食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒

摘要

本发明公开了食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒。该方法可稳定从植物油中提取核酸成分，并采用恒温扩增的方法在短时间内实现对转基因成分的检测，所述方法包括如下步骤：包括如下步骤：1）提取待检样品DNA；2）待检样品DNA在引物、BstDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；3）根据扩增结果判断待检样品中是否存在CaMV35S转基因成分。该方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等特点，能快速检测食用油中转基因成分CaMV35S。

说明书

技术领域

本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒。

背景技术

自20世纪70年代转基因生物和转基因产品被开发以来，转基因产品发展迅猛。到目前为止，已经有超过100种以上的转基因植物被商业化种植，其中最广泛的是作为食用油加工原料的大豆、油菜和玉米。由于这些转基因油料作物出油率高、制油成本低，各发展中国家纷纷进口转基因大豆和油菜作为制油原料。但由于目前尚缺乏科学依据证明转基因食品的安全性，因而对转基因食品检测技术的需求也越来越紧迫。近年来，中国进口的制油原料中，有相当数量的转基因产品，尤其是转基因大豆，中国进口的大豆几乎100%为转基因大豆。由于世界上已经有很多国家规定了转基因食品是必须加贴标签或禁止进口，因此，对食用油脂进行转基因成分的检测，显得尤为重要。如何鉴别食用油脂是否为转基因食品，除了检测原料以外，更多的是需要从成品食用油中直接进行检测。

花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子是最常使用的组成型启动子，它具有多种顺式作用元件，能在多种植物物种的几乎所有发育阶段和所有组织中高效表达，被广泛用于转基因植株的构建。在目前市面上常见的玉米、棉花、大豆、等转基因植物中，约有85%—90%的转基因植物使用了该启动子。虽然目前CaMV35S启动子存在多个版本，但其保守序列相对稳定，是转基因检测的最佳靶基因之一。而从食用油脂中提取出可用于核酸检测的DNA，是进行检验的关键。但是食用油的DNA提取仍是国内外的难题之一，由于食用油生产加工过程中经过高温和高压等处理过程，产品中的DNA遭到严重破坏，降解为长度较短，大小不一的片段，而且受到物理、化学和生物等因素的影响，DNA的质量也大大降低。目前，国内外仍没有一个比较稳定的食用油DNA提取方法或试剂盒。本研究建立一种可从食用油中稳定提取核酸的方法，并建立一种恒温检测CaMV35S启动子的方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种快速检测食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法。

本发明的另一个目的在于提供一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的LAMP试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的LAMP引物组。

本发明所采取的技术方案是：

一种食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法，包括如下步骤：

1）根据CaMV35S启动子基因序列设计特异性恒温扩增检测引物；

2）提取待检样品DNA；

3）待检样品DNA在上述引物、Bst DNA 聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；

4）根据扩增结果判断待检样品中是否存在CaMV35S转基因成分。

所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：

35S- F3：GGTGGCTCCTACAAATGC（SEQ ID NO:1），

35S- B3：GTCTTGCGAAGGATAGTGG（SEQ ID NO:2），

35S-FIP：GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG（SEQ ID NO:3），

35S-BIP：     CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC（SEQ ID NO:4），

35S-FLP：AGAGGCATCTTCAACGATGG（SEQ ID NO:5），

35S-BLP：AGAAGACGTTCCAACCACG（SEQ ID NO:6）。

作为优选的，步骤2）提取待检样品DNA的具体步骤为：

1）取一定样品油，加入1～3倍体积的正己烷和0.1～0.3倍体积的TE，20～25℃环境条件下，混合均匀；

2）静置分层后，去除上层油相；

3）将下层的TE水相转移到离心管；依次加入1～2 μg 鲑鱼精DNA，0.5～0.7倍体积预冷的异丙醇，0.1～0.2倍体积的3 mol/L的乙酸钠；轻轻来回颠倒混匀后置于－20℃以下沉淀DNA；

