一种具有高絮凝能力的菌株及其应用

摘要

本发明涉及一种具有高絮凝能力的菌株及其应用。以本发明提供的具有高絮凝能力的菌株壁芽孢杆菌（Bacillusmuralis）D6的代谢产物作为主要活性成分，作为微生物絮凝剂，将其应用于降解屠宰废水，具有无毒无害、可自然降解、处理效果好、无二次污染等特点。在最佳投加组合条件下，菌株D6经发酵所产生的微生物絮凝剂对屠宰废水的CODCr、SS、浊度、TN、NH4+-N去除率分别为92.19%、93.06%、97.23%、35.91%、38.82%，提高了污水处理效果，为屠宰废水的高效处理提供了新的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种由屠宰场排污口污泥中筛得的具有高絮凝能力的菌株，该菌株经发酵所 产生的微生物絮凝剂（MBF）对屠宰废水具有高效的降解作用。

本发明所称的一种具有高絮凝能力的菌株命名为：壁芽孢杆菌（Bacillus muralis）D6， 已于2013年10月7日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M2013461。

背景技术

作为较早被使用的水处理剂，化学絮凝剂主要包括无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂，这 类絮凝剂具有价格低廉、处理效果明显等特点，因此在早期被大量使用，但使用过程易造成 金属离子和有机物残留而导致二次污染。

屠宰废水含有大量的血水、粪便、毛屑、脂肪、骨屑、内脏等悬浮物，并伴有强烈的难 闻气味。由于屠宰废水含有机物种类多，对环境造成极大的污染，传统方法处理效果不理想。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种具有高絮凝能力的菌株壁芽孢杆菌（Bacillus muralis） D6，已于2013年10月7日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M2013461。 以下简称菌株D6。

本发明的另一目的是提供一种微生物絮凝剂，以菌株D6的代谢产物作为主要活性成分， 将其应用于降解屠宰废水，具有无毒无害、可自然降解、处理效果好、无二次污染等特点。

上述的菌株D6所产生的微生物絮凝剂在降解屠宰废水中的应用，具体方法如下：

1）将上述的保藏编号为CCTCC NO：M2013461的壁芽孢杆菌（Bacillus muralis）D6菌 种接入发酵培养基，在恒温振荡培养箱以温度30℃，转速为160r/min培养72h，将发 酵液用离心机4000r/min离心30min，取上清液，为微生物絮凝剂。

所述的发酵培养基是：可溶性淀粉20g，KH₂PO₄ 2g，K₂HPO₄ 5g，(NH₄)₂SO₄ 0.2 g，NaCl 0.1g，脲0.5g，酵母膏0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蒸馏水1000mL，初始pH 7.0，121℃灭菌20min。

2）于屠宰废水中加入微生物絮凝剂和CaCl₂，调节pH。每100mL屠宰废水中，加入微 生物絮凝剂0.5-3.5mL；1%CaCl₂ 2-9mL，调节pH值6.0-12.0。优选的，最佳絮凝条件

为：每100mL屠宰废水中，加入微生物絮凝剂2.5mL；1%CaCl₂ 5.5mL；pH为8.0。

本发明的有益效果是：本发明将菌株D6所产生的微生物絮凝剂，加入到屠宰废水中， 可将废水中的悬浮物、胶体颗粒聚集形成较大的絮花，静置后实现固液分离。本发明提供的 微生物絮凝剂能够迅速有效地降解屠宰废水中的有机物、降低浊度，使出水清澈透明。对 COD、SS、浊度等都具有较好的处理效果，减小了处理系统的负荷，提高处理效率。在最佳 投加组合条件下，菌株D6经发酵所产生的微生物絮凝剂对屠宰废水的COD_Cr、SS、浊度、 TN、NH₄⁺-N去除率分别为92.19%、93.06%、97.23%、35.91%、38.82%，提高了污水处理 效果，为屠宰废水的高效处理提供了新的方法。

附图说明

图1菌株D6生长曲线图。

图2菌株D6的原子力照片。

图3菌株D6 16SrDNA片段扩增图。

图4菌株D6进化树。

图5菌株D6产生微生物絮凝活性的分布情况。

图6菌株D6所产生絮凝剂的投加量对絮凝效果的影响。

图7pH值对絮凝效果的影响。

图8CaCl₂的投加量对絮凝效果的影响。

具体实施方式

实施例1 壁芽孢杆菌（Bacillus muralis）D6的获得与鉴定

（一）D6的筛选方法

采用稀释涂布与平板划线法从沈阳某肉禽加工厂屠宰废水排污口底泥和曝气池活性污泥 中分离菌株，分离纯化得到55株菌株，经初筛后，有15株菌株的发酵产物可以使高岭土悬 液产生絮凝现象，有絮团产生，证明其发酵产物有絮凝特性。将初筛后得到的15株菌株进行 复筛，用絮凝率表征微生物絮凝剂絮凝能力，复筛结果见表1，其中，D6、B8、E7、E12 的絮凝率均大于94%，以D6的絮凝率最大，为96.77%。

