一株降解牛奶过敏原的地衣芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株降解牛奶过敏原的地衣芽孢杆菌，于2013年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013451，经发酵优化产酶活力达到3500U/ml。此菌株是从土壤中筛选得到,具体通过微生物的富集，目的菌株的分离，透明圈法筛选得到，利用SDS-PAGE验证菌株具有降解过敏原的效果。该菌株能够高效降解牛奶中主要过敏原αs1-酪蛋白，并通过纯化最终获得纯酶液，在一定时间内可以特异性降解牛奶过敏原，为制备脱敏奶粉提供了一种新的方法，同时有效地保护了牛奶中其他的营养成分。

说明书

技术领域

本发明涉及到一株降解牛奶过敏原的地衣芽孢杆菌及其应用，特别是牛奶过敏原αs1-酪 蛋白的地衣芽孢杆菌。

背景技术

牛奶含有丰富的营养物质，包括30多种蛋白，为酪蛋白和乳清蛋白。其中乳清蛋白主要 包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛乳血清白蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白等，这些蛋白都具 有潜在致敏性。目前普遍认为酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白是主要过敏原。

对大多数婴幼儿而言，由于生长发育初期需要补充大量的营养，牛奶就成为了营养摄入 的第一选择。但是在3岁以下的儿童中牛奶过敏反应达到25%，其中酪蛋白是牛奶中存在的 主要过敏原，约占牛奶总蛋白含量的80%，酪蛋白包含有αs1-(32%)，αS2-(10%)，β-(28%) 和κ-酪蛋白(10%)。由于母乳中不含有αs1-酪蛋白，因而其致敏性最强。目前如何降解牛奶中 的过敏原αs1-casein就成为了一个急需解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种优先降解牛奶过敏原的菌株CN1,命名为命名为 地衣芽孢杆菌Bacillus LicheniformisCN1，于2013年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏编号为CCTCC NO:M2013451，保藏地址为：中国武汉、武汉大学。

所述地衣芽孢杆菌能够降解牛奶过敏原αs1-酪蛋白。

用于培养权利要求1所述地衣芽孢杆菌的最佳培养基：可溶性淀粉3%（w/v），牛肉膏 0.6%（w/v），KH2PO40.05%（w/v）,K2HPO4.0.05%（w/v）pH9.0，最佳培养条件： 37℃下培养24h,接种量6%。

本发明还提供了一种应用所述地衣芽孢杆菌降解牛奶过敏原αs1-酪蛋白的方法，将所述 地衣芽孢杆菌发酵上清稀释后添加到2%的脱脂牛奶中。

优选方案为：将纯酶液稀释20倍后，以4%的比例添加到2%的脱脂牛奶中，在20min 内能够特异性降解牛奶过敏原αs1-酪蛋白。

分离所述地衣芽孢杆菌蛋白酶的方法，在地衣芽孢杆菌发酵培养后利用硫酸铵沉淀、疏 水柱Phenyl-FF、10KDa超滤管超滤获得一定纯度的蛋白酶。

所述蛋白酶专一性降解牛奶过敏原αs1-酪蛋白。

使用本发明提供的菌株发酵24h后酶活可以达到3500U/mL。

本发明将发酵液中目的酶进行纯化的方法也属于保护的内容。其中纯酶对牛奶过敏原 αs1-酪蛋白的降解效果更为明显，特异性降解牛奶过敏原αs1-酪蛋白。

附图说明

图1为将发酵上清液稀释20倍后以8%的比例添加到含2%的脱脂牛奶中定时反应后取样进 行SDS-PAGE图（1:2%的脱脂牛奶，2—8反应时间在5min、10min、20min、30min、40min、 50min、60min后高温终止反应）。

图2为将纯酶液稀释20倍后以4%比例添加到含2%的脱脂牛奶中定时反应后取样进行 SDS-PAGE图(1:2%的脱脂牛奶，2—8反应时间在5min、10min、15min、20min、25min、 30min、35min后高温终止反应)。

图3为地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列构建的进化树。

具体实施方式

实施例1特异性降解牛奶过敏原αs1-酪蛋白菌株的定性筛选

1、来源：菜园土壤中筛选

2、培养方法：将采样所得土壤10g,加入90ml无菌生理盐水，摇床（200rpm）震荡6h。

3、筛选：将土壤菌悬液稀释不同倍数后涂布脱脂牛奶平板上，37℃培养，选取可以产 生透明圈的菌株进行酪蛋白平板复筛，最终获得目的菌株，其16S rDNA分析结果确定为地 衣芽孢杆菌，命名为CN1。

实施例2蛋白酶酶活测定

1、L-酪氨酸标准曲线的绘制

L-酪氨酸标准溶液：按表1配制

表1

分别取上述溶液各1.00mL（须做平行试验），各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL，福林试 剂使用液1.00mL，置于60±0.2℃水浴中显色20min，用分光光度计于波长660nm，5mm比 色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓 度C为横坐标，绘制标准曲线。

2、发酵上清液酶活测定

酶液适当稀释。取4只试管编号为1、2、3、4。其中1号试管为对照。将2%酪蛋白溶 解在pH10.0的四硼酸钠-氢氧化钠缓冲液中，然后在60℃下预热5min。首先将已预热的酶 液加入到4只试管中，然后1号试管加入2mL0.4moL/L的三氯乙酸，2、3、4号试管中各 加入1ml预热后的酪蛋白，准确计时10min后，在1号试管中加入1ml预热后的酪蛋白，2、 3、4号试管中各加入2mL0.4moL/L的三氯乙酸，常温下放置10min后离心取上清，取4 只试管，将上述反应液上清各取1mL后加入到对应的试管中，4只试管中分别依次加入5mL 0.4moL/L的碳酸钠，以及1mL的福林酚在60℃下保温20min后，用分光光度计波长660nm 处，用5mm比色皿测定其吸光度值。对照标准曲线，计算出L-酪氨酸的含量。

实施例3发酵液经纯化后的蛋白酶对牛奶过敏原的降解

1、蛋白酶的纯化

发酵液在4℃经8000rpm离心30min后获得发酵上清，加入硫酸铵粉末，使得发酵上 清硫酸铵饱和度达到40%,4℃8000rpm离心30min后收集上清，继续加入硫酸铵，使其终浓 度达到70%的饱和度，4℃下静止过夜，离心收集沉淀。并将沉淀溶解在含有1mol/L的pH7.0 的20mM的磷酸钠缓冲液中。利用疏水柱Phenyl-FF纯化，将溶解后的样品0.22um的滤膜 过滤后进行梯度洗脱。其中洗脱条件为：平衡液：20mM的磷酸钠缓冲液，pH7.0；洗脱液： 含有1M硫酸铵的平衡液，pH7.0。收集20%-40%洗脱液洗脱下来的蛋白即为目的蛋白酶液， 然后将酶液用10KDa超滤管浓缩后获得目的蛋白酶。

2、纯酶液对牛奶过敏原αs1-酪蛋白的降解

将目的蛋白酶稀释20倍后以4%比例添加到2%的脱脂牛奶中反应不同时间后，高温终 止反应，利用SDS-PAGE验证对牛奶过敏原的降解。结果显示，20min内优先降解牛奶过敏 原αs1-酪蛋白。

实施例4发酵液对牛奶过敏原的降解

发酵液在4℃经8000rpm离心30min后获得发酵上清，将发酵上清稀释20倍后以4% 比例添加到2%的脱脂牛奶中反应不同时间后，高温终止反应，利用SDS-PAGE验证对牛奶 过敏原的降解。结果显示，20min内优先降解牛奶过敏原αs1-酪蛋白。