害、虫害诱导表达特征。 本发明所述的TPS2启动子序列与GUS基因融合表达转化烟草后，目标基因在 烟草仅花组织表达，其表达与花发育进程有关，并且在叶片中表达受伤害、虫害 和茉莉酸甲酯诱导。

经过软件分析得到所述TPS2启动子含有3个5′端系列缺失的目的片段 p-320、p-780和p-1928，p-320、p-780和p-1928的序列如SEQIDNO:2～ 4所示。

一种重组载体，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入如上所述 TPS2启动子序列（SEQIDNO:2）。所述出发载体可以是本技术领域中经常用到 的所有类型的植物表达载体，优选地，本发明所用的植物表达载体为 pCAMBIA1300G植物表达载体。

一种重组载体，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入如上所述 TPS2启动子的5′端系列缺失的目的片段p-320、p-780或p-1928序列。所 述出发载体可以是本技术领域中经常用到的所有类型的植物表达载体，优选地， 本发明所用的植物表达载体为pCAMBIA1300G植物表达载体。

一种包含如上所述重组载体的重组菌。

一种包含如上所述重组载体的细胞系。

TPS2启动子在培育改变花色、花香和育性等花部特有性状及提高抗虫能力 的转基因植物新品种的应用。

一种培育转基因花香或抗性植物的方法，具体步骤为：将含有如上所述的重 组载体导入出发植物细胞，从而得到TPS2启动子启动目的基因表达的转基因花 香或抗性植物。

优选地，所述目的基因为GUS基因。

本发明同样包括将三种长度的启动子片段作为主要结构部分有效地连接上 合适的目标功能基因所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种启动子片段的 植物和这种植物的种子。

根据本发明提供的启动子DNA序列信息，本领域技术人员可以通过以下方 法容易地获得等同的启动子DNA序列：（1）通过数据库检索获得；（2）以启动 子DNA片段为探针筛选姜花或其它植物的基因组文库获得；（3）根据启动子 DNA序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从姜花或其它植物的基因 组中获取；（4）在启动子DNA序列的基础上用基因工程方法改造获得；（5）用 化学合成的方法获得。

本发明提供的启动子DNA序列具有重要的应用价值。应用之一是将所述的 启动子DNA序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将启动子 DNA序列导入植物细胞，可获得表达所述花部特异和伤害、虫害诱导表达特征， 从而应用于生产。本发明所述的启动子DNA序列构建到植物转化载体中，可以 对融合表达的下游基因进行调控，从而增强植物产生花香和增强抗性等能力。

本发明提供的启动子DNA序列的另一个应用是根据所述基因序列信息产生 特异性的分子标记，包括但不限于SNP（单核苷酸多态）、SSR（简单序列重复 多态）、RFLP（限制性内切酶长度多态）、CAP（切割扩增片段多态）。用这些标 记可鉴定姜花或其它植物的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高 育种的选择效率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将克隆的TPS2启动子DNA序列与控制花色、花香和抗性目标功能 基因结合，有助于产生新的花色、花香和抗性植物，而且不会产生传统育种技术 中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。另外，本 发明能够进一步提供或应用上述TPS2启动子DNA片段获得的新花色、花香和 抗性的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的重组体转化的植株或由这类植 株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其他的植株。

说明书附图

图1.TPS2启动子与GUS融合表达的转基因烟草GUS在不同组织表达特异 性；a：不同组织GUS染色情况；b:不同组织GUS酶活力情况。

图2.TPS2启动子与GUS融合表达的转基因烟草GUS在花器官不同发育时期 的表达；A：不同发育时期GUS染色情况,其中图示1为未开放的花苞；2为半开 状态的花瓣；3为盛开状态下的花瓣；4为衰老的花瓣；B:不同发育时期GUS酶 活力情况，其中图示1～4同A。

图3.不同长度片段TPS2启动子与GUS融合表达的转基因烟草GUS在花 瓣中茉莉酸甲酯处理，伤害处理后的表达；A：不同处理后花瓣中GUS染色情 况；B:不同处理后花瓣中GUS酶活力情况；图示1为未处理的花瓣，2为茉莉 酸甲酯处理的花瓣，3为伤害处理的花瓣。

图4.TPS2启动子与GUS融合表达的转基因烟草GUS在叶片中茉莉酸甲酯， 伤害和虫害的诱导表达；A:不同处理后叶片中GUS染色情况；B:不同处理后 叶片中GUS酶活力情况，图示1为未处理，2为茉莉酸甲酯处理，3为伤害处理， 4为虫害处理。

