芍药2-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因及其编码产物和应用

摘要

本发明公开了一种2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因及其编码蛋白与用途，该基因为首次利用构建cDNA文库从芍药中克隆而得，填补了从我国传统中药材芍药中分离克隆出2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶基因的空白。本发明所提供的2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因可以通过生物技术提高芍药中4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸代谢产物的含量，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及利用芍药cDNA文库克隆2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二 磷酸合酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的有机酸、萜类酶基 因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因 组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的 研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其 调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直 接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。药用植物的化学成分复杂，种类繁多，其中 主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分，芍药Paeonia  lactiflora不仅是名花，还是一味常用中药，其根可供药用。其中白芍具有镇痉、镇痛、通经 等作用。芍药根中含有芍药苷、安息香酸等活性成分，其中芍药苷属于单萜类化合物，具有 显著的镇痛、镇静、抗惊厥、，解痉、解热、抗炎、抗溃疡、抗过敏、降血糖、调节免疫、保 护肝脏等作用(杨俊，方红编。芍药[M]。北京：中国中医药出版社，2001，113)。

2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate  synthase，IspF)是位于质体中的萜类化合物的脱氧木酮糖-5-磷酸途径(DXP)中的关键 酶基因，其表达量可能与芍药苷等萜类成分的含量密切相关。IspF能催化4-二磷酸胞苷-2-C- 甲基-D-赤藓醇-2-磷酸(2-Phospho-4-(cytidine 5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol， CDP-ME2P)生成2-C-甲基-D-赤藓醇2，4环二磷酸(2-C-Methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate，ME-2，4CPP)和CMP，再经过1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶 (HDS)、异戊烯基单磷酸激酶(IPK)的作用生成异戊烯基焦磷酸(IPP)或二甲基烯丙基焦 磷酸(DMAPP)，再进一步合成各种不同的萜类化合物(张长波，孙红霞，巩中军，祝增荣。 植物萜类化合物的天然合成途径及其相关合酶[J]。植物生理学通讯，2007，43(4)：779-786)。芍 药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因的克隆，为利用基因工程提高芍药活性 成分含量提供重要基础，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的 应用前景。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的芍药2-甲 基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶基因及其氨基酸序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因。

本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。

本发明所提供的芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因，为以下核苷酸 序列之一：

(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或 者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

该基因所编码的蛋白质为芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因，是以下氨 基酸序列之一：

(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

本发明所提供的2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因是首次从芍药中克隆 制备的，体外实验表明，IspF能催化4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸 (2-Phospho-4-(cytidine 5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol，CDP-ME2P)生成2-C-甲基-D- 赤藓醇2，4环二磷酸(2-C-Methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate，ME-2，4CPP)和CMP的活 性。利用本发明可以通过基因工程技术来提高芍药等植物中萜类物质含量。

附图说明：

图1：PLIspF功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；

图2：PLIspF系统进化树(邻接法)；

图3：表达载体pTrc-PLIspF构建；

具体实施方式

实施例1、芍药cDNA文库的构建

1、芍药总RNA的分离和检测

取芍药(Paeonia lactiflora)的根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃ 预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L^-1，EDTA 25m mol·L^-1，NaCl 2.0mol·L^-1，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等 体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃ 沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5％，NaCl 1mol·L^-1，Tris-HCl (pH8.0)10mmol·L^-1，EDTA 1mmol·L^-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g 离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2小时；4℃13000g离心20分钟， 沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完 整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

2、cDNA文库的构建

采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit，Pharmacia公司) 分离mRNA后，采用Clontech公司的Creator Smart cDNA Library Construction Kit (Ca.No.634903)进行建库，原理为SMART(switch mechanism at 5′end of mRNA template)。

实施例2：芍药相关基因的克隆

随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加 入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次 加入：Taq buffer  2.5μL，MgCl₂(25mM)1.8μL，dNTP(2.5mM)1μL，M13+引物(10pmol) 1μL，M13-引物(10pmol)1μL，Taq酶0.4μL。PCR反应条件为94℃预变性5分钟后， 94℃40秒，54℃40秒，72℃4分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。待PCR 反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半 小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。选择条带单一扩增 产物送至华大基因公司进行测序，获得芍药相关基因序列。

实施例3、PLIspF基因的生物信息学分析

本发明涉及的芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶基因全长cDNA的长度为696bp， 详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于1-696bp。将芍药全长cDNA序列用 BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS  translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基 酸水平上与其它物种中的IspF有较高的同源性，同时具有典型的MECDP_synthase (2-C-methyl-D-erythritol-2，4-cyclodiphosphate synthase，IspF)结构域。如图1。

实施例4、PLIspF基因功能的研究

1.表达载体的构建

以PLIspF cDNA为模板，利用引物P1：5′-GGATCCATGGCCACGGCGACTCCGCTATA- 3′，P2：5′-TCTAGACTACTTCTTCATAAGAAGAACCACA-3′进行PCR反应，反应体系同实 验例2。取5ul扩增产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，扩 增片段为708bp。用Bamh I和Xba I在37℃下双酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara 公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamH I和Xba I在37℃下酶切pMD19-T载体2小时， 加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用回收试剂盒回收片段。

回收片段经T4连接酶在8℃连接过夜。电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨 苄青霉素的LB平板上筛选重组子。含PLIspF克隆的pMD19质粒经PCR和限制性内切酶酶 切鉴定和DNA序列分析，保存具有正确目标序列的重组质粒pMD-PLIspF。

BamH I和Xba I双酶切携带PLIspF的pMD-19T Vector质粒和pTrc-AtIPI质粒，分别回 收目标片段708bp和3700bp，于16℃连接回收片段，获得重组质粒，经PCR和限制性内切 酶酶切鉴定和DNA序列分析，证明含有正确序列的PLIspF，该表达载体命名为pTrc-PLIspF (图3)。

2.工程菌构建

将pTrc-PLIspF转化携带pAC-BETA质粒的大肠杆菌XL1-Blue，并在含有Amp(150μg/ml) 和Cm(50μg/ml)的LB培养基上筛选阳性克隆。

3.PLIspF基因功能分析

由于在大肠杆菌中存在MEP途径，菌株XL1-Blue中含有质粒pAC-BETA可以制造和积累 β-胡萝卜素，并形成黄色菌落。当pTrc-PLIspF被转化到这种能够积累β-胡萝卜素的大肠杆 菌XL1-Blue中后，细菌的颜色变成黄色或橙黄色，表明PLIspF能加速β-胡萝卜素的积累。

本发明挑取分别含有XL1-Blue+pTrc-PLIspF、XL1-Blue+pTrc-PLIspF+pAC-BETA的大肠 杆菌单克隆，在含有Amp(150μg/ml)和Cm(50μg/ml)的LB培养基上，于28℃倒置暗培养， 2～3天后观察菌落颜色变化情况。以含有XL1-Blue、XL1-Blue-+pAC-BETA、 XL1-BIue+pTrc+pAC-BETA大肠杆菌单克隆为对照。

实验结果表明，2-3天培养后，与对照菌株相比，含有PLIspF的大肠杆菌克隆颜色变成了 黄色，从而证明了在PLIspF可以加速β-胡萝卜素的积累。

4.突变IspF验证

以PLIspF cDNA为模板，利用突变引物P3：5′- GGATCCATGGCCACGGCAACTCCGCTATA-3′，P4 5′-TCTAGACTACTTCTTCATAAGAAGAACCACA-3′进行PCR反应，表达载体的构建及功能 验证方法同上，结果表明突变PLIspF转基因工程菌株与正常PLIspF没有显著差异。