表1 复筛结果

（二）菌株D6生长曲线的测定

液体培养基配方：1000mL蒸馏水，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH值7.2，121 ℃灭菌20min。

具体方法：在每个三角瓶中放入几个经灭菌处理的玻璃球防止菌种结团，然后放入摇床 中振荡，摇床转速为160r/min，温度为30℃，每隔三个小时测定660nm波长下的吸光度，以 时间为横坐标，OD660为纵坐标绘制生长曲线。

结果如图1所示，由图1可见，菌株D6在第0～3h内处于生长调整期，菌数增长缓慢， 第3～15h进入生长对数期，菌数急剧增长，第15h以后进入生长平稳期，菌数不再有剧烈的 变化。

（三）菌株D6的形态特征及菌种鉴定结果如下：

A．菌株D6单体及菌落特征

菌株D6为杆菌，无荚膜，周生鞭毛，单体D6菌的原子力照片见图2。菌落特征为淡黄 色的圆形，不透明，边缘无皱褶，表面凸起，有黏性。

B．菌株D6的生理生化特性

革兰氏G、接触酶、吲哚、乙酸氧化、明胶液化为阳性；甲基红、淀粉水解、VP、H₂S、 油脂、乙醇、柠檬酸盐反应为阴性，不分解牛奶石蕊；不产酸不产气，不还原硝酸盐。

C．菌株D6的16SrDNA的测序

菌株D6总DNA的提取：（一）菌株培养：将菌株D6接种于5mL液体培养基中，放入 摇床160r/min，30℃培养至生长对数期；（二）菌体收集：用灭菌的移液管取1mL培养物于 EP管中，室温下8000转离心5min，弃去上清液，将沉淀重新溶于pH为8.0的ddH₂O中；(三) 菌体裂解：配置50mg/mL的溶菌酶溶液，然后取6μL加入到上一步得到的溶液中，37℃下 作用2h，再分别加入50μL浓度为2mol/L的NaCl溶液、110μL浓度为10%的SDS、3μL 浓度为20mg/L的蛋白酶K，37℃过夜。（四）抽提：菌液平均分到2个1.5mL的EP管中， 加入等体积配置好的酚、氯仿、异戊醇溶液（三者体积比例为25:24:1），混匀后室温放置 5～10min，12000转离心10min，抽提2次；（五）沉淀：加入0.6倍于抽提液体积的异丙醇， 混匀后室温放置10min，12000转离心10min；（六）洗涤：将得到的沉淀用75%的乙醇洗涤 2次，然后12000转离心1min；（七）晾干后，溶于50μL的ddH₂O中，取2～5μL在制备好 的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后放入EB中染色20min。

菌株D6 16SrDNA扩增：反应体系见表2：

表2 16SrDNA扩增反应体系

模板（μL） 2

引物F1（μL）序列AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 2 引物F2（μL）序列AAGGAGGTGMTCCARCC 2 dNTPS（μL） 6 缓冲液（μL） 5 rTag酶（μL） 1 ddH₂O（μL） 32

PCR扩增需要94℃预变性5min，94℃变性40s，55℃退火50s，共35个循环，72℃延伸 1.5min，72℃终止7min。PCR扩增产物取10μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物电 泳图谱如图3所示。由图3可知，PCR扩增后的16SrDNA片段电泳条带在1600～1650bp附近， 没有非特异性条带和引物二聚体，结果良好。

DNA测序：测序由大连宝生物公司完成。序列如SEQ ID NO:1所示。

D．菌株D6的系统进化树分析

根据16SrDNA测序结果绘制进化树，如图4所示。从图4可见菌株D6与壁芽孢杆菌 （Bacillus muralis）16SrDNA序列的相似性达到了99.5%，鉴定该菌株为壁芽孢杆菌（Bacillus  muralis）。

E．结论：参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，结合生理生化特征 和16SrDNA序列的相似性为99.5%，鉴定该菌株D6为壁芽孢杆菌（Bacillus muralis）。 壁芽孢杆菌（Bacillus muralis）D6，已于2013年10月7日在中国典型培养物保藏中 心保藏，编号为CCTCC NO：M2013461。

