一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法

摘要

本发明提供一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，包括以下步骤：（1）PUMA-/-(PUMA基因敲除)小鼠或PUMA-/+小鼠成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存；（2）DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；（3）逆转录病毒的包装、滴度测定与冻存；（4）PUMA基因敲除小鼠或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程；（5）敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程。本发明的有益效果是通过在体细胞重编程步骤中抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效，同时能够保护iPS细胞基因组稳定性。

说明书

技术领域

本发明属于干细胞领域，尤其是涉及一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的 方法。

背景技术

将OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc四个转录因子同时导入小鼠皮肤成纤维细胞，可 重编程形成类似于胚胎干细胞的一类新型细胞，被称为iPS细胞。2007年,iPSCs技术 在人的体细胞上取得成功,iPS细胞具有胚胎干细胞的多向分化能力，是各类疾病发病机 制研究和药物筛选的最佳材料；也是一些退行性疾病将来治疗的新希望。但大量研究表 明，iPS细胞在重编程中诱发了相当数量的DNA损伤以及染色体结构的改变，进而导致 iPS细胞具有潜在的致癌性，并且效率很低。所以在将iPS细胞应用于临床治疗之前，安 全性和有效性成为该技术应用的关键。

p53，一种重要的肿瘤抑制蛋白，可通过触发细胞凋亡、调控细胞周期及加速细胞衰 老方式抑制肿瘤发生。在大多数肿瘤中p53处于失活状态。研究证实沉默p53可显著地增 加iPS细胞的诱导效率，不仅对病毒载体诱导技术有用，对用质粒或蛋白诱导转化技术同 样有用。Marion等表示缺乏p53的iPS细胞基因组不稳定，而且不能有效地发育成嵌合体 小鼠[1]，Utikal等证实暂时性而不是永久性抑制p53可促进重编程的效率[2]。但沉默p53 同样会增加基因组不稳定性和肿瘤的发生性，其分子机制与其下游的p21有关。这正好验 证了iPS产生具有细胞周期依赖和非细胞周期依赖两种模式。但目前的研究均忽略了在重 编程过程中细胞凋亡因素。而p53也是通过调节PUMA的表达来调控细胞凋亡。

2001年,Yu[3]和Nakano等[4]两个独立的研究小组分别从结直肠癌细胞系和人 类成骨细胞样细胞中分离出新的可被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用的p53靶基 因,后被鉴定为同一基因,并命名为PUMA。PUMA直接或间接地与抗凋亡Bcl-2蛋白发 生相互作用,解除Bcl-2/Bcl-xL对Bax/Bak的抑制作用,Bax/Bak构象改变后在线粒体膜 上形成寡聚物,使膜通透性增加、外膜电势降低、释放细胞色素C入胞质,启动caspase级 联反应,最终发生细胞凋亡。生理状况下PUMA表达量较低，但在DNA损伤药物、血清 饥饿和内质网应激等刺激诱导下可显著升高。本实验室和其他实验室研究表明失去 PUMA可以在高剂量照射条件下，通过减少凋亡保护造血干细胞和小肠干细胞等成体干 细胞[5-9]。并且在很多疾病模型中未发现失去PUMA可以促进肿瘤的发生[5-8,10-11]。我 们初步实验结果表明敲除PUMA和p53一样具有促进iPS产生的作用，但根据以往报道中 PUMA和p53对肿瘤发生的作用相反，其对iPS细胞重编程中基因组稳定性和致癌性的作 用机制很是令人期待。PUMA作为p53下游凋亡通路的重要分子，抑制或敲除PUMA在成 体干细胞中具有明显的抗放射和抑制肿瘤形成的作用，但其对iPS的产生和基因组稳定性 的作用以及分子机制还不是很清楚。

参考文献

1.Marion RM,Strati K,Li H,Murga M,Blanco R,et al.(2009)A p53-mediated DNA  damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity.Nature460: 1149-1153.

2.Utikal J,Polo JM,Stadtfeld M,Maherali N,Kulalert W,et al.(2009)Immortalization  eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.Nature460:1145-1148.

3.Yu J,Zhang L,Hwang PM,Kinzler KW,Vogelstein B(2001)PUMA induces the rapid  apoptosis of colorectal cancer cells.Mol Cell7:673-682.

4.Nakano K,Vousden KH(2001)PUMA,a novel proapoptotic gene,is induced by p53. Mol Cell7:683-694.

5.Labi V,Erlacher M,Krumschnabel G,Manzl C,Tzankov A,et al.(2010)Apoptosis of  leukocytes triggered by acute DNA damage promotes lymphoma formation.Genes Dev24: 1602-1607.

