西洋参茎叶总皂苷和漏芦总甾酮组合物及其作用

摘要

本发明提供一种西洋参茎叶总皂苷和漏芦总甾酮的药物组合物，该组合物组成是：西洋参茎叶总皂苷和漏芦总甾酮4.0:1-5.0:1，组合物与药用赋形剂可制备成液体和固体的药物制剂。对两者最佳比例的有效部位复合物的药效学研究，包括对多种化学物质导致记忆障碍的影响、对脑缺血及脑缺血-再灌注损伤致动物学习记忆障碍的改善作用、对大鼠海马长时程突触增强现象的影响，促智作用机制研究和细胞分子生物学实验,可在制备治疗阿尔茨海默病和血管性痴呆的药物中的应用。本发明的组合物将两种有效部位合用，作用比单用其中任何一种显著增强，也显著强于两种药材的常规水煎液。

说明书

技术领域

本发明属于天然药物组合物，尤其涉及西洋参茎叶总皂苷和漏芦总甾酮组合 物及其在制备防治血管性痴呆药物中的应用。

背景技术

中医西洋参有“滋补强壮，养阴生津，宁神益智，除烦降火”，中药漏芦具 有“清热解毒，舒筋通脉”，久服能“延年益寿，耳聪目明”作用。近代国内外 研究报道已阐明人参中抗衰老抗疲劳提高学习记忆的主要活性成分是人参皂苷， 漏芦中降血脂、防治动脉粥样硬化、清除体内自由基、免疫调节、抗缺氧、改善 学习记忆、延缓衰老及预防老年病的主要活性成分是植物甾酮类成分。最近，在 临床上应用人参和漏芦为主要组成的方剂作为抗衰老制剂对与衰老关系密切的 常见病和多发病存在明显的预防和治疗作用。

在分别对西洋参各部位（根、茎叶、果实）和漏芦的系统研究中，发现了西 洋参茎叶总皂苷作用最强，而且找出了其中含量较高，作用最显著的有效单体 PF₁₁，在漏芦中发现了其主要活性成分为漏芦甾酮，其代表性成分是β-蜕皮甾 酮。根据两者的作用机制不同，药效作用互补，我们对二者的复合物进行了药效 学试验，发现了二者的增效作用。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种西洋参茎叶中提取有效成分-总皂苷和 中药漏芦中提取的有效成分-漏芦总甾酮两种多分子复合物，其重量比为 4.0:1-5.0:1。经过系统的药理及作用机制、药效成分等研究证明其抗衰老、增强 学习记忆、对血管性痴呆有增效作用。在临床上可作为抗衰老制剂及与衰老密切 相关的常见病和多发病有预防和治疗作用。

所述的组合物可以与药学上可接受的药用赋性剂制备的制剂形式，主要包括 液体制剂和固体制剂。固体制剂主要包括颗粒剂、片剂、胶囊剂（含软胶囊）、 滴丸剂。液体制剂主要包括口服液体制剂和注射液体制剂。

所述制剂的给药形式主要包括口服给药或非肠道给药，优选口服给药。

本发明的另一个目的是提供该组合物在制备治疗阿尔茨海默病和血管性痴 呆的药物中的应用。

试验结果表明，本发明的组合物对抗衰老、增强学习记忆、对血管性痴呆有 增效作用。

本发明的有益效果是：

1.该组合物基于中医药理论，参考循证医学资料，选用了两种药材中具有宁神 益智、舒缓通脉、延年益寿之功效的有效部位组合，因此具有我国独特的经 历了长期用药证实的治疗作用理论基础，并能获相得益彰的作用。

2.该组合物在制备用于治疗和改善阿尔茨海默病和血管性痴呆药物中应用，可 解决该类疾病治疗中，明显缺乏疗效肯定、不良反应轻微、用药方便的药物 的问题。

3.采用多种经典的生物评价系统，在细胞水平和基因水平证实组合物药物在治 疗上述疾病中具有多层次、多靶点作用的依据。

4.经动物药效学实验证明，该组合物具有以下作用：

1)对脑缺血及脑缺血—再灌注损伤致动物学习记忆障碍的改善作用

2)对脑缺血损伤的保护作用

3)促智作用

5.经拆方研究，组合物将两种有效部位合用，比单一其中任何一种作用显著增 强，并非简单作用叠加。该组合物的上述作用显著强于两种药材的常规水煎 液。本组合物毒理作用研究结果表明，两种有效部位合用的小鼠急性毒性研 究结果，与单用其中任何一种相仿，均未见出现死亡和明显的中毒症状。

