肝靶向去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳注射液的处方及制法

摘要

一种肝靶向去甲斑蝥素酯化衍生物脂微球注射液的处方，属于医药技术领域，其特征是，所述处方包括去甲斑蝥素酯化衍生物3-5g，大豆油50g，中链甘油三酸酯50g，卵磷脂10-14g，甘油20-24g，油酸1g，泊洛沙姆F681g。本发明选用亚微乳剂为难溶性药物载体，使药物具有肝靶向性，药物主要在肝、脾、肺、骨髓组织浓集，避免药物对其他组织的损伤，对提高药物疗效具有积极的作用。本发明制备工艺合理，经优化的工艺路线简单，实用性和可操作性强，质量安全可控，重现性好，适用于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肝靶向去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳注射液的处方及制法，属于医药技 术领域。

背景技术

目前，肿瘤已逐步取代心脑血管疾病成为全球头号杀手，2007年全球有760万人死于恶 性肿瘤，在世界肿瘤的死亡率已占其总死亡人数的21.6%，在中国恶性肿瘤死亡率率上升尤 其迅猛，其占我国总死因的百分率已从70年代的12.6%上升至2007年的16.7%。严重危害人 们的健康，尤其是肝癌，肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，是我国位居第二的癌症“杀手”， 常见于中年男性。因其恶性度高、病情进展快，病人早期一般没有什么不适，一旦出现症状 就诊，往往已属中晚期。故治疗难度大、疗效差，一般发病后生存时间仅为6个月，严重威 胁我国人口健康。为了减轻我国众多肝癌患者的痛苦，开发基于去甲斑蝥素酯化衍生物的被 动靶向治疗肝肿瘤药物，该药通过亚微乳包裹小分子化合物，对肝癌细胞具有特异性作用， 降低其他组织的分布和毒副作用。目前，化学治疗药物，其选择性作用普遍较差，对机体造 血系统、肝脏、肾脏、心脏等毒副作用均很强，晚期肿瘤患者甚至很难接受。因此，研制肝 癌靶向治疗新药，对疗效确切、毒副作用低的治疗具有十分重要的意义。

发明内容

依据去甲斑蝥素酯化衍生物的理化性质和肝癌特性，本发明选用亚微乳剂为难溶性药物 载体，使药物具有肝靶向性，药物主要在肝、脾、肺、骨髓组织浓集，避免药物对其他组织 的损伤，对提高药物疗效具有积极的作用。本发明制备工艺合理，经优化的工艺路线简单， 实用性和可操作性强，质量安全可控，重现性好，适用于工业化生产。

本发明具体采用的技术方案是：

一种肝靶向去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳注射液的处方，其特征是，所述处方包括甲斑 蝥素酯化衍生物3-5g，大豆油50g，中链甘油三酸酯50g，卵磷脂10-14g，甘油20-24g，油酸 1g，泊洛沙姆（poloxamer F68）1g。

优选的，所述处方包括甲斑蝥素酯化衍生物3-5g，大豆油50g，中链甘油三酸酯50g，卵 磷脂12g，甘油22g，油酸1g，泊洛沙姆（poloxamer F68）1g。

所述处方中还包括适量的制药注射用水。

其中，所述的去甲斑蝥素酯化衍生物是外型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸丁酯或外 型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸己酯。

一种肝靶向去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳注射液的制法，其特征是，包括如下步骤：

1）按处方称取各组分备用；将活性成分去甲斑蝥素酯化衍生物溶解在大豆油、中链甘 油三酸酯和油酸混合溶液中，得油相溶液；

2）将卵磷脂用适量预热的注射用水完全溶解，再加入甘油、泊洛沙姆（poloxamer F68） 混合均匀，得水相溶液；

3）向上述制备的水相溶液内通入超纯氮气，打开搅拌机高速搅拌，边搅拌边向其中滴 加上述制备的油相溶液，滴加完毕后再搅3-5分钟，得乳白色较为均匀的初乳；

4）将初乳加入高压均质机内，需经8次以上的高压均质，调节高压均质机一级压力阀范 围控制在200bar-1000bar之间，调节二级压力阀控制在50bar-100bar范围内，待8次高压均 质完成后，收集经高压均质的乳液；将其静置到室温，补加注射用水至处方总量，混合均匀， 即得乳白色均一的去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂；

5）用碱溶液调节其PH值至7.5-9.5；在通超纯氮气的条件下，滤过、分装、密封，最 后湿热灭菌，即得可供注射用的去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂成品。