4）沉淀过夜后离心，弃上清液，用预冷的65～75%的乙醇洗涤沉淀，转移到离心管，离心；

5）空干DNA，加入TE溶解DNA，置于－20℃以下保存。

作为优选的，步骤3）所述恒温扩增反应的体系为：25 μL LAMP 反应体系含有1.6 μmol/L 35S-FIP、1.6 μmol/L 35S-BIP、0.2 μmol/L 35S-F3、0.2 μmol/L 35S-B3、0.8 μmol/L 35S-FLP、0.8 μmol/L 35S-BLP、1 mol/L甜菜碱、8 mmol/L MgSO4、8 U Bst DNA聚合酶、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer 及待测DNA模板2 μL。

作为优选的，步骤3）所述恒温扩增反应的程序为：60～65℃恒温反应45～60min。

作为优选的，步骤4）可根据恒温荧光法判断检测结果，在反应体系中加入2-20 μM SYTO-9，使用荧光PCR仪（如ABI7500）或其它恒温荧光检测仪(Genie Ⅱ)进行检测，根据扩增曲线判断结果，有“s”型扩增曲线的为阳性，无“s”型扩增曲线的为阴性。

一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的试剂盒，其包括6条根据CaMV35S启动子基因序列设计的特异性恒温扩增检测引物。

所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：

35S- F3：GGTGGCTCCTACAAATGC（SEQ ID NO:1），

35S- B3：GTCTTGCGAAGGATAGTGG（SEQ ID NO:2），

35S-FIP：GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG（SEQ ID NO:3），

35S-BIP：     CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC（SEQ ID NO:4），

35S-FLP：AGAGGCATCTTCAACGATGG（SEQ ID NO:5），

35S-BLP：AGAAGACGTTCCAACCACG（SEQ ID NO:6）。

所述试剂盒中还包括以下组分：Bst DNA聚合酶、MgSO₄、甜菜碱、dNTP、10×Thermo pol Buffer 、SYTO-9、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有CaMV35S启动子基因序列的重组质粒，所述阴性对照品为ddH₂O。

一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的引物组，其序列分别如下所示：

35S- F3：GGTGGCTCCTACAAATGC（SEQ ID NO:1），

35S- B3：GTCTTGCGAAGGATAGTGG（SEQ ID NO:2），

35S-FIP：GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG（SEQ ID NO:3），

35S-BIP：     CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC（SEQ ID NO:4），

35S-FLP：AGAGGCATCTTCAACGATGG（SEQ ID NO:5），

35S-BLP：AGAAGACGTTCCAACCACG（SEQ ID NO:6）。

本发明的有益效果是：食用油中是否含有转基因油是目前检测的难点，其中转基因核酸成分是较为可靠地检测靶标，但面临着油中核酸提取难度高和低拷贝的核酸检测率低等一系列问题，本发明公布了一种检测检测食用油中CaMV35S启动子的方法和试剂盒，具有以下特点和优势：1.建立一种可稳定提取油中DNA的方法，通过在提方法中加入正己烷进行乳化和加入鲑鱼精DNA提高油中核酸的得率，2.采用恒温扩增技术，检测效率高，在63～65℃对核酸进行扩增反应， 45～60min内完成检测，3.特异性高，根据CaMV35S启动子基因序列设计的6条引物能特异性识别靶基因序列上的8个独立区域，具有较高的特异性，4.灵敏度高，使用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下，不间断的扩增靶标序列，最低可检测到1个拷贝的核酸。该方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等特点，能快速检测食用油中的转基因成分CaMV35S启动子。

说明书附图

图1为本发明LAMP最佳反应体系对阳性和阴性样品的扩增图；

图2为本发明方法的特异性检测结果图；

图3为理由本发明实施例1的方法提取植物油DNA后进行LAMP反应的结果图；

图4为采用常规商品试剂盒提取植物油DNA后进行LAMP反应的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 食用油中DNA的提取

本发明所研发的食用植物油基因组DNA的提取方法，步骤如下：

1）取100 mL油，加入到500 mL三角瓶中；然后加入200 mL正己烷和20 mL TE，20～25℃环境条件下，120 rpm振荡混匀3 h；

2）最后将下层的TE水相（约15 mL）转移到50 mL离心管，依次加入1-2μg鲑鱼精DNA（sigma公司），0.6倍体积预冷的异丙醇，1/10体积的3 mol/L的乙酸钠；轻轻来回颠倒混匀后置于－20℃沉淀DNA；