（四）微生物絮凝活性分布情况

具体方法：分别配置5份100mL浓度为4%的高岭土悬液，标号1～5，向1号溶液中加 入2.5mL发酵原液（含细胞），5.5mL浓度为1%的CaCl₂溶液，调整pH为8.0,2号～4号样 品将发酵原液（含细胞）分别替换为灭菌后的上清液、上清液以及细菌悬液，其他条件不变， 200r/min搅拌1min，50r/min搅拌3min，静置10min后分别测定上清液在550nm波长下的吸 光度，5号样品加入2.5mL蒸馏水作为对照。结果如图5所示，由图5可知，絮凝活性最高 的是将发酵培养基离心后的上清液，絮凝活性达到了98.2%，其次为经高温灭菌后的上清液， 絮凝活性为95.7%，再次为发酵原液（含细胞），絮凝活性达到93.3%，絮凝活性最低的为细 菌悬液，絮凝活性只有66.8%，由此说明，该微生物絮凝主要活性成分为胞外代谢产物，并 且具有较好的热稳定性。

实施例2 降解屠宰废水的最佳絮凝条件确定及应用

（一）微生物絮凝剂的制备：将菌株D6接入装有50mL发酵培养基（1000mL蒸馏水、 可溶性淀粉20g、KH₂PO₄ 2g、K₂HPO₄ 5g、(NH₄)₂SO₄ 0.2g、NaCl 0.1g、脲0.5g、酵母 膏0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g，初始pH7.0，121℃灭菌20min）的250mL三角瓶中，在恒温 振荡培养箱以振荡器温度30℃，转数为160r/min培养72h。培养后将发酵液用离心机4000r/min 离心30min，取上清液即为微生物絮凝剂。

（二）单因素最佳絮凝条件试验：

A.微生物絮凝剂投加量对絮凝效果的影响试验

在100mL屠宰废水中，固定1%CaCl₂用量为5mL，pH为7.0，比较微生物絮凝剂投加量 为0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL时的絮凝效果，结果如图6所示， 由图6可知，当絮凝剂投加量为2.5mL时絮凝率最高，达到了92.1%。

B.pH值对絮凝效果的影响试验

pH值的变化会直接影响到水体中的ζ电位，进而影响生物絮凝剂和不溶物质的结合，因 此pH值的大小是影响絮凝效果的重要因素。在100mL屠宰废水中，固定微生物絮凝剂的投 加量为2.5mL，1%CaCl₂用量为5mL，比较pH分别为6、7、8、9、10、11、12时的絮凝效 果，结果如图7所示，由图7可知，当pH值为7时能够达到最高的絮凝率为93.2%。

C.1%CaCl₂的投加量对絮凝效果的影响试验

在100mL屠宰废水中，固定微生物絮凝剂的投加量为2.5mL，pH为7，比较1%CaCl₂投加量分别为2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL时的絮凝效果，结果如图8 所示，由图8可知，当1%CaCl₂投加量为5.0mL时絮凝率最高达到了93%。

(三)三因素最佳絮凝条件正交试验：

以絮凝剂投加量、1%CaCl₂投加量、pH值为正交试验的因素，根据L₉(3⁴)正交表设计成 三因素三水平的正交试验，正交试验结果和方差分析结果如表3和表4。

表3 正交试验结果

表4 正交试验方差分析结果

由表4中的Sig值可知，pH对菌株D6微生物絮凝剂的絮凝效果具有显著性影响，这进 一步表明壁芽孢杆菌微生物絮凝剂在絮凝体系的充分伸展对絮凝效果起决定作用。而絮凝剂 投加量和1％CaCl₂投加量没有显著性差异，说明絮凝体系对这两个因素具有较广的适应范围。 由表3的R值可知，各因素对絮凝效果的影响由大到小依次为pH>絮凝剂投加量>1%CaCl₂投加量。由表3中的k值可得，该微生物絮凝剂对屠宰废水絮凝作用的最佳絮凝条件为：每 100ml屠宰废水中投加微生物絮凝剂2.5mL，1％CaCl₂ 5.5mL，pH8.0。

（四）实例

根据得出的最佳优化投加条件（每100ml屠宰废水中投加微生物絮凝剂2.5mL，1％CaCl₂  5.5mL，pH8.0），对屠宰废水进行处理效果试验，测定结果如表5。

表5 最佳优化处理条件下各项理化指标的去除率

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