在上述制备过程中，为了节省时间，必要时可采取水浴加热的方式加速去甲斑蝥素酯化 衍生物在油中的溶解，水浴温度可在60-80℃之间。

上述的乳化剂卵磷脂在加热或暴露在空气中极容易氧化，为避免或减少乳化剂的氧化， 在上述去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂的制备过程中，至少应从步骤2）制备水相溶液开始 至步骤5）分装前的操作均需在通氮气的条件下进行。

在本发明中，上述初乳的制备可采用高速搅拌法，搅拌速度在5000—15000转／分钟之 间，优选的搅拌速度为8000—10000转／分钟之间。在高压均质时，均质一级压力可在100bar —1200bar范围内，优选压力在200bar-1000bar之间；均质二级压力可在50bar—150bar范围 内，优选压力在70bar-100bar之间。

在本发明抗肿瘤药物去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂中，还可以借此提高疗效、降低毒 副作用以及扩大应用范围，；也可以加入增加乳粒表面ζ电势，提高去甲斑蝥素酯化衍生物亚 微乳剂稳定性的稳定剂，如油酸、胆酸、脱氧胆酸及其它们相应的盐。

本发明药物去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂的各组分的用量和质量应当符合药学的一般 标准。为了保证本发明用标准，其所有组分包括活性成分去甲斑蝥素酯化衍生物、水、植物 油、乳化剂、渗透压调节剂以及稳定剂，都应当同时达到注射用标准。

在本发明抗肿瘤药物去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂的组分中，植物油是抗肿瘤活性成 分去甲斑蝥素酯化衍生物的溶媒，目前，植物油分为中链和长链植物油，不同种类的植物油 其极性又各有不同，因此去甲斑蝥素酯化衍生物在不同种类的植物油中的溶解度亦有差别。 鉴此，为了使去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂中活性成分去甲斑蝥素酯化衍生物达到有效载 药抑制破乳现象产生，所以使用中链和长链植物油按1:1的比例混合，在本发明中，植物油 选用大豆油和中链植物油。

为保证去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂的乳化质量和稳定性，在本发明的抗肿瘤药物去 甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂中，乳化剂的用量与植物油的用量应当匹配。在本发明实施例 中，植物油选用的大豆油与乳化剂选用的卵磷脂的合适比例约为1.2%，相应地乳化剂匹配用 量约为12mg/ml，优选用量为12mg/ml。另外，为了增加乳化能力增加了乳化剂泊洛沙姆 （poloxamer F68），其使用量应在0.1%，此外，由于不同种类的乳化剂乳化能力有差别，在 用量上也应有所不同。

本发明实例中还使用了，稳定剂油酸，起到增加微球表面膜的韧性，达到乳剂长期稳定 保存，抑制破乳和突释现象的发生。其中油酸的使用量应在0.1%-0.03%。

在本发明的抗肿瘤药物去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂组分中，渗透压调节剂其作用是 使本发明抗肿瘤药物去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂的渗透压调节至人的正常生理范围内。 一般来说讲，不同的渗透压调节剂由于其分子大小和极性不同，即使相同重托不同渗透压调 节剂所产生的渗透压也可不同。同时还必须注意去甲斑蝥素酯化衍生亚微乳剂中其它组分(如 抗肿瘤活性成分、植物油、乳化剂等)对渗透压也产生一定影响，鉴于以上原因，每种渗透压 调节剂的用量须根据去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂中其它组分的用量以及该种所选定的渗 透压调节剂的分子大小和极性强弱而定；在本发明实施例中，为了使本发明的渗透压在人正 常生理范围内，所选用的渗透压调节剂甘油其合适用量为18-25mg/ml，优选用量为22mg/ml。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限在这些实施例中。

具体实施方式

实施例1

1)称取去外型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸丁酯5g，注射用大豆油50g，注射用中 链甘油三酸酯50g，注射卵磷脂12g，注射用甘油22g，油酸1g，F681g注射用水适量。

2)将外型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸丁酯/外型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧 酸己酯加入到注射用大豆油中，置于80℃的恒温水浴中水浴，使其完全溶解，得油相溶液；

3)将注射用卵磷脂用适量预热至80℃的注射用水完全溶解，再加入注射用甘油，混合均 匀，得水相溶液；

4)向上述水相溶液内通入超纯氮气，打开搅拌机，以8000转／分转速搅拌，边搅拌边 向其中滴加上述制备好的油相溶液，滴加完毕后再继续搅拌5分钟，得乳白色较为均匀的初 乳。初乳的质量直接影响产品的质量，因此，制定了内控的初乳考察标准，标准要求乳液应 无大油滴析出或分层现象。