6.本发明从西洋参和漏芦药材中提取有效部位西洋参茎叶总皂苷和漏芦甾酮， 各达到＞50％以上，并获得用于治疗阿尔茨海默病和血管性痴呆的两种有效 部位最佳配比，可用于研制6类以上中药新药，拓展了单一药物用途。

具体实施方式

实施例1本发明西洋参茎叶总皂苷（S）和漏芦甾酮（L）的制备方法

（1）称取西洋参茎叶粉末(20-40目)，加7倍量50%—60%乙醇回流提取3次， 每次2小时，合并滤液，减压浓缩至一定体积，得上柱溶液。吸取该溶液上 Sephadex LH-20柱，用8倍量70%—90%乙醇洗脱，分段收集洗脱液。洗脱液 水浴挥干，减压浓缩，真空干燥，称重并测定总皂苷含量，含量大于85%。

（2）称取漏芦粉碎的原料(20-40目)，加乙醇回流提取3次，每次1小时，合并 滤液，减压浓缩至一定体积，得上柱溶液。吸取该溶液上大孔树脂DM130→蒸 馏水洗脱杂质→30%（浓度）洗脱杂质→90%（浓度）洗脱有效成分，洗脱液挥 干，减压浓缩，真空干燥，称重并测定总皂苷含量，含量大于80%。

实施例2S及L最佳剂量的确定

（1）S及L对东莨菪碱（SCPL）致大鼠记忆获得障碍的改善作用

试验方法：取健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2g，随机分为正常对照组、 模型对照组、S20、10、5、2.5mg·kg^-1,L3.2、2.4、1.2、0.6mg·kg^-1，尼莫地平（nimo） 30mg·kg^-1组。给药组分别灌服药物，正常对照组和模型对照组灌服等容积蒸馏 水，连续给予5天，在末次给药后60min，除正常对照组腹腔注射生理盐水外， 其余各组均腹腔注射SCPL3mg·kg^-1，10min后进行跳台法训练，24h后测试，记 录5min内小鼠的跳下潜伏期、错误次数和总电击时间。

试验结果：与正常对照组比较，模型对照组测试阶段错误次数显著增加。S20、 10mg·kg^-1剂量组、L3.2mg·kg^-1剂量组以及nimo组与模型对照组相比错误次数 显著减少。

（2）S及L对小鼠急性脑缺血的保护作用

试验方法：取健康昆明种小鼠、雌雄各半，体积20±2g，随机分为正常对照组、 模型对照组、S20、10、5、2.5mg·kg^-1,L3.2、2.4、1.2、0.6mg·kg^-1,nimo30mg·kg^-1组。给药组分别灌服不同剂量的S及L，正常对照组和模型对照组灌服等容积蒸 馏水，连续给予5天，在末次给药后60min进行急性脑缺血实验。

试验结果：S20mg·kg^-1剂量组，L3.2mg·kg^-1剂量组及nimo组与正常对照组相比 均显著延长双侧颈总动脉结扎小鼠存活时间。

实施例3S和L的处方确定

（1）S和L中S与L剂量的优化选择

试验方法：采用两因素四水平的正交实验设计，以S、L为两因素，S四个水平 分别为20、15、10、5mg·kg^-1，L四个水平分别为3.2、2.4、1.2、0.6mg·kg^-1。

