一种利用自组装技术制备紫杉醇缓释微球的方法及其产品

摘要

本发明涉及一种利用自组装技术制备紫杉醇缓释微球的方法及其产品，所述方法包括：制备壳聚糖微球自组装模板，利用带不同电荷聚电解质间的静电作用，将硫酸钠葡聚糖和壳聚糖自组装在壳聚糖微球表面形成复合载药微球。本发明的紫杉醇复合载药微球制备中由于采用超声乳化手段结合特定油相，因此得到的微球呈规则的球形形貌，且达到纳米级粒径，具有较高的包覆率，体外释放试验表明具有良好的缓释效果。该紫杉醇复合载药微球的制备工艺成本低、操作简单，易重复，可控性好，具有很好地应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用自组装技术制备紫杉醇缓释微球的方法，特别是一 种生物可降解高分子材料包覆紫杉醇载药微球及其制备方法。

本发明还涉及上述方法得到的紫杉醇缓释微球。

背景技术

紫杉醇(PTX)是从太平洋红豆杉属植物紫衫的树干和树皮中提取得到 的天然抗癌药，临床上主要用于卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、脑 部和颈部肿瘤的治疗。由于其在水中的溶解度小于1μg／mL，目前临床上多 由聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和无水乙醇(50：50，v／v)组成，使用 前用生理盐水或葡萄糖溶液稀释5-20倍，尽管在一定程度上增加了药物的 溶解度，但给药后患者存在严重的过敏反应、肾毒性、神经毒性、心脏毒性、 低血压等不良反应，使其临床应用受到限制。对不含聚氧乙烯蓖麻油，并能 提高PTX生物利用度的其他制剂的研究成为当前的研究热点，近年来，有研 究发现选择合适的载体可改善和解决紫杉醇的应用缺陷。

其中，报道最多的是以聚乳酸及其共聚物为载体制备微球制剂。He TX 用溶剂蒸发法制备PLLA载紫杉醇单分散微球，该微球提高了药物的生物利 用度并延长了药物释放时间，但在开始3h存在突释现象(Microfluid  Nanofluid，2011，10：1289)。薛静采用乳化-溶剂挥发法用PLGA包裹紫杉 醇，通过正交试验制备粒径217.6nm的载药纳米粒，载药量仅有1.79％，且 有明显的突释现象(中国组织工程研究与临床康复，2010，14：7824)。Kang  YQ用超临界流体技术制备了PLLA载紫杉醇微球，微球呈椭球状表面很光滑， 但粒径分布不均，微球的载药率较低14.33％，微球在前30min内存在突释 现象(Langmuir2008，24：7432)。

上述紫杉醇载药微球的报道中均存在释药初期的突释问题，可能导致人 体内的血药浓度接近或超过中毒水平，产生明显的毒副作用。并且现有技术 中的微球粒径较大，且分布较宽，不能够持续长时间释放有效成分。

层一层自组装技术是利用逐层交替沉积的方法，借助各层分子间的弱相 互作用(如静电引力、氢键、配位键等)，使层与层自发地缔合形成结构完整、 性能稳定、具有某种特定功能的分子聚集体或超分子结构的过程，将此方法 用于制备载药微球的显著优越性在于能够在纳米尺度上对微球的大小、组 成、结构、形态和囊壁厚度进行精确的控制。而在自组装技术中由于其电荷 作用，导致物料的分散经常出现问题，因此可能会导致潜在的团聚从而使得 制备的微球粒径较大，分散不均匀。

发明内容

本发明是为了解决现有技术中的上述不足而完成的，本发明的目的是提 供一种自组装技术制备紫杉醇缓释微球的方法，其利用自组装技术制备载药 微球，并实现药物的可控缓慢释放。有效解决了现有技术中紫杉醇载药微球 释放初期的突释导致人体内血药浓度接近或者超过中毒水平，产生明显毒副 作用的问题。同时本发明采用超声乳化手段，并选取特定油相使得最终得到 的微球具有纳米级粒径，并且粒径分布均匀。同时本发明还提供上述方法所 制备得到的紫杉醇缓释微球。

本发明的技术方案如下所述：

本发明利用自组装技术制备紫杉醇缓释微球的方法，其特征在于包括以 下步骤：

1)自组装模板的制备：

步骤1：称取0.025g-0.01g壳聚糖，加入到10mL的稀酸溶液中，搅拌 至壳聚糖完全溶解，然后加入0.0025g-0.01g紫杉醇药物作为水相；量取 25ml-125mL的液体石蜡作为油相；

步骤2：将水相滴入油相中，然后超声乳化1-2min，得到分散均匀的油 包水型乳液，再滴入1-2mL的浓度37wt％的戊二醛溶液，持续搅拌30-40min， 使其充分交联后离心分离，沉淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12小 时，得到带正电荷的壳聚糖载药微球；并将其作为下述自组装过程的模板；