5)再将初乳溶液加入到高压均质机的料斗内，调节高压均质机二级压力至75bar，一级 压力至100bar，待压力稳定后进行高压均质1次；二级均质压力至100bar，依次调节一级均 质压力至200bar、500bar、700bar分别高压均质1圈、最后再经1000bar高压均质1圈，收 集经高压均质的乳液，将其静置到室温，补加注射用水至1000ml(在本实施中实际用水约 861m1)，混合均匀，即得乳白色均一的去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂。通过对均质工艺考 察研究，重点应注意均值压力和次数的调节，一级压力从100bar—1000bar，试验结果证实， 均质5次可达到满意的结果，该工艺符合对粒度分布和1/2峰宽的技术标准要求。另外，高压 均质机采用的是二级压力调节方式，即一级压力调节控制粒径，二级压力控制粒径分布。

6)向上述制得的去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂中滴加0.1M的氢氧化钠溶液，调节其 PH值至8.5；滤过0.45μm滤膜，在通超纯氮气的条件下，将其分装于输液瓶内，扎盖密封， 置于湿热灭菌器内121℃高压蒸汽灭菌15min，得可供注射用的去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳 剂成品。

实施例2-4

实施例2、3、4的制法与实施例1基本相同，只是处方及用量不同，具体如表1所示：

表1实施例1、2、3、4处方量表

如表1所示，各项检测指标均符合标准要求，经3个月加速稳定性考察，实施例1各项 指标均在变化最小，因此，优选实例1、2作为最优处方。

采用本发明制得的去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂，经检测其质量外观均一，呈乳白色 液状，PH为7.10—8.47(灭菌后的PH值)，渗透压在人的正常的生理范围内，粒径1urn以下 占80％，粒径在5um以上的未检出，无菌，内毒素等质量指标符合中华人民共和国药典相关 规定。3个月加速实验和一年的室温下稳定性试验表明质量稳定。

以下通过试验例来进一步阐明本发明药物去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂的药效学评价 结果，这些试验包括体外抗肿瘤试验和体内抗肿瘤试验。

[试验例1]

一、实验目的：以MTT法评价5个去甲斑蝥素酯化衍生物对7个细胞系的生长抑制活性，比 较和筛选出具有进一步研究价值的化合物。

二、实验材料：

1.药品：去甲斑蝥素，溶于水，为本试验对照品；以下为试验样品编号：1号，2号，3 号，4号，5号（1号为外型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸丁酯；2号为外型-7-氧杂二环 [2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸己酯；3号为外型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸辛酯；4号为 外型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸癸酯；5号为外型-7-氧杂二环[2,2,1]庚烷-2，3-二羧酸 十二酯）由山东世博金都药业有限公司提供。上述样品均不溶于水，溶于DMSO，试验时临 时配制。本试验使用的DMSO为医用色谱纯级，Sigma公司生产。

2.细胞系及培养：人肝癌HepG2细胞、人肝癌PLC/PRF/5细胞、人正常肝细胞HL-7702、 MRC-5胚肺成纤维细胞、人肺癌细胞H460、人肺癌细胞A549和人血管内皮细胞ECV-304。

3.试验消耗材料：细胞培养瓶，为美国Corning公司生产；96孔培养板，美国Costar公 司生产；RPMI-1640培养基，Invitrogen公司生产；a-MEM培养基，赛默飞世尔生物化学制品 有限公司生产；胎牛血清，兰州民海生物工程有限公司生产。四甲基偶氮唑 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)，美国Sigma公司产品。

4.试验仪器：超净工作台，多功能酶标仪，美国PerkinElmer公司产品。

三、实验方法

1.细胞培养：上述细胞除MRC-5生长于a-MEM培养基外，其余均生长于含10%胎牛血 清的RPMI-1640培养基中，培养条件37℃、5%CO2培养箱，细胞均常规培养传代。

2.样品稀释方法与浓度：经先期预试验后确定去甲斑蝥素、1号、2号和3号的浓度范 围为3.9，7.8，15.6，31.25，62.5，125，250，500μM。5号和6号使用浓度：1.95，3.9， 7.8，15.6，31.25，62.5，125，250μM。

3.试验方法：取指数生长期细胞，经Hank’s液洗涤后，以0.02%胰蛋白酶+0.05%EDTA 消化分散单个细胞，台盼蓝染色计数活细胞在95%以上。取细胞接种于96孔培养板中，细胞 数4000-10000/孔，置37℃，5%CO2孵箱中培养12h。细胞贴壁后，按照上述设定终浓度加 入待测化合物（每孔含溶剂4μl），每个剂量设3-6个复孔，同时设立空白对照孔（加4μl 生理盐水），溶剂对照孔（加4μl DMSO）。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中连续培养96 小时。经洗涤、加入MTT(5mg/ml)20培l养4h及在酶标仪570nm处（PerkinElmer,USA） 测OD值，计算化合物的IC50并分析抑制曲线。