取健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重20士2g，随机分为正常对照组、模型 对照组、S20/L3.2mg·kg^-1、S20/L2.4mg·kg^-1、S20/L1.2mg·kg^-1, S20/L0.6mg·kg^-1、S15/L3.2mg·kg^-1、S15/L2.4mg·kg^-1、S15/L 1.2mg·kg^-1、S15/L0.6mg·kg^-1、S10/L3.2mg·kg^-1、S10/L2.4mg·kg^-1、 S10/L1.6mg·kg^-1、S10/L0.8mg·kg^-1、S5/L3.2mg·kg^-1、S5/L2.4 mg·kg^-1、S5/L1.2mg·kg^-1、S5/L0.6mg·kg^-1组。给药组分别灌服不同 剂量组合的SL，正常对照组和模型对照组灌服等容积蒸馏水，连续给予5天， 在末次给药后60min，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组均腹腔注 射SCPL3mg·kg^-1，10min后进行跳台法训练。24h后测试，记录5min内小鼠 的跳下潜伏期、错误次数和总电击时间。以其在跳台法中的错误次数为指标，并 用方差分析法对各因素及水平进行分析，以考察各因素的主次及各水平的优劣。 试验结果：S,L分别以A.B代表，四个水平分别以1,2,3.4代替，按照正 交设计进行正交实验，结果进行方差分析。以SCPL致记忆获得障碍模型小鼠在 跳台法中测试阶段错误次数为指标，结果表明:S以及L对药效均有显著影响， 优化剂量组合为S第二水平S2,15mg·kg^-1以及L第一水平L1,3.2mg·kg^-1。

（2）S和L对SCPL致小鼠记忆获得障碍的改善作用

试验方法：取健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2g，随机分为正常对照组、 模型对照组、SL高(S30/L6.4mg·kg^-1)、SL中(S15/L3.2mg·kg^-1).SL 低(S7.5/L1.6mg·kg^-1)、S15mg·kg^-1、L3.2mg·kg^-1、nimo30mg·kg^-1组，给药组分别灌服药物，正常对照组和模型对照组灌服等容积蒸馏水，连续给 予5天，在末次给药后60min，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组 均腹腔注射SCPL3mg·kg^-1，10min后进行跳台法训练。24h后测试，记录5min 内小鼠的错误次数。采用代数和相加法，以Q值为指标对复方与单味药物药效进 行比较，Q值大于1表示合用效果大于单方效果之和。Q值计算公式如下:

Q=E_A+B/(E_A+E_B-E_A*E_B)

其中E_A+B表示两药合用后的效果，E_A、E_B分别为表示两药单独使用时的效果。

表1SL在跳台试验中对SCPL致小鼠记忆获得障碍的影响

P<0.01vs.normal;P<0.05，P<0.01vs.model

试验结果：与正常对照组相比，模型对照组测试阶段错误次数显著增加，SL高、 中剂量组与模型对照组相比错误次数显著减少，采用代数和相加法(Q50法)，Q 值大于1表示合用效果大于单方效果之和。根据公式计算得Q为1.49，说明合 用效果优于单方效果之和。

实施例4S和L对血管性痴呆的改善作用S和L对反复缺血再灌致小鼠学 习记忆障碍模型的改善作用

试验方法：取健康昆明种小白鼠，体重20±2g，雌雄各半，随机分组，除正常 对照组、模型对照组、假手术组给予蒸馏水外，其余各组分别给予药物SL高(S 30/L6.4mg·kg^-1),SL中(S15/L3.2mg·kg^-1)、SL低(S7.5/L1.6mg·kg^-1)、 S15mg·kg^-1、L3.2mg·kg^-1、nimo30mg·kg^-1。连续给药5天，第5天给药 后1h进行手术，手术前在小鼠清醒状态下测定其肛温，之后腹腔注射阿托品(2 mg·kg^-1)，5min后腹腔注射乌拉坦(1200mg·kg^-1)麻醉，背位固定。分离双侧 颈总动脉(不包括迷走神经)，用无创动脉夹夹闭，并即刻剪尾放血0.3m1。断 血两次，每次15min，中间间隔10min，然后缝合肌肉皮肤。假手术组不夹闭 不放血，其他操作同模型对照组，正常对照组不进行任何手术操作。手术完毕后 测肛温，48h后继续给予药物，连续给药至实验全部结束。从第7天开始，每 天给药1h后开始实验。术后第7天，进行小鼠自发活动实验。第8、9天进行跳 台法实验。第10～13天进行小鼠水迷宫实验，第14～16天继续给药，第17天 给予药物后取脑，测定NO含量、总NOS,iNOS活性及SOD活性。