图5.不同长度片段TPS2启动子与GUS融合表达的转基因烟草植株的PCR 检测图；A:P-1928转基因植株PCR检测；B:P-780转基因植株PCR检测；C:P-320 转基因植株PCR检测。

图6.TPS2启动子p-780片段与花香基因HcTPS1融合表达的转基因烟草植 株的PCR检测图；A：转基因烟草用HcTPS2启动子特异引物扩增；B：转基因 烟草用潮霉素引物特异引物扩增；C：转基因烟草用HcTPS1基因特异引物扩增。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例 中采用的试剂和方法均为本领域常规使用的试剂和方法。

实施例1

TPS2启动子序列的获得

S1.姜花叶片总DNA的提取：将经液氮研磨的0.1～0.2g姜花植物叶 片粉末转移至1.5mL离心管中。加入1mLCTAB溶液，65℃水浴30分钟； 每隔10分钟，颠倒一次。然后，向离心管中加入1mL酚∶氯仿(1∶1)， 颠倒几次，10000rpm离心10分钟，转移上清至一新的离心管，加等体积 的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，10000rpm离心10分钟。转移上清至一新 的离心管。加等体积的异丙醇，颠倒混匀，10000rpm离心10分钟，除去 上清，70%乙醇洗一次，真空抽干，溶于30μL的无菌水中，用于PCR扩 增。所述CTAB溶液的组成为：Tris100mM，NaCl1.4M，20mMEDTA， CTAB2%，巯基乙醇0.1%。

S2.采用hiTAIL-PCR技术克隆HcTPS2基因的5′端上游调控序列： 根据发明人之前获得的姜花HcTPS2基因的序列(见Li和Fan,2011,Molecular  Cloning and Expression Analysis of a Terpene Synthase Gene,HcTPS2,in  Hedychium coronarium.Plant Molecular Biology Reporter29(1):35-42)，在其5′ 端设计3个向外的特异性巢式引物sp1、sp2、sp3，随机简并引物设计参照 Liu等（2007）文献中设计的5个随机简并引物（Liu，2007，BioTechniques， 43（5）：649-656）。具体序列如下：

sp1：5'-CGGATATCATGGGAGCACAGATAGTAGTGC-3'（SEQID  NO:6）

sp2：5'-CTACACGATCACTACTTTGGAGCCTTGTCCTTC-3'（SEQID  NO:7）

sp3：5'-ATGAGGTCAGAGTTGTCGTGTGGATTTGGGCGTAG-3' （SEQIDNO:8）

LAD-1：5'-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3' （SEQIDNO:9）

LAD-2：5'-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3' （SEQIDNO:10）

LAD-3：5'-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA-3' （SEQIDNO:11）

LAD-4：5'-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3' （SEQIDNO:12）

AC1：5'-ACGATGGACTCCAGAG-3'（SEQIDNO:13）

扩增的体系和程序参照Liu等（2007）文献中的进行。把扩增出DNA 片段从琼脂糖胶中回收并连接到pMD-19Tvector，转化E.coli.DH5α，酶 切鉴定后测序。测序序列如SEQIDNO:1所示；SEQIDNO:1所示序列包 括启动子TPS2序列和起始密码子之后的基因的部分ORF序列。起始密码 子之前的序列就是启动子TPS2的核苷酸序列，序列长1922bp，如SEQID NO:2所示。

将启动子TPS2的核苷酸序列（SEQIDNO:2所示）提交在线启动子 分析软件，预测启动子中包含的顺式调控元件，结果发现：启动子TPS2 的核苷酸序列分成3个5′端系列缺失的目的片段；3个5′端缺失序列分 别为p-320、p-780和p-1928。p-320长度约为320bp（SEQIDNO:3所示）； p-780约781bp（SEQIDNO:4所示）；p-1928约1921bp（SEQIDNO:5所 示）。

TPS2启动子调控元件分析

实施例2

TPS2启动子与GUS融合表达转化烟草

S1.根据实施例1获得的TPS2启动子的序列，设计包含HindⅢ和 BamHI酶切位点的用于扩增3个5′端缺失序列p-320、p-780和p-19283 的引物。引物序列如下：