3）沉淀过夜后离心（12000×g，10 min，4℃）；小心弃上清液；

4）用预冷的70%的乙醇洗涤沉淀，转移到1.5 mL离心管，离心（12000 ×g，10 min, 4℃）；

5）空干DNA，加入50 μL的TE溶解DNA；DNA置于－20℃保存。

实施例2  引物设计

根据CaMV35S启动子基因序列（GenBank：GU734659.1）分别设计了35S- F3、35S- B3、35S-FIP和35S-BIP四条引物，同时设计35S-FLP和35S-BLP两条环引物以缩短检测时间。扩增目标靶序列大小为210 bp。6条引物序列分别如下所示：

35S- F3：GGTGGCTCCTACAAATGC（SEQ ID NO:1），

35S- B3：GTCTTGCGAAGGATAGTGG（SEQ ID NO:2），

35S-FIP：GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG（SEQ ID NO:3），

35S-BIP：     CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC（SEQ ID NO:4），

35S-FLP：AGAGGCATCTTCAACGATGG（SEQ ID NO:5），

35S-BLP：AGAAGACGTTCCAACCACG（SEQ ID NO:6）。

实施例3  LAMP检测体系的优化

本发明方法从Mg²⁺浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、FIP/BIP引物浓度和反应温度5个变量参数，按以下方法对LAMP反应条件进行优化:

Mg²⁺浓度优化：设置4个Mg²⁺浓度梯度依次为4mM、6mM、8mM、10mM；

甜菜碱浓度优化：设置4个甜菜碱浓度梯度依次为0.8M、1.0M、1.2M、1.6M；

dNTPs浓度优化：设置4个dNTPs浓度梯度依次为1.2 mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM；

FIP/BIP浓度优化：设置4个FIP/BIPs浓度梯度依次为1.2μmol/L、1.6μmol/L、2.0μmol/L、2.4μmol/L；

反应温度优化：设置4个反应温度梯度依次为63℃、64℃、65℃。

在反应进行时，采用反应曲线的出峰时间作为评价的指标，对上述参数进行优化研究，本研究最终确定的LAMP反应条件为：

25 μL LAMP 反应体系含有1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、0.8 μmol/L FLP、0.8 μmol/L BLP、1 mol/L甜菜碱、8 mmol/L MgSO₄、8 U Bst DNA聚合酶、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer 及DNA模板2 μL。反应条件：63℃，反应1 h。

按上述优化后条件进行检测，反应结果见图1，实验结果表明：使用建立的最佳反应体系可明显区分阴阳性结果，60min内无非特异性扩增。

实施例4 特异性实验

采用CTAB法提取取下述样品DNA，采用实施例3的最佳LAMP检测体系进行检测。

 检测结果见图2。实验结果表明：1-5号含有CaMV35S基因的样品本专利方法均可检出， 6-14号不含CaMV35S基因的转基因样品检测结果均为阴性，15-22号非转基因样品检测结果均为阴性，表明该检测方法特异性强。

实施例5 不同提取方法对比及灵敏度实验

将含CaMV35S基因成分的转基因大豆油和非转基因大豆油按重量比混合成CaMV35S基因成分含量分别为10%，5%，1%，0.5%，0.1%，0.05%的阳性模拟样品，分别采用本发明实施例1的DNA提取方法和常规商业DNA提取试剂盒分别提取，然后采用实施例3的LAMP检测体系进行检测。

本发明所研发的食用植物油基因组DNA的提取方法，步骤如下：

本发明的DNA提取方法检测结果见图3，常规商业DNA提取试剂盒检测结果见图4，实验结果表明： 采用本发明的提取方法最低检出限可达到0.5%，采用常规商业DNA提取试剂盒最低检出限可达到5%，说明本发明核酸提取方法提取的核酸效果更好，同时说明本发明的提取方法与检测试剂盒匹配使用，最低检出限可到0.5%。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110>  广州迪澳生物科技有限公司

 

<120>  食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ggtggctcct acaaatgc                                                     18

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gtcttgcgaa ggatagtgg                                                    19

 

 

<210>  3

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gtccatcttt gggaccactg tccatcattg cgataaagga aagg                        44

 

 

<210>  4

<211>  41

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cacgaggagc atcgtggaaa cgtcagtgga gatatcacat c                           41

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

agaggcatct tcaacgatgg                                                   20

 

 

<210>  6

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

agaagacgtt ccaaccacg                                                    19