试验结果：

1)小鼠肛温的变化：小鼠脑缺血后，首先出现体温下降，呼吸减慢。实验动物 以体温降低为缺血阳性指标，无典型缺血者弃之不用。假手术组动物体温有 所下降，可能由应用麻醉剂引起;各组动物体温与假手术组相比较均显著降 低，提示脑缺血手术成功。

2)小鼠自发活动变化：与正常对照组比较，各组小鼠走格数均有所减少，假手 术组与正常对照组相比，未见显著差异:模型对照组与假手术组比较，亦未 见显著差异，提示脑缺血对自发活动无显著影响。给药各组与模型对照组比 较，未见显著差异。提示S,L.SL及nimo对小鼠自发活动无显著影响。

3)小鼠跳台实验：与正常对照组比较，假手术组小鼠测试阶段的潜伏期无显著 性变化，提示手术的施行不影响动物的学习记忆能力。与假手术组比较，模 型对照组测试阶段的潜伏期显著缩短，提示脑缺血导致了小鼠学习记忆障碍; 与模型对照组比较，SL高、中剂量组及nimo组测试阶段潜伏期显著延长。

4)小鼠水迷宫实验：在跳台实验结束后次日，进行水迷宫实验。在水迷宫各阶 段，SL高、中、低剂量组及实验结果见表nimo组均不同程度地缩短小鼠到 达安全区的游泳时间，并增加正确反应次数。

结论：SL具有改善反复脑缺血再灌致小鼠记忆障碍的作用。

实施例5S和L对双侧颈总动脉永久性结扎（BCCAO）大鼠记忆障碍模型的改 善作用

试验方法：取22周龄Wistar大鼠，体重350～500g，雌雄各半，戊巴比妥钠 (50mg·kg^-1，i.p.)麻醉，分离颈总动脉及迷走神经、交感神经，用0号缝合线 结扎双侧颈总动脉，造成双侧颈总动脉的永久性结扎。假手术组经过相同的手术 过程但不结扎颈总动脉，正常对照组不进行任何手术操作。术后恢复三天，待动 物状态恢复正常。从第四天开始，正常对照组、假手术组及模型对照组每天给予 蒸馏水，其余各组分别给予SL高(S21/L4.48mg·kg^-1)、SL中(S10.5/L2.24 mg·kg^-1)、SL低(S5.25/L1.12mg·kg^-1)、nimo21mg·kg^-1，连续给药至实 验全部结束，每天给药1h后开始实验。实验程序如下:第21天进行大鼠自发活 动测定。第22天进行自发交替反应测定。第23-26天采用新物体辨别实验进行 学习记忆测定。第27～34天采用Morris水迷宫进行学习记忆测定。第35～36 天进行避暗法实验。第37天，断头，取脑，固定、脱水后作病理切片。

试验结果：

1)大鼠自发活动变化：与正常对照组比较，假手术组各项指标均未见显著异常， 模型对照组与假手术组比较各项指标未见显著异常。SL高、中、低三剂量组 及nimo组各指标均无显著性变化。提示该脑缺血模型、SL及nimo对动物自 发活动无显著影响。

2)大鼠自发交替反应实验：各组动物之间的进臂数和正确选择率均无显著性差 异。

3)大鼠新物体辨别实验：在standard condition。新物体辨别实验中，与正常 对照组相比，模型对照组辨别系数均显著下降;提示BCCAO手术导致大鼠新 物体辨别能力降低，SL高、中剂量组大鼠对新旧物体的辨别系数与模型对照 组相比均显著增高。在configural condition新物体辨别实验中，与正常 对照组相比，模型对照组辨别系数显著下降:给予SL高、中剂量组大鼠对新 旧物体的分辨系数与模型对照组相比均显著增高。