根据体外抑制活性试验分析的一般规律。考虑到去甲斑蝥素及衍生物的溶解条件，本试 验主要以62.5μM之前的各浓度抑制率作为主要依据，而125μM之后的各浓度由于剂量较 高，其抑制活性数据仅供一般参考。

重复1次，试验条件相同，重复试验以双盲方式进行，试药1，试药2，试药3，试药4 和试药5号样品。

四、实验结果：本试验使用7个细胞系、总共对包括对照品去甲斑蝥素在内的6个样品进行 了抑制活性观察。两次试验结果基本相同，经过综合分析，筛选出了样品1、2和3具有进一 步研究的价值。其中2和3具有类似的抑制活性，而以2活性更强。化合物1对人肺癌细胞 A549抑制活性明显高于去甲斑蝥素，对于其他细胞的抑制活性较差。化合物4和5的抑制活 性较差，本试验未发现具有继续研究的价值。

[试验例2]

一、实验目的：以体内肝原位接种法评价去甲斑蝥素衍生物亚微乳制剂1号和2号是否对小 鼠H22肝癌具有抑制作用。

二、实验材料

受试药物和对照品：去甲斑蝥素衍生物亚微乳制剂1号和2号，由山东世博金都药业有 限公司委托山东大学药学院制剂研究所提供，规格:1号5mg/ml；2号3mg/ml。（1号为实施 例1的产品；2号为实施例2的产品）注射用去甲斑蝥酸钠，批号20100101，菏泽睿鹰制药 集团有限公司产品，试验时以生理盐水配制1mg/ml，每只小鼠注射0.2ml（8mg/kg）。

实验动物：昆明种小鼠，雌性，110只，体重19-22g，购自山东大学试验动物中心。

小鼠H22肝癌细胞，腹水传代，购自山东省医学科学院药物研究所药理室。

三、实验方法

肿瘤细胞接种方法：取腹水传代后5-6天的H22腹水小鼠，无菌取细胞5×106，接种小鼠 腋部皮下10只。10天后肿瘤生长至约1-1.5g时，处死小鼠，无菌手术方法取肿瘤制作瘤块 约1mm3，冰浴放置待用。取小鼠，以水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌条件下打开腹腔，以导 管穿刺针穿过肝包膜将肿瘤组织块导入肝组织内，压迫止血后，依次缝合腹膜、肌层和皮肤， 碘酒消毒后放回无菌笼饲养。以上操作均在超净工作台内进行。

给药方法：接种肿瘤组织6天后，将动物随机分组，每组10只，给药剂量与方法如表1所 示，其中1号制剂大、中、小剂量给药体积分别为0.2ml/只(40mg/kg)，0.15ml/只(30mg/kg) 和0.1ml/只(20mg/kg)，2号制剂大、中、小剂量给药体积分别为0.3ml/只(36mg/kg)，0.2ml/ 只(24mg/kg)和0.1ml/只(18mg/kg)，每2天给药1次，给药13次，实验时间16天。试验结束 时处死动物称体重，取肝脏称重，剥离肿瘤组织称重，计算抑制率。

表2去甲斑蝥素衍生物亚微乳制剂裸鼠给药方案

四、实验结果：以上述剂量尾静脉给药，各制剂及各剂量药物对小鼠尾静脉均无明显刺激作 用。但是，1号制剂各剂量组，尤其是大剂量组，注射后对小鼠产生短暂性瘫软（数秒钟） 作用，之后缓慢恢复正常。2号制剂和空白制剂对动物无明显影响。在动物一般状况和体重 等方面，在本实验周期内未见明显异常。各制剂和去甲斑蝥酸钠对肿瘤的抑制作用结果见表 2，显示1号制剂对H22小鼠肝癌具有良好的抑制作用，剂量在20，30，40mg/kg时，抑制 率分别为58.5%,43.9%和65.9%；2号制剂的剂量在18，24，36mg/kg时，抑制率分别为48.8%， 58.5%和63.4%。去甲斑蝥酸钠的抑制率为41.5%，实验还观察到去甲斑蝥酸钠对动物体重具 有一定的降低作用(P<0.05)，可能具有一定的毒性作用，如表3所示。

表3

*与阴性对照组比较，P<0.05

五、结论：去甲斑蝥素衍生物亚微乳制剂1号和2号制剂均对小鼠H22肝癌生长具有良好的 抑制作用，两个样品的疗效相当。

结论

去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂具有显著的抗肿瘤作用，而且毒性较低。根据一般亚微乳 剂药剂学的特点，本发明的抗肿瘤药物去甲斑蝥素酯化衍生物亚微乳剂还具有缓释、靶向、 为机体提供能量等作用。