6.Michalak EM,Vandenberg CJ,Delbridge AR,Wu L,Scott CL,et al.(2010) Apoptosis-promoted tumorigenesis:gamma-irradiation-induced thymic lymphomagenesis  requires Puma-driven leukocyte death.Genes Dev24:1608-1613.

7.Yu H,Shen H,Yuan Y,XuFeng R,Hu X,et al.(2010)Deletion of Puma protects  hematopoietic stem cells and confers long-term survival in response to high-dose  gamma-irradiation.Blood115:3472-3480.

8.Shao L,Sun Y,Zhang Z,Feng W,Gao Y,et al.(2010)Deletion of proapoptotic Puma  selectively protects hematopoietic stem and progenitor cells against high-dose radiation.Blood  115:4707-4714.

9.Qiu W,Carson-Walter EB,Liu H,Epperly M,Greenberger JS,et al.(2008)PUMA  regulates intestinal progenitor cell radiosensitivity and gastrointestinal syndrome.Cell Stem  Cell2:576-583.

10.Jeffers JR,Parganas E,Lee Y,Yang C,Wang J,et al.(2003)Puma is an essential  mediator of p53-dependent and-independent apoptotic pathways.Cancer Cell4:321-328.

11.Villunger A,Michalak EM,Coultas L,Mullauer F,Bock G,et al.(2003)p53-and  drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa.Science302: 1036-1038.

发明内容

本发明的目的是通过在体细胞重编程步骤中抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功 效，同时能够保护iPS细胞基因组稳定性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抑制PUMA功能改善iPS细 胞建立功效的方法，包括以下步骤：

（1）PUMA^-/-(PUMA基因敲除)或PUMA^-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的制备、传 代、冻存；

（2）DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和 PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；

（3）逆转录病毒载体的包装、滴度测定与冻存：将携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、 PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E细胞中，回收在培养 上清液中产生的逆转录病毒载体，并进行滴度测定与冻存；

（4）PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程

将步骤（3）中的携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转 录因子的逆转录病毒载体感染步骤（1）得到的PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠胚胎成纤维细胞 MEF，并用饲养层细胞支持培养感染的PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF， 连续培养，出现的克隆为PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠iPS细胞；

（5）敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程

将人PUMA shRNA（载体Plk0.1）和携带有人PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc 和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E中，回收在培养上清液中产生的 病毒载体，并将回收的病毒载体感染人成纤维细胞，并用饲养层细胞支持培养感染的人 成纤维细胞，培养7天后，用条件培养基培养，连续培养，出现的克隆为敲降PUMA功 能的人iPS细胞。

进一步，所述步骤（1）中的具体步骤为：取8-10周的PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠，按 2：1的雌雄比例合笼，处死孕期为13.5天的孕鼠，将小鼠胚胎从子宫中剥离，去除头和 内脏组织，将单个胚胎的躯干，剪碎至糊状，胰酶消化，FM重悬，培养24-48h后，将 MEF细胞按常规方法进行传代，2×FM冻存液冻存P0代、P1或P2代细胞。

进一步，所述步骤（3）的具体步骤为：每100mm皿接种8x10⁶-1x10⁷个Plat-E细胞， 融合度达到90%时，将培养皿中的细胞培养液换成5ml新鲜DMEM+10%FBS，制备质粒 和lipofectamine2000混合液，10μl lipofectamine2000与500μl OPTI-MEM混合，室温放 置5min，携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质 粒各10μg与500μl OPTI-MEM混合，室温放置5min，将上述两种液体轻轻混合，室温 静置20min，将混合液逐滴加入100mm皿中，1ml/皿，混匀，培养6-8h后换新鲜的 DMEM+10%FBS分别在培养后48h和72h收集逆转录病毒上清并浓缩，收集的部分逆转 录病毒进行滴度测定。

进一步，所述步骤（4）的具体步骤为：将PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠胚胎成纤维细胞 MEF，种在100mm的皿中，第2天，根据所测病毒滴度，计算病毒载体所用的量，将步 骤（3）中得到的携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因 子的逆转录病毒载体加入到100mm皿中，并加入polybrene至终浓度为6μg/ml或加入 5ml逆转录病毒载体+1ml FBS+6μl的8μg/ml的polybrene，感染12h后，换为新鲜的 DMEM培养基，细胞长满培养皿后，将感染的PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠胚胎成纤维细胞 MEF细胞，按常规方法消化传代至铺有饲养层细胞的培养皿中，细胞密度为1x10⁵/孔， 培养基为小鼠ES培养基，连续培养，出现的克隆为PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠iPS细胞。

进一步，所述步骤（5）的具体步骤为：将人PUMA shRNA（载体Plk0.1）和携带有 人PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞 Plat-E中，回收在培养上清液中产生的病毒载体，并将回收的病毒载体感染人成纤维细胞， 人成纤维细胞的培养基为EMDM+10%FBS，连续两天，两次病毒转染，感染第三天后 更换为人成纤维细胞培养液，细胞长满后，转移至铺好饲养层细胞的100mm培养皿中， 利用人成纤维培养基培养转天后换为人ES培养基：人成纤维细胞培养基=1：1的混合培 养基，转天换为完全的人ES培养基，培养7天后，加条件培养基，条件培养基为用人 ES培养基培养饲养层细胞一天的培养基，20天左右出现的克隆为敲降PUMA功能的人 iPS细胞。

本发明具有的优点和积极效果是：由于采用上述技术方案，在小鼠胚胎成纤维细胞和人 成纤维细胞上的实验结果说明敲除或敲降PUMA基因，均能提高体细胞重编程效率，与野生 型的iPS细胞的形成率相比具有显著性差异，P＜0.05，并且敲除或敲降PUMA基因的iPS细 胞的基因组是稳定的，与野生型iPS细胞相比无显著性差异，而敲除p53和p21基因后，相 应的iPS细胞的染色体的突变率与野生型iPS细胞相比有显著性差异，P＜0.05；抑制PUMA 功能，在重编程过程中能提高诱导效率和保护基因组稳定性，为揭开iPS细胞在重编程过程 中产生的基因组不稳定性问题提供一个新的突破口，并为探寻保持iPS细胞基因组稳定性的 方法提供理论依据。

附图说明

图1小鼠iPS细胞的碱性磷酸酶染色照片，缩小5倍；

图2小鼠iPS细胞形成率的柱状图；

图3PUMA^-/-小鼠iPS细胞表达ES标记基因的荧光显微镜图；在10倍镜下观察结果，放 大倍数：100倍；

图4畸胎瘤三个胚层的组织H.E.染色显微镜图；在10倍镜下观察结果，放大倍数：100 倍；

图5嵌合鼠照片图；

图6染色体突变率的柱状图；

图7敲降PUMA功能的人iPS细胞的PUMA蛋白表达的蛋白印迹图；

图8敲降PUMA功能的人iPS细胞形成率的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不限定本发明。

实施例1PUMA^-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存

（1）取8-10周的PUMA^-/-小鼠，傍晚按2：1的雌雄比例合笼，次日早上发现有阴道栓 的雌鼠单笼饲养，中午胚胎发育0.5天记为E0.5或0.5dpc；取小鼠胚胎前一天高压灭菌镊子 和剪刀。

（2）处死孕期为13.5天（E13.5）的孕鼠，将小鼠放到75%的酒精中浸泡后，放于无菌 超净台中，将处死的孕鼠，用大剪刀剪开腹腔，取出两侧子宫，并将子宫放于无菌的100mm 塑料有盖培养皿中。

（3）将取出的子宫放到无菌的PBS中，计胚胎数。

（4）将小鼠胚胎一步一步从子宫中剥离出来：先去子宫，再去卵黄膜、胎盘和羊膜，每 一步都用PBS洗一遍。

（5）将剥离出来的胚胎，放到新的PBS中，去除头和内脏组织。

（6）将单个胚胎的躯干移到一个加入少量PBS的培养皿中，用小剪刀将所有的躯干剪 碎至糊状。

（7）将剪碎的组织移到一个新的15ml离心管中，加0.05%胰酶5ml，放37℃水浴锅， 晃动5min，消化30min。加入10ml的FM中和，FM指DMEM+10%FBS的混合液，1000 rpm，离心5min。

（8）弃掉上清，用FM重悬细胞，按1个胚胎种一个100mm的培养皿，每皿加FM10ml， 放37℃，5%CO₂培养箱培养，记为P0。

（9）24-48h后细胞生长密度接近100%后，将上述MEF细胞按常规方法进行传代，吸 掉细胞上清，用PBS洗一遍，加入0.05%胰酶1ml覆盖皿即可，37℃消化3min。加入两倍 体积的FM中和胰酶后，用枪反复吹打，直至所有的贴壁细胞都脱落。