4)大鼠Morris水迷宫实验：对1～5天定向游泳实验中BCCAO大鼠找到潜在安 全台的潜伏时间进行two-way ANOVA检验。训练次间的潜伏期有显著性差异， 组间的潜伏期也具有显著性差异。组间次的作用无显著差异,即无交互影响。 进一步通过Bonferrani/Dunn检验，假手术组与正常对照组之间无显著性差 异;但模型对照组与假手术组比较，潜伏期显著延长。SL可不同程度地改善 这种空间一记忆的障碍。Nimo组潜伏期也较模型对照组显著缩短。对每次定 向游泳结果进行单因素方差分析的结果表明:1～5天10次的定向游泳实验 中，正常对照组找到潜在安全台的潜伏期与假手术组相比无显著差异;与假 手术组相比，模型对照组潜伏期共在7次训练中显著延长;与模型对照组比 较，SL高剂量组共在3次训练，中、低剂量组在1次训练中显著缩短潜伏期。 第5天的probe test中，与空白对照组比较，假手术组在原安全台所在象 限中的停留时间均未见显著变化。与假手术组比较，模型对照组在原安全台 所在象限中的停留时间均显著缩短。SL高剂量组在前30s、后30s和总90s 内的停留时间与模型对照组相比显著延长。SL中、低剂量组在90s内的停留 时间与模型对照组相比显著延长。在连续三天(第6～8天)的工作记忆测试 中，假手术组大鼠的潜伏时间与正常对照组比较没有显著性差异。与假手术 组比较，模型对照组的潜伏时间在三天中均显著延长。SL高剂量组与模型对 照组比较在第1、3天显著缩短潜伏时间。SL中、小剂量组大鼠的潜伏时间 在三天内均无显著性变化。

5)大鼠避暗实验：与正常对照组比较，假手术组测试阶段步入暗室的潜伏期未 见显著性变化。与假手术组比较，模型对照组的潜伏期显著缩短。SL高、中、 低三个剂量组进入暗室的潜伏期均显著延长。nimo也可显著延长潜伏期。

6)BCCAO大鼠的脑病理改变：

正常对照组;大脑皮层:神经细胞核未见明显异常，轴突明显，染色质分布均 匀。海马CA3区:神经细胞核未见明显异常，轴突明显，染色质分布均匀。

模型对照组:大脑皮层:大量神经细胞核固缩，细胞缩小且轴突不明显，局部 可见坏死灶。海马CA3区:神经细胞肿胀变性，核浆界限不清，核固缩，核深染， 小胶质细胞增生。

S和L高剂量(S21/L4.48mg·kg^-1)组:大脑皮层:神经细胞核未见明显异常， 核膜清楚，轴突明显可见，血管内可见红细胞。海马CA3区;神经细胞核浆界限 清楚，染色质分布均匀，神经细胞核未见明显异常，轴突明显，未见变性:

S和L中剂量(S10.5/L2.24mg·kg^-1)组:大脑皮层:神经细胞核未见明显异 常，树突未见异常。海马CA3区:神经细胞核未见明显异常，少见核深染，有神 经细胞被噬现象。

S和L低剂量(S5.25/L1.12mg·kg^-1)组:大脑皮层:大量神经细胞核固缩， 细胞缩小且轴突不明显，局部可见坏死灶。海马CA3区:神经细胞核浆界限不清， 细胞肿胀，核固缩，核深染，有神经细胞被噬现象。

结论：SL具有改善双侧颈总动脉结扎大鼠记忆障碍的作用。

实施例6S和L对环己酰亚胺制记忆巩固障碍的改善作用

试验方法：取健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2g，随机分为正常对照组、 模型对照组、SL高(S30/L6.4mg·kg^-1)、SL中(S15/L3.2mg·kg^-1)、SL低(S 7.5/L1.6mg·kg^-1),S15mg·kg^-1，L3.2mg·kg^-1，nimo30mg·kg^-1组，给药组分 别灌服药物，正常对照组和模型对照组灌服等容积蒸馏水，连续给予5天，第5 天给药后1h，进行避暗法训练。训练结束后除正常对照组腹腔注射生理盐水外， 其余各组均腹腔注射环己酞亚胺200mg·kg^-1。于24h后进行测试，记录5min 内潜伏期、错误次数和总电击时间。

试验结果：模型对照组的潜伏期显著缩短，提示给予环己酞亚胺后，动物出现记 忆障碍。SL高剂量组(S30/L6.4mg·kg^-1)以及中剂量组(S15/L3.2mg·kg^-1)均可显 著延长小鼠潜伏期。

