病原诱导启动子和组织特异性启动子的分离克隆和功能鉴定

摘要

基因的表达和调控是生物体内十分重要的机制之一,它是生物体代谢、发育、生殖等一系列生理活动的根本所在。基因的特异性表达决定了生物体的特异性,一直以来都是研究的热点。启动子是直接调控基因特异性表达的重要元件,它驱动基因的表达,决定了基因表达的强度、时间和空间等特异性。水稻中的OsWRKY13基因是一个受病原物,包括稻瘟菌和白叶枯菌,诱导表达的基因,同时可以在植物激素诱导的条件下产生应答,研究它的启动子对阐明基因功能,探索抗病途径具有极大的意义。而水稻光合系统Ⅱ中一个编码10kD多聚蛋白的基因,D540,具有绿色组织特异性的表达模式,研究其启动子对分析组织特异性表达的调控机制,预测基因的功能有着重要作用,同时利用组织特异性的启动子可以帮助解决转基因安全性的问题。
　　 利用筛选到的包含OsWRKY13基因编码区的cDNA克隆,我们得到了包含完整基因信息的基因组亚克隆。经过预测,我们截取了728 bp的启动子片段,命名为PWRKY13。经转基因分析,该启动子可以被病原物和激素所诱导表达。在5’-末端的缺失试验、凝胶阻滞和定点突变的分析中,我们得到了一系列新的调控病原物诱导表达的顺式作用位点。对这些位点进行的酵母单杂交分析得到了与之结合的蛋白质信息,通过对编码这些蛋白质的基因的分析,我们发现这些蛋白都具有病原物诱导的表达模式,并且在细胞核中发挥其功能,有些还具有核定位信号或DNA结合功能,这说明这些蛋白具有核转录调控因子的特征。
　　 同时还筛选到一个在绿色组织中表达,在胚和胚乳中不表达的cDNA克隆,它编码一个光合系统Ⅱ中的10kD多聚蛋白。我们分离了该基因约2.1kb的启动子区段,命名为PD54O。转基因植株证明该启动子特异性驱动外源基因在绿色组织中表达,而5’-末端的缺失导致了组织特异性表达谱的改变,同时伴随表达量的变化,说明了该启动子中含有调控组织特异性表达以及正或负调控基因表达量的顺式作用位点。通过凝胶阻滞的分析,我们确定了这些顺式作用位点,并采用定点突变的方法进行了验证。利用这些位点,通过酵母单杂交筛选到与之结合的转录调控蛋白,这些蛋白也被证明在不同组织中表达量存在很大差异,而且定位于细胞核中,推测这些蛋白可能具有转录调控的功能。
　　 研究得到的启动子资源可以有效地在植物的转基因育种中加以利用,更有效、更有针对性地表达外源基因,解决转基因育种中的安全性问题,是转基因育种的有力工具。而利用研究得到的顺式作用位点,我们在将来甚至可以按人们的要求,定制特异的启动子,为人们的生产谋利。

目录

文摘

英文文摘

第一章 病原诱导型启动子的分离和鉴定

1.前言

1.1 启动子概述

1.2 已克隆的启动子概述

1.3 研究启动子功能的技术方法

1.4 植物中的转录因子简介

1.5 植物中的WRKY基因家族概述

1.6 植物抗病的分子机理研究

2.研究的目的和意义

3.材料和方法

3.1 水稻材料和接种鉴定

3.2 基因组及cDNA文库

3.3 载体、菌株和质粒

3.4 DNA的抽提及Southern杂交

3.5 总RNA的抽提及操作

3.6 启动子序列分析

3.7 PWRKY13启动子全长和缺失片段的获得

3.8 农杆菌介导的遗传转化

3.9 GUS的定量及定性分析

3.10 激素处理

3.11 凝胶阻滞(gel retardation assay)

3.12 定点突变

3.13 酵母单杂交

3.14 蛋白质的亚细胞定位

3.14 蛋白的原核表达

4.结果与分析

4.PWRKY13启动子的结构

4.2 全长及截短启动子片段的表达模式

4.3 PWRKY13启动子上与病原诱导相关的顺式作用位点

4.4 鉴定的病原诱导响应位点对基因的表达具有正或负调控的作用

4.5 筛选PWRKY13调控位点上的结合蛋白及验证

4.PWRKY13调控位点上结合蛋白的表达模式

4.7 激素对PWRKY13启动子的效应

5.讨论

5.1 WRKY13是被一系列顺式和反式作用因子调控的

5.2 激素与PWRKY13启动子

5.3 PWRKY13启动子上的调控蛋白

5.4 PWRKY13启动子可能的调控模式

第二章 组织特异性启动子的分离和鉴定

1.前言

2.研究的目的和意义

3.材料和方法

3.1 PD540启动子全长与缺失片段的获得

3.2 其它载体构建

3.3 用于凝胶阻滞的探针

3.4 定点突变

3.5 实时定量PCR

3.6 酵母单杂交

3.7 亚细胞定位

3.8 蛋白的原核表达

3.9 转基因植株中Bt蛋白含量的测定

4.结果与分析

4.1 PD540及截短的启动子片段的表达模式

4.2 PD540启动子的结构特征

4.3 启动子缺失片段的组织表达模式

4.4 负调控组织特异性表达的启动子片段的功能验证

4.5 包含组织特异性调控顺式作用位点的DNA区段

4.6 PD540上调控组织特异表达的顺式作用位点

4.7 顺式位点的定点突变分析

4.8 PD540启动子驱动抗虫基因的表达

4.9 启动子上顺式作用位点的结合蛋白及其体外验证

4.10 PD540启动子上顺式位点上互作蛋白的表达模式

5.讨论

5.1 PD540包含调控组织特异表达的顺式作用位点

5.2 PD540启动子可能的调控模式

5.3 PD540启动子上的结合蛋白

5.4 PD540启动子的应用

5.5 启动子研究的方法

5.6 构建超级启动子

参考文献

附录1 :部分试验的详细步骤

附录2 :用于PWRKY13及PD540凝胶阻滞研究的探针

附录3 :已发表和待发表的论文、会议摘要及申请的专利

致谢