扩增p-320的引物：

p-320-F：5'-GGCCAAGCTTATACGTGCATGTTACAAGTATC-3' （SEQIDNO:14）

扩增p-780的引物：

p-780-F：5'-GGCCAAGCTTCTGTTTCAAAACATCCAATTCCTC-3' （SEQIDNO:15）

扩增p-1928的引物

p-1928-F：5'-GGCCAAGCTTACTGATAAGATAAGTTGC-3'（SEQID  NO:16）

下游引物均为：

R：5'-GGCGGATCCAATTTCAACTTCAAGTCCTGAC-3'（SEQID  NO:17）

S2.pCAMBIA1300G植物表达载体用HindⅢ和BamHI限制性内切酶 进行双酶切，1%琼脂糖凝胶回收大片段。利用T4DNA连接酶将目的片段 定向插入到植物表达载体。将连接产物转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感 受态细胞，经酶切和测序鉴定后，分别获得三种重组植物表达载体。制备 根癌农杆菌EHA105感受态细胞，将上述重组植物表达载体转入农杆菌。

S3.将烟草无菌叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，接种在诱导培养基上 进行预培养，光照培养2～3d。取预培养2～3d后的材料，加入制备好的 农杆菌悬浮菌液，侵染5～10min，倒掉菌液，取出外植体置于无菌吸水 纸上吸去附着的菌液，重新置于原预培养基上，28℃暗培养3d。将共培 养后的外植体转接到抑菌筛选培养基上选择培养20d后，外植体的转化细 胞将产生抗性愈伤组织，将这些材料转入相应的选择分化培养基上进行分 化出芽培养。在筛选培养基上诱导约4周后，不定芽长至2cm以上，将 叶盘边缘长出的幼芽从基部与叶盘切下，插入含有选择压的生根培养基上 进行生根培养。待植株长生出大量根时，将组培苗从组培室拿出，旋松瓶 盖，在室内放置5～7d，每天晒1～2h太阳；然后取出苗子，洗净根系上 的培养基，移栽到灭过菌的培养土中，移栽后罩上打有小孔的透明塑料， 以保持75～85%的湿度，25℃，光照1500～2500Lux，光周期以每天光照 14～16h/8～10h小时黑暗。培养10～15d左右，移到室外进行适应生长。

S4.CTAB法提取抗性植株叶片基因组DNA，用预先设计的包含Hind Ⅲ和BamHI酶切位点的HcTPS2启动子特异引物进行PCR扩增，能扩增 出条带的为阳性植株。

经PCR检测阳性的转基因植株，用未转基因的植株作为阴性对照，取 根、茎、叶、花瓣、花萼、柱头及花药等部位进行染色，脱色，观察GUS 蛋白在不同器官组织和不同发育时期的显色情况和采用化学发光法检测 GUS酶活性。不同组织GUS染色时，花药，花萼，柱头（图1A），花瓣（图 2B）中呈现蓝色；在叶（图3B）,茎和根（图1A）中无明显蓝色，表明TPS2 启动子呈现出花特异表达特性；不同组织GUS酶活性测定结果表明，GUS酶活 性在花药中表达最高，其次是花瓣，花萼和柱头，在茎和叶中酶活力很低，见图 1B，与染色结果一致。不同发育时期的GUS染色结果表明：未开放的花苞没 有蓝色，在半开，盛开和衰老状态下的花瓣呈现蓝色，且盛开的花瓣蓝色最明显。 （图2A）同时GUS酶活性测定结果也表明未开放的花苞酶活力很低，随着花瓣 开放，酶活力提高。在盛开状态下，酶活性达到最高，衰老期下降（图2B）。

把转基因植株与未转基因植株用消毒处理过的小刀划伤进行伤害实 验，20min后，GUS染色检测和GUS酶活性测定。将害虫斜纹夜蛾的幼 虫置于转基因植株与未转基因植株的叶片上，连续观察，待虫咬后20min 后，GUS染色检测和GUS酶活性测定。将0.2mM的茉莉酸甲酯涂于转基 因植株与未转基因植株的叶片和花瓣上，20min后，GUS染色检测和GUS 酶活性测定。GUS染色表明：茉莉酸甲酯和伤害处理后，花瓣的蓝色明显 比未处理的花瓣蓝色颜色深（图3A），同时三个片段比较，启动子片段越 长，蓝色越深。茉莉酸甲酯和伤害处理后的叶片均呈现明显的蓝色。GUS 酶活力测定表明，花瓣茉莉酸甲酯和伤害处理后，GUS酶活性比未处理的 显著提高(图3B)。未处理正常的叶片酶活性极低，但是茉莉酸甲酯,伤害和 虫咬处理后，GUS酶活性均显著提高（图4B）。