实施例7S和L对SCPL致大鼠新物体辨别障碍的改善作用

试验方法：取健康Wistar大鼠，体重200±20g，雌雄各半，随机分为正常对照 组、模型对照组、SL高(S21/L4.48mg·kg^-1)、SL中(S10.5/L2.24mg·kg^-1)、SL 低(S5.25/L1.12mg·kg^-1)、nimo21mg·kg^-1组，给药组分别灌服药物，正常对照 组和模型对照组灌服等容积蒸馏水，连续给予3天后，第4日适应环境后仍继续 给药，第5日在给药1h后除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组腹腔注 射SCPL2.1mg·kg^-1，lOmin后，进行新物体辨别试验。

试验结果：与正常对照组相比，模型对照组大鼠辨别系数显著下降，提示大鼠新 物体辨别障碍模型成立。SL高、中剂量组及nimo组大鼠对新旧事物的辨别系数 与模型对照组比具有显著升高。

结论：SL具有改善SCPL、环己酰亚胺等化学药品所导致的记忆获得、巩固及新 物体辨别障碍的作用

实施例8细胞生物学实验部分

试验方法：

（1）PC12细胞损伤模型的建立

1)NO损伤模型的建立:将含硝普钠100μmol·L^-1，的1640培养液作用于 PC12细胞10min,造成NO神经损伤模型。

2)氯化钾损伤模型的建立:加入含200mmol·L^-1氯化钾和2%聚乙二醇400 的1640培养液于PC12细胞培养10min，造成氯化钾损伤模型。

3)谷氨酸损伤模型的建立:加入含1000μmol·L^-1谷氨酸，100μmol·L^-1甘氨酸的1640培养液于PC12细胞作用60min，造成谷氨酸损伤模型。 （2）SL对PC12细胞损伤模型的保护作用

将PC12细胞按1.5×104cell/cm²密度接种于25cm²培养瓶中，使用1640 培养液(内含10%马血清，5%牛血清，青霉素100U·mL^-1，链霉素100μg·ml^-1)， 加入神经生长因子100μL(2.5μg·ml^-1)后，于37℃，5%C0₂静置培养，培养至 单层铺满瓶壁后(每次换液仍需加入2.5μg·ml^-1神经生长因子100μL)，取细 胞开始进行试验。取96孔板铺板，除本底对照组各孔外，每孔加入0.5×10⁵个 细胞，使用1640培养液并加入神经生长因子5μL(1μg·ml^-1)，于37℃，5%CO₂ 静置培养6h后，除本底对照组(b)、正常对照组(c)、溶剂对照组(v)、模型对照 组(m)外，其余给药组(S)加入6个不同浓度的药物，使之最终浓度分别为S3.0 ×10^-1/L6.4×10^-2mg·mL^-1,S1.5×10^-1/L3.2×10^-2mg·mL^-1,S6.0×10^-2/L 1.3×10-²mg·mL^-1,S1.2×10^-2/L2.6×10^-3mg·mL^-1,S2.4×10^-3/L5.0×10^-4mg·mL^-1,S4.8×10^-4/L1.0×10^-4mg·mL^-1，各组均设3个复孔，各组各孔总体 积均为100μL。加入药物共同孵育12h后，建立细胞损伤模型。造模后吸去含 有造模药物培养液，换正常1640培养液，继续培养6小时，细胞培养结束前4 小时，每孔加入5mg·mL^-1MTT10μL，37℃5%CO₂培养箱中继续培养，终止培养 后，吸去孔内培养液，加入含0.04N HC1的异丙醇100μL,振摇溶解120min 后，在参比波长为610nm，测定波长为540nm下测定吸光度值。按如下

公式计算细胞生存率:

溶剂对照组细胞生存率=(OD_V-OD_b)/(OD_C-OD_b)×100%

模型对照组细胞生存率=(OD_m-OD_b)/(OD_V-OD_b)×100%

给药组细胞生存率=(OD_S-OD_b)/(OD_V-OD_b)×100%

试验结果：1）模型对照组与溶剂对照组相比较，细胞生存率显著下降。第二、 三、四剂量组与模型对照组相比，细胞生存率显著提高，提示SL可对抗硝普钠 对PC12细胞的损伤。

2）模型对照组与溶剂对照组相比较，细胞生存率显著下降。第二、三、四、五 剂量组与模型对照组相比，细胞生存率显著提高。提示SL可对抗氯化钾对PC12 细胞的损伤作用。