2)自组装紫杉醇缓释微球制备：

步骤3：将上述带正电荷的壳聚糖载药微球置于10mL浓度为2wt％的聚 阴离子硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心分离清洗； 利用两种带相反电荷的聚电解质物质间的静电引力作用自组装形成该模板 微球外的第一层膜；

步骤4：再次重复上述步骤3两次后冷冻干燥后得到紫杉醇缓释微球， 所述微球的平均粒径为约200nm-700nm。

所述的利用自组装技术制备紫杉醇缓释微球的方法，其特征在于：所述 稀酸溶液选自乙酸、甲酸、或丙酸，其浓度为1wt％。

所述的利用自组装技术制备紫杉醇缓释微球的方法，其特征在于：所述 微球平均粒径为约300nm-600nm。

本发明还提供一种上述方法制备得到的紫杉醇缓释微球。

本发明的自组装过程中，步骤3可以根据实际需要进行多层自组装，以 调节其释放速度。更方便用于设计不同需求的颗粒载体。

本发明中如无特殊说明，所有百分比均为重量百分比。

由于本发明制备得到的紫杉醇缓释微球是在壳聚糖载药微球表面包覆 了多层硫酸钠葡聚糖外层，因此本发明的紫杉醇缓释微球是一种紫杉醇复合 载药微球，其具有核壳复合结构。

本发明的自组装原理如下：由于壳聚糖是一种带正电的天然高分子多 糖，本发明中利用与其带相反电荷的硫酸钠葡聚糖之间的静电作用力，通过 自组装作用在载药微球模板上形成多层膜，从而使吸附在微球表层薄弱环节 的紫杉醇进一步包覆，可以降低药物的初始释放速度，减小毒副作用，提高 药物的使用安全性。

附图说明

图1是本发明实施例5的紫杉醇复合载药微球成品冻干后的电子显微镜 照片。

图2是本发明实施例8的紫杉醇复合载药微球与对比例1的壳聚糖载药 微球在37℃条件下的体外释放曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和对比例对本发明进行详细说明，下述实施例仅用来对 说明书的详细解释，并不作为对于本发明的限制。

实施例1

称取0.025g壳聚糖加入10mL浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加 入0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入25mL液体石蜡中，超声乳化2min， 在磁力搅拌下加入1mL戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10mL浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液。在得到的产物中再次加 入10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离 心分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液。再次在得到的产物中 再次加入10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min 后离心分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，冷冻干燥后得到 淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪测试微球的粒 径，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其包囊率，结果 见表1。

实施例2

称取0.025g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加 入0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入75ml液体石蜡中，超声乳化2min， 在磁力搅拌下加入1m1戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷 冻干燥后得到淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪 测试微球的粒径，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其 包囊率，结果见表1。

实施例3

称取0.025g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加 入0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入125ml液体石蜡中，超声乳化2min， 在磁力搅拌下加入1ml戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷 冻干燥后得到淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪 测试微球的粒径，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其 包囊率，结果见表1。

实施例4

称取0.025g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加 入0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入25ml液体石蜡中，超声乳化lmin， 在磁力搅拌下加入1ml戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷 冻干燥后得到淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪 测试微球的粒径，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其 包囊率，结果见表1。

实施例5

称取0.1g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加入 0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入25ml液体石蜡中，超声乳化2min， 在磁力搅拌下加入1ml戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷 冻干燥后得到淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪 测试微球的粒径，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其 包囊率，结果见表1。

实施例6

称取0.05g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加入 0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入25ml液体石蜡中，超声乳化2min， 在磁力搅拌下加入1ml戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷 冻干燥后得到淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪 测试微球的粒径，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其 包囊率，结果见表1。

实施例7

称取0.025g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加 入0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入50ml液体石蜡中，超声乳化2min， 在磁力搅拌下加入2ml戊二醛，45min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷 冻干燥后得到淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪 测试微球的粒径，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其 包囊率，结果见表1。

实施例8

称取0.05g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加入 0.0lg紫杉醇药物作为水相，将其滴入50ml液体石蜡中，超声乳化2min， 在磁力搅拌下加入1ml戊二醛，45min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷 冻干燥后得到淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪 测试微球的粒径，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其 包囊率，结果见表1。

对比实施例1(壳聚糖载药微球)：采用非自组装技术装备壳聚糖载药 微球。

称取0.025g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加 入0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入25ml液体石蜡中，超声乳化2min， 在磁力搅拌下加入1ml戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉 淀物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。采用Zano  ZS激光粒度仪测试该微球的粒径为430.5nm，采用紫外分光光度计测试药 物的吸光度，根据公式计算其包囊率为6.58％。

对比实施例2(未采用超生乳化)

称取0.025g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加 入0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入25ml液体石蜡中，在磁力搅拌下 加入1ml戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉淀物用石油醚 洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入10ml浓度为 2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心分离清洗后加 入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷冻干燥后得到 淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪测试该微球的 粒径为5380nm，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根据公式计算其 包囊率为4.19％。