实施例3

TPS2启动子与花香基因HcTPS1融合表达转化烟草

用HcTPS1克隆重组质粒做模板，用引入SpeI和BamHI酶切位点的特异引 物进行PCR扩增。PCR产物用TaKaRa回收试剂盒回收，回收产物直接用SpeI 和BamHI限制性内切酶进行双酶切，1%琼脂糖凝胶回收目的片段。采用上述构 建好的含HcTPS2启动子的p-780植物表达载体用SacI和BamHI限制性内切酶 进行双酶切，1%琼脂糖凝胶回收大片段。酶切产物连接，转化大肠杆菌DH5α。 经酶切和测序鉴定后，获得重组植物表达载体。制备根癌农杆菌EHA105 感受态细胞，将上述重组植物表达载体转入农杆菌。

将烟草无菌叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，接种在诱导培养基上进 行预培养，光照培养2～3d。取预培养2～3d后的材料，加入制备好的农 杆菌悬浮菌液，侵染5～10min，倒掉菌液，取出外植体置于无菌吸水纸 上吸去附着的菌液，重新置于原预培养基上，28℃暗培养3d。将共培养 后的外植体转接到抑菌筛选培养基上选择培养20d后，外植体的转化细胞 将产生抗性愈伤组织，将这些材料转入相应的选择分化培养基上进行分化 出芽培养。在筛选培养基上诱导约4周后，不定芽长至2cm以上，将叶 盘边缘长出的幼芽从基部与叶盘切下，插入含有选择压的生根培养基上进 行生根培养。待植株长生出大量根时，将组培苗从组培室拿出，旋松瓶盖， 在室内放置5～7d，每天晒1～2h太阳；然后取出苗子，洗净根系上的培 养基，移栽到灭过菌的培养土中，移栽后罩上打有小孔的透明塑料，以保 持75～85%的湿度，25℃，光照1500～2500Lux，光周期以每天光照14～ 16h/8-10h小时黑暗。培养10～15d左右，移到室外进行适应生长。

CTAB法提取抗性植株叶片基因组DNA，用的HcTPS2启动子特异引 物、潮霉素磷酸转移酶基因引物hptⅡ（潮霉素磷酸转移酶基因序列见SEQ IDNO:24）和HcTPS1基因特异引物（HcTPS1基因序列见华南农业大学 获得的国家专利号ZL201110223418.5）进行PCR扩增，能扩增出条带的 为阳性植株。

HcTPS2启动子特异引物：

P1：5'-GGCGAGCTCCTGTTTCAAAACATCCAATTCCTC-3'（SEQID  NO:18）

P2：5'-GGCCAAGCTTAATTTCAACTTCAAGTCCTGAC-3'（SEQID  NO:19）

潮霉素引物hptⅡ：

P1：5'-CTTCTACACAGCCATCGGTCCAGA-3'（SEQIDNO:20）

P2：5'-GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'（SEQIDNO:21）

HcTPS1特异引物：

P1：5'-GCAACTAGTATGTCTCTCTTCCAACCTGC-3'（SEQIDNO:22）

P2：5'-GGCGGATCCTTACAATAGGATAGGGTTGATC-3'（SEQID  NO:23）

转基因烟草植株挥发性物质SPME-GC/MS分析：对转基因烟草和对照分别 用伤害和虫害基因开花的花朵进行挥发性物质采用固相微萃取－气相色谱质谱 方法分析。采用1.0g新鲜烟草叶片或花瓣，置于100mL三角锥形瓶中，加入 31.6ng/μL的癸酸乙酯5μL作为内标物，用锡箔纸密封，插入100μm聚二甲基 氧烷（PMDS）萃取纤维头，于25℃顶空取样30min。采用 Agilent7890/5975C-GC/MSD气质联用仪进行分析。色谱条件为HP-5石英毛细管 细管柱长30m，内径0.25mm，液膜厚0.25μm，载气He，流速为1mL/min，柱 头压力7.1Psi，平均流速为36.262cm/sec，滞留时间为1.3789min。程序升温：40 ℃，保持2min；以10℃/min的升温速度升至250℃，保持5min。程序分流/不分 流进样口温度250℃，进样口设定为不分流进样方式，分流口吹扫流量为 60mL/min在0.75min。对采集到的质谱图用Agilent5975数据分析软件进行分析， 根据标准样品保留时间与相对保留值及参考有关文献进行核对，确定植物的挥发 性物质的化学成分，并根据各组分峰面积与内标癸酸乙酯峰面积之比定量，确定 烟草挥发性物质的化学成分。结果表明：伤害处理后的转基因烟草叶片中出现 了野生型烟草所没有的单萜罗勒烯；在烟草主要害虫斜纹夜蛾取食烟草叶片后， 转基因烟草中的单萜蒎烯含量升高了4～6倍，新生成了单萜罗勒烯；转基因烟 草的花朵香气物质沉香醇挥发量提高了10～15倍。