3）模型对照组与溶剂对照组相比较，细胞生存率显著下降。第三、四剂量组与 模型对照组相比，细胞生存率显著提高。提示SL可对抗谷氨酸对PC12细胞的 损伤作用。

结论：SL可对抗SNP、KCL及谷氨酸引起的PC12细胞损伤

实施例9S和L促智作用机制研究

（1）SL对反复缺血再灌致小鼠脑内NO、NOS、MDA、SOD的作用

1）NO含量、总NOS、iNOS、及SOD活性的测定

试验方法：反复脑缺血再灌致小鼠记忆障碍实验中，在所有行为学试验结束第二 天(术后第17天)，给药后小鼠快速断头取脑，中，用滤纸将表面水和血吸干， 于4℃生理盐水中冲洗干净，取出放在下置冰块的表面皿称重，用生理盐水制成 10%的脑匀浆液。根据NO和NOS,SOD试剂盒进行NO含量、总NOS、iNOS及SOD 活性的测定。

试验结果：与假手术组相比，模型对照组脑内NO含量显著增加。SL高剂量组（S 30/L6.4mg﹒kg^-1）与中剂量组（S15/L3.2mg﹒kg^-1）的NO含量与模型对照 组相比显著减少。与假手术组比较，模型对照组小鼠脑组织中总NOS以及iNOS 活性显著增强，SL高剂量组与中剂量组的总NOS以及iNOS活性降低，与模型对 照组对比又显著性差异，而低剂量组总NOS与模型对照组相比较，脑内总NOS 活性有下降趋势，但其iNOS活性与模型对照组相比显著降低。。

2）MDA含量的测定

试验方法：取上述10%脑匀浆制备1%脑匀浆，加入0.3ml20%三氯醋酸(TCA)， 沉淀蛋白质，混匀静置于室温下20min，加入0.1mol·L^-1的盐酸2ml和1%硫 代巴比妥酸(TBA)1.0ml,充分混匀后，于100℃沸水煮15min（严格控制时间)， 室温下冷却，加4.0ml正丁醇提取颜色，强力振荡，充分混匀，3000r·min^-1离心15min;取上清液4ml，在532nm波长下比色测定。按如下公式计算MDA 浓度:

C=OD/(0.156×PRO)  (nmol·mgpro^-1)

其中:C表示MDA浓度;OD表示532nm下最后制得上清液吸光度;PRO表示相 应脑匀浆蛋白含量。

试验结果：与假手术组相比，模型对照组脑内MDA含量显著升高，而SOD活性显 著降低。SL高剂量组与中剂量组MDA含量降低，SOD活性升高，与模型组相比有 显著性差异，低剂量组脑中的MDA较模型组有下降趋势，SOD活性亦有上升趋势， 但与模型对照组相比无显著性差异

（2）S和L对双侧颈总动脉永久性结扎大鼠脑内LDH、Ca²⁺-ATPase的作用

试验方法：大鼠双侧颈总动脉结扎术后第37天，快速断头处死，取两侧大脑半 球，于4℃生理盐水中冲洗干净，取出放在下置冰块的表面皿上，用滤纸将表面 水和血吸干一，取其一侧大脑半球，称重，用4℃生理盐水制成10%的匀浆液。 按试剂盒说明制作上清液，并进行LA,Ca²⁺-ATPase的测定。

试验结果：与假手术组比较，模型对照组大鼠脑组织中的LDH活性显著降低， 提示模型对照组动物对LA的代谢能力降低，导致LA在脑内堆积，影响了动物脑 的正常功能。同时模型对照组大鼠脑组织中Ca2+-ATPase活性显著降低。而SL 高剂量组，中剂量组拮抗了脑缺血引起的LDH活性降低，解除了乳酸代谢障碍对 正常脑功能的影响；SL高剂量组同时增强了Ca2+-ATPase活性，使其免收能量 代谢障碍的影响，更好地发挥胞内钙外排的作用。

结论：S和L显著降低其脑组织中总NOS、iNOS活性及MDA、NO含量，并显 著增强其脑内SOD、LDH和Ca2+-ATPase活性。