对比实施例3(采用石蜡以外的物质作为油相)

称取0.025g壳聚糖加入10ml浓度为1％乙酸溶液中，搅拌至溶解，加 入0.025g紫杉醇药物作为水相，将其滴入乙醇油相中，超声乳化2min，在 磁力搅拌下加入1ml戊二醛，30min后交联结束，2500rpm离心分离，沉淀 物用石油醚洗涤三次后真空冷冻干燥12h得到壳聚糖载药微球。将其加入 10ml浓度为2％的硫酸钠葡聚糖乙酸溶液中，25℃下超声振荡30min后离心 分离清洗后加入10ml浓度为2％的壳聚糖乙酸溶液，重复上述过程两次。冷 冻干燥后得到淡黄色白色粉末为复合载药微球。采用Zano ZS激光粒度仪 测试该微球的粒径为2630nm，采用紫外分光光度计测试药物的吸光度，根 据公式计算其包囊率为3.25％。

缓释性能对比试验：

分别取上述对比实施例1和实施例8中的壳聚糖微球50mg加入100ml  PBS缓冲液中，在水浴恒温振荡器中37℃进行药物缓释性能的对比试验。间 隔一段时间后取1ml样品测试紫外吸光度，对比药物的标准曲线得到浓度 值。每次取样后都需要向其中加入同等体积的缓冲液。将浓度值与时间作图 得到缓释曲线，如图2所示。对比两条曲线可以看出本发明产品的释放初期 的突释现象得到明显改善。

表1

表1中为各实施例和对比例得到的紫杉醇微球的平均粒径和包覆率，从 表1给出的数据可以看出，实施例1-8为本发明采用自组装技术制备得到的 壳聚糖紫杉醇缓释微球，其平均颗粒粒径均为纳米级别(289.5nm-675.7nm)， 其最小平均粒径为289.5nm。对比例2为未采用超声乳化的自组装技术制备 得到的微球的平均粒径为5380nm(5.38μm)，是实施例3中得到的微球粒 径的近20倍。对比例3为采用了超声乳化技术的自组装法，但是由于采用 了其它油相(非石蜡)，因此其得到的最终产物的粒径为2360nm(2.36μm)， 同样远大于实施例1-8得到的微球的平均粒径。因此当油相采用石蜡时，可 以促进分散效果，得到产品粒径更容易控制到均匀的范围内，并且能够得到 更小粒径的微球。

对比例1为未采用自组装技术制备的壳聚糖微球，由于其采用了超声乳 化以及石蜡作为油相，因此具有较好的平均粒径(430.5nm)，但是由于其 没有采用自组装技术，因此从图2的曲线可以看出，对比例1的壳聚糖微球 在前10小时的累积释放率就已经达到80％以上，而本发明实施例实施例8 的缓释微球带到80％以上累积释放率的时间是30小时以上。

由此可见在当选择特定油相同时结合超声乳化技术时能够得到纳米级 微球。这是因为当采用石蜡作为油相，由于其在水相中分散更好，并且通过 超声乳化进一步提高了其分散效果，因此在制备得到的多层微球粒径达到纳 米级别，并且分布均匀(参见图1)。而通过自组装的多层包覆有效解决了 药物的突释问题。

有益效果

从图1可以看出本发明的微球的形状为规则的圆形，其粒径分布均匀， 粒径大小在600nm左右。而从图2可以看出与壳聚糖载药微球对比可见，复 合载药微球表现为缓慢释放的特征，这样使得该成品在患者体内发挥疗效时 可以避免最初的突释带来的过高的血药浓度，在随后的长时间释放为保持一 定的有效浓度提供了保证，从而达到了长效缓释的抗肿瘤效果。因此采用本 发明的自组装方法制备的微球载体的粒径达到纳米级别，其具有更高的载药 量，并且增加了生物膜穿透性，同时由于其解决了突释问题，延长了释放时 间，这样药物能更好地发挥全身治疗或诊断作用，增强药物在病灶靶部位的 疗效。如肿瘤等病变部位的上皮细胞处于一种渗漏状态，由于纳米粒在体内 长循环，其装载的药物进入肿瘤等病变部位的机会增多，增加了对病变部位 的靶向性，宏观效果是明显改善疗效。并且由于本发明采用自组装技术使壳 聚糖纳米载药微球表面形成多层膜，并且可以根据需要结合药物的释放曲线 设计任意层数的复合载药微球，本发明由于使用了自组装技术，结合超声波 乳化交联技术，并选择了特定物质作为油相可以得到均匀的纳米粒径的微 球，其粒径分布窄，载药量高，释放时间长，与现有技术相比具有更好的缓 释效果，使用起来更具有优势。

上述仅对本发明中的几种具体实施例加以说明，但并不能作为本发明的 保护范围，凡是依据本发明中的设计精神所作出的等效变化或修饰或等比例 放大或缩小等，均应认为落入本发明的保护范围。