                         SEQUENCE LISTING

<110>  华南农业大学

 <120>  一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子及其应用

<130> 

<160>  24  

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1962

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

tactgataag ataagttgcg ctttccctgc atatgaaata gtggccttcg gccacgccgt     60

gaccctctgg gtaagcgagt ctagaagtgt gctgtagtta gagattttga gtttctggga    120

ggcaatggga atgcccaggt atctgaaagg catgtcccct atctggaatc cagtgatggt    180

caaaagctgt tcccgtgtct gagtatctat ccctgtcatg tagatgttgg acttagctat    240

attggccatg aggcttgcta tatgagtaaa ctgtgataag cagtcaacta gctgagtcac    300

cgaagatatg tcctctctgg atagcaagag caggtcatct gcatagatca agtacactat    360

cctaagatgc caaaagctac tgtcgaacag atgaaaggag gaggaattgc gaatagtctt    420

cttgttctag ttgtaagatg tctgaactct catttacttg taattttttc tttcaaattt    480

tttcttgtag cataactcat gcacgacttg ctccaaatgc tggcgttatc ttgaactgga    540

ttgctattga tgttttttcc tgttcttttt ttcaggagct tgtgagttca gtcaaaaatg    600

tgcttccttg gttacaagcg gttctgtcgt tggaaagacc gacggtcaca ctattcatcc    660

gcgctgtgat tttgattgtc aaatacaagt aagttgtacc ctgaaatgat acggttgtta    720

cctttggtta tataaccttt tatgctcaag ctatttagta ctcggttcta aataaaaaaa    780

aatcacacta ttttatttag gatcagctac attgaactta tttcaaatta caatcaaagt    840

gtattcgtcc attgctatca tgctagggca ataatcacct tgtcattcaa cagggaaatg    900

gttggatttg caattgcaat gattgcacta ttactagttg cagcgatact ttgggccaga    960

gtgaatggaa ttggagaaag atgccgagag attgttgtgg acaccacctt tgatcaaaca   1020

atgatggaaa gcatcgttgc agcccagcac agtctgaata acttgcatga gctcgttaag   1080

gaaactaata tcacgatttt gagaatattc tcgataataa tcggaaaggc tccaaaggta   1140

ctgtttcaaa acatccaatt cctccacgac tctctcccaa catttaacag agctattgtc   1200

atatctacag caagctaatg atgtgatgtg ggcaatgatt gcagtagcag tcctgttggt   1260

ggtaatcccg ttcaagtata ttgttatggg gctaactttg tacttgttca tagctaattc   1320

aaggattgcg aagcgcatgt tgaaccaaca gggaaatcga cggctgaaag agtggtggga   1380

gtcgatccct gtcattccag ttcgaacagt gagcagtagt ccttgataga aatggtaaga   1440

ctgatttggg aaaaggtgaa acgatagtct gtttatgaaa cttactgcct catcagcttt   1520

tcttttcaca attgaatttt gcttcatcat ggttttctgt tccttcaatt ctaagttctc   1580

tgtagttttt ttttctttgt gtgcgctcat gtaatcgtct catacgtgca tgttacaagt   1640

atccttgcaa ttttggtcac ccctcgagta aaacttacat aaatcaatat gtagcttgtt   1700

gtaccttgta gagtggcctt tttttttttt cataatttaa aagaagacgg tgttcaattt   1760

gaatcgaatg gtgtactgta atcatcctta taatgacatc tacgcccaaa tccacacgac   1820

aactctgacc tcatcgggta cgattacgaa ctatgaagga caaggctcga aagtagtgat   1880

cgtgtaggtt tattgcaaaa tgaaagaaga agattcaagg tcaggacttg aagttgaaat   1920

tgatggcaaa atgcactact gtctgtgctc ccatgatatc cg                      1962

 

<210>  2

<211>  1922

<212>  DNA

<213>  TPS2启动子

<400>  2

tactgataag ataagttgcg ctttccctgc atatgaaata gtggccttcg gccacgccgt     60

gaccctctgg gtaagcgagt ctagaagtgt gctgtagtta gagattttga gtttctggga    120

ggcaatggga atgcccaggt atctgaaagg catgtcccct atctggaatc cagtgatggt    180

caaaagctgt tcccgtgtct gagtatctat ccctgtcatg tagatgttgg acttagctat    240

attggccatg aggcttgcta tatgagtaaa ctgtgataag cagtcaacta gctgagtcac    300

cgaagatatg tcctctctgg atagcaagag caggtcatct gcatagatca agtacactat    360

cctaagatgc caaaagctac tgtcgaacag atgaaaggag gaggaattgc gaatagtctt    420

cttgttctag ttgtaagatg tctgaactct catttacttg taattttttc tttcaaattt    480

tttcttgtag cataactcat gcacgacttg ctccaaatgc tggcgttatc ttgaactgga    540

ttgctattga tgttttttcc tgttcttttt ttcaggagct tgtgagttca gtcaaaaatg    600

tgcttccttg gttacaagcg gttctgtcgt tggaaagacc gacggtcaca ctattcatcc    660

gcgctgtgat tttgattgtc aaatacaagt aagttgtacc ctgaaatgat acggttgtta    720

cctttggtta tataaccttt tatgctcaag ctatttagta ctcggttcta aataaaaaaa    780

aatcacacta ttttatttag gatcagctac attgaactta tttcaaatta caatcaaagt    840

gtattcgtcc attgctatca tgctagggca ataatcacct tgtcattcaa cagggaaatg    900

gttggatttg caattgcaat gattgcacta ttactagttg cagcgatact ttgggccaga    960

gtgaatggaa ttggagaaag atgccgagag attgttgtgg acaccacctt tgatcaaaca   1020

atgatggaaa gcatcgttgc agcccagcac agtctgaata acttgcatga gctcgttaag   1080

gaaactaata tcacgatttt gagaatattc tcgataataa tcggaaaggc tccaaaggta   1140

ctgtttcaaa acatccaatt cctccacgac tctctcccaa catttaacag agctattgtc   1200

atatctacag caagctaatg atgtgatgtg ggcaatgatt gcagtagcag tcctgttggt   1260

ggtaatcccg ttcaagtata ttgttatggg gctaactttg tacttgttca tagctaattc   1320

aaggattgcg aagcgcatgt tgaaccaaca gggaaatcga cggctgaaag agtggtggga   1380

gtcgatccct gtcattccag ttcgaacagt gagcagtagt ccttgataga aatggtaaga   1440

ctgatttggg aaaaggtgaa acgatagtct gtttatgaaa cttactgcct catcagcttt   1520

tcttttcaca attgaatttt gcttcatcat ggttttctgt tccttcaatt ctaagttctc   1580

tgtagttttt ttttctttgt gtgcgctcat gtaatcgtct catacgtgca tgttacaagt   1640

atccttgcaa ttttggtcac ccctcgagta aaacttacat aaatcaatat gtagcttgtt   1700

gtaccttgta gagtggcctt tttttttttt cataatttaa aagaagacgg tgttcaattt   1760

gaatcgaatg gtgtactgta atcatcctta taatgacatc tacgcccaaa tccacacgac   1820

aactctgacc tcatcgggta cgattacgaa ctatgaagga caaggctcga aagtagtgat   1880

cgtgtaggtt tattgcaaaa tgaaagaaga agattcaagg tcaggacttg aagttgaaat   1920

tg                                                                  1922

 

<210>  3

<211>  320

<212>  DNA

<213>  p-320

<400>  3

atacgtgcat gttacaagta tccttgcaat tttggtcacc cctcgagtaa aacttacata     60

aatcaatatg tagcttgttg taccttgtag agtggccttt tttttttttc ataatttaaa    120

agaagacggt gttcaatttg aatcgaatgg tgtactgtaa tcatccttat aatgacatct    180

acgcccaaat ccacacgaca actctgacct catcgggtac gattacgaac tatgaaggac    240

aaggctcgaa agtagtgatc gtgtaggttt attgcaaaat gaaagaagaa gattcaaggt    300

caggacttga agttgaaatt                                                320

  

<210>  4

<211>  781

<212>  DNA

<213>  p-780

 <400>  4

ctgtttcaaa acatccaatt cctccacgac tctctcccaa catttaacag agctattgtc     60

atatctacag caagctaatg atgtgatgtg ggcaatgatt gcagtagcag tcctgttggt    120

ggtaatcccg ttcaagtata ttgttatggg gctaactttg tacttgttca tagctaattc    180

aaggattgcg aagcgcatgt tgaaccaaca gggaaatcga cggctgaaag agtggtggga    240

gtcgatccct gtcattccag ttcgaacagt gagcagtagt ccttgataga aatggtaaga    300  

ctgatttggg aaaaggtgaa acgatagtct gtttatgaaa cttactgcct catcagcttt    360

tcttttcaca attgaatttt gcttcatcat ggttttctgt tccttcaatt ctaagttctc    420

tgtagttttt ttttctttgt gtgcgctcat gtaatcgtct catacgtgca tgttacaagt    480

atccttgcaa ttttggtcac ccctcgagta aaacttacat aaatcaatat gtagcttgtt    540

gtaccttgta gagtggcctt tttttttttt cataatttaa aagaagacgg tgttcaattt    600

gaatcgaatg gtgtactgta atcatcctta taatgacatc tacgcccaaa tccacacgac    660

aactctgacc tcatcgggta cgattacgaa ctatgaagga caaggctcga aagtagtgat    720

cgtgtaggtt tattgcaaaa tgaaagaaga agattcaagg tcaggacttg aagttgaaat    780

t                                                                    781

 

<210>  5

<211>  1921

<212>  DNA

<213>  p-1928

<400>  5

 tactgataag ataagttgcg ctttccctgc atatgaaata gtggccttcg gccacgccgt     60

gaccctctgg gtaagcgagt ctagaagtgt gctgtagtta gagattttga gtttctggga    120

ggcaatggga atgcccaggt atctgaaagg catgtcccct atctggaatc cagtgatggt    180

caaaagctgt tcccgtgtct gagtatctat ccctgtcatg tagatgttgg acttagctat    240

attggccatg aggcttgcta tatgagtaaa ctgtgataag cagtcaacta gctgagtcac    300

cgaagatatg tcctctctgg atagcaagag caggtcatct gcatagatca agtacactat    360

cctaagatgc caaaagctac tgtcgaacag atgaaaggag gaggaattgc gaatagtctt    420

cttgttctag ttgtaagatg tctgaactct catttacttg taattttttc tttcaaattt    480

tttcttgtag cataactcat gcacgacttg ctccaaatgc tggcgttatc ttgaactgga    540

ttgctattga tgttttttcc tgttcttttt ttcaggagct tgtgagttca gtcaaaaatg    600

tgcttccttg gttacaagcg gttctgtcgt tggaaagacc gacggtcaca ctattcatcc    660

gcgctgtgat tttgattgtc aaatacaagt aagttgtacc ctgaaatgat acggttgtta    720

cctttggtta tataaccttt tatgctcaag ctatttagta ctcggttcta aataaaaaaa    780

aatcacacta ttttatttag gatcagctac attgaactta tttcaaatta caatcaaagt    840

gtattcgtcc attgctatca tgctagggca ataatcacct tgtcattcaa cagggaaatg    900

gttggatttg caattgcaat gattgcacta ttactagttg cagcgatact ttgggccaga    960

gtgaatggaa ttggagaaag atgccgagag attgttgtgg acaccacctt tgatcaaaca   1020

atgatggaaa gcatcgttgc agcccagcac agtctgaata acttgcatga gctcgttaag   1080

gaaactaata tcacgatttt gagaatattc tcgataataa tcggaaaggc tccaaaggta   1140

ctgtttcaaa acatccaatt cctccacgac tctctcccaa catttaacag agctattgtc   1200

atatctacag caagctaatg atgtgatgtg ggcaatgatt gcagtagcag tcctgttggt   1260

ggtaatcccg ttcaagtata ttgttatggg gctaactttg tacttgttca tagctaattc   1320

aaggattgcg aagcgcatgt tgaaccaaca gggaaatcga cggctgaaag agtggtggga   1380

gtcgatccct gtcattccag ttcgaacagt gagcagtagt ccttgataga aatggtaaga   1440

ctgatttggg aaaaggtgaa acgatagtct gtttatgaaa cttactgcct catcagcttt   1520

tcttttcaca attgaatttt gcttcatcat ggttttctgt tccttcaatt ctaagttctc   1580

tgtagttttt ttttctttgt gtgcgctcat gtaatcgtct catacgtgca tgttacaagt   1640

atccttgcaa ttttggtcac ccctcgagta aaacttacat aaatcaatat gtagcttgtt   1700

gtaccttgta gagtggcctt tttttttttt cataatttaa aagaagacgg tgttcaattt   1760

gaatcgaatg gtgtactgta atcatcctta taatgacatc tacgcccaaa tccacacgac   1820

aactctgacc tcatcgggta cgattacgaa ctatgaagga caaggctcga aagtagtgat   1880

cgtgtaggtt tattgcaaaa tgaaagaaga agattcaagg tcaggacttg aagttgaaat   1920                                                                                 

t                                                                   1921                                                          

                                                                  

<210>  6

<211>  30

<212>  DNA

<213>  引物sp1

 <400>  6

cggatatcat gggagcacag atagtagtgc                                      30

 

 <210>  7

<211>  34

<212>  DNA

<213>  引物sp2

<400>  7

ctacacgat cactactttg gagccttgtc cttc                                 34

  <210>  8

<211>  39

<212>  DNA

<213>  引物sp3

<400>  8

atgagg tcagagttgt cgtgtggatt tgggcgtag                            39

 

<210>  9

<211>  18

<212>  DNA

<213>  引物LAD-1

<400>  9

acgatggact ccagagcggc cgcvnvnnng gaa                                  18

 

<210>  10

<211>  18

<212>  DNA

<213>  引物LAD-2

<400>  10

acgatggact ccagagcggc cgcbnbnnng gtt                                  18

  

<210>  11

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物LAD-3

 <400>  11

acgatggact ccagagcggc cgcvvnvnnn ccaa                                 19

 

<210>  12

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物LAD-4

<400>  12

acgatggact ccagagcggc cgcbdnbnnn cggt                                 19

<210>  13

<211>  16

<212>  DNA

<213>  引物AC1

 <400>  13

acgatggact ccagag                                                     16

 

<210>  14

<211>  32

<212>  DNA

<213>  引物p-320-F

<400>  14

ggccaagctt atacgtgcat gttacaagta tc                                   32

 

<210>  15

<211>  34

<212>  DNA

<213>  引物p-780-F

<400>  15

ggccaagctt ctgtttcaaa acatccaatt cctc                                 34

 

<210>  16

<211>  28

<212>  DNA

<213>  引物p-1928-F

<400>  16

ggccaagctt actgataaga taagttgc                                        28

 

<210>  17

<211>  32

<212>  DNA

<213>  下游引物R

 <400>  17

ggcggatccc aatttcaact tcaagtcctg ac                                    32

<210>  18

<211>  33

<212>  DNA

<213>  TPS2启动子特异引物P1

<400>  18

ggcgagctcc tgtttcaaaa catccaattc ctc                                  33

 

<210>  19

<211>  32

<212>  DNA

<213>  TPS2启动子特异引物P2

<400>  19

ggccaagctt aatttcaact tcaagtcctg ac                                   32

  

<210>  20

<211>  24

<212>  DNA

<213>  潮霉素引物p1

<400>  20

cttctacaca gccatcggtc   caga                                          24

 

<210>  21

<211>  24

<212>  DNA

<213>  潮霉素引物p2

<400>  21

gatgtaggag ggcgtggata tgtc                                            24

 

<210>  22

<211>  29

<212>  DNA

<213>  HcTPS1特异引物p1

 <400>  22

gcaactagta tgtctctctt ccaacctgc                                       29

<210>  23

<211>  32

<212>  DNA

<213>  HcTPS1特异引物p2

 <400>  23

gggcggatcc ttacaatagg atagggttga tc                                   32

 

<210>  24

<211>  540

<212>  DNA

<213>  潮霉素磷酸转移酶基因

<400>  24

tggtgtactg taatcatcct tataattaca tctacgccca aatccacacg acaactcgga     60

cctcatcggg tacgattacg aactatgaag gacaaggctc caaagtagtg atcgtgtaga    120

tttattgcaa aatgaaggaa gaagattcaa ggtcaggact tgaagttgaa attgatggca    180

aaatgcacta ctgtctgtgc tcccatgata tccgccctcc ctcgtcggcc gatgatcgtt    240

gctgctgtcg agcatcgagg cctgcagatg ttccggcgaa ctctgcaggt acgatcatgc    300

agtggcacta gtcatgtagc tcccttgcgg cggtcggcga attatcaacc aagcatatgg    360

acggacgagc gtgtgcaatc cctcacgagc gcctccacgg tgcaacaaga agagaatcgt    420

gagagaataa acgtactcaa ggagcatacc aggaatctga tacgcgagaa gcaacaagtt    480

gcagagcagc ttcaactaat cgaccacctg caacagctcg gcgtggcata ccacttcaaa    540