（10）1000rpm，离心5min，弃掉上清，用FM重悬后，按1：3传至100mm细胞培养 皿内，每皿的培养基为10ml，此时记为P1。

（11）24-36h后，MEF细胞生长密度再次达到100%后，按步骤（9）、（10）传代，记为 P2。

（12）将P0代、P1或P2代的细胞按常规方法消化，离心。弃掉上清，用少量FM重 悬成单细胞后，计数。

（13）每2×10⁶个细胞加入0.5ml FM，根据FM量，缓慢加入预先配制的等量的2× FM冻存液混匀。

（14）按每管1ml的量加入冻存管内，拧紧盖子，标记细胞代数，标号及冻存日期。

（15）放入冻存盒中-80℃过夜，之后转入液氮罐中保存。

实施例2DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc、PMX-KLF4，并 进行质粒小提和质粒大提

LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，溶于900ml H₂O中，调整pH至 7.2-7.4，加水补齐至1L，高温高压灭菌保存。

LB固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂15g，加水至1L，高温 高压灭菌，温度降至50℃左右，加抗生素，倒入100mm皿，20ml/皿，冷却凝固后4℃保存。

抗生素：氨苄青霉素配置成100mg/mL（1000×）氨苄青霉素(Amp)溶液，-20℃保存。

DH5α大肠杆菌株，购自Takara。

质粒：PMX－Oct4、PMX－Sox2、PMX－c-Myc、PMX－KLF4购自addgene。

2.1细菌转化步骤

（1）高压后的LB培养基待冷却至50℃左右加入Amp溶液，终浓度为100μg/mL。

（2）从-80℃中取出DH5α大肠杆菌株，至于冰上，将之前准备好的连接体系8μL（一 般加入的连接体系不大于感受态的1/10），加入感受态中，轻弹几下，使之混合均匀，静置与 冰上30min。将感受态置于42℃水浴90s，而后再置于冰上静置5min。加入1mL LB37℃ 180rmp/min摇1h。将体系离心去上清，90μL LB培养基重悬。

（3）将DH5α大肠杆菌涂布于Amp抗性LB平板，在37℃培养箱过夜培养，观察克隆。 2.2质粒小提（参考TIANprep Mini Plasmid Kit说明书）

（1）细菌活化：吸取冻存的菌液8μl或挑取菌落置于5ml无菌LB培养基中（加抗生 素Amp），37℃摇床中（200rpm）活化8h。

（2）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒 掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（3）取1-5ml活化的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸尽上清。

（4）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮 细菌沉淀。

（5）向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转8次使菌体充分裂解。

（6）向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转8次，充分混匀，此时将出 现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min，离心管底部形成沉淀。

（7）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。 12,000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

（8）向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心60s，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱CP3放入收集管中。

（9）重复上述步骤（8）。

（10）将吸附柱CP3放回收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂 洗液去除。

（11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80μl去离子 水（70℃），室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

（12）用Nanodrop测定OD值（OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应在1.8-2.0）。

（13）-20℃保存。

2.3质粒大提（参考Qiagen Plasmid Maxi Kit说明书）

（1）细菌活化：吸取冻存的菌液8μl或挑取菌落置于5ml无菌LB培养基中（加抗生 素Amp），37℃摇床中（200rpm）活化8h。

（2）取500μl-1ml活化的菌液加入到400ml新鲜菌液中，37℃摇床中（200rpm）培养 16h。

（3）收集菌液，放置于250ml离心杯中，4℃6,000×g离心15min。

（4）用10ml P1重悬菌沉淀。

（5）加入10ml P2，混匀，室温放置5min。

（6）加入预冷的10ml P3，立即混匀，冰上静置20min。

（7）4℃20,000×g离心30min，收集上清。

（8）4℃20,000×g离心15min，收集上清。

（9）用10ml QBT润柱子（QIAGEN-tip500）。

（10）将上清液加入到QIAGEN-tip上，通过重力作用流尽。

（11）加入QC30ml。

（12）用15ml QF洗脱DNA（QF最好加热至65℃，提高洗脱效率）。

（13）在洗脱的DNA中加入10.5ml异丙醇，混匀，4℃20,000×g离心30min。

（14）去除上清，加入5ml70%的乙醇清洗沉淀，4℃20,000×g离心10min。

（15）去除乙醇，室温晾干5min（沉淀从白色变成透明），用无菌去离子水溶解DNA 沉淀。

（16）用Nanodrop测定OD值。

（17）-20℃保存。

实施例3逆转录病毒的包装、滴度测定与冻存

3.1逆转录病毒的产生

（1）40℃水浴复苏Plat-E细胞，复苏后，将细胞置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，当 汇合度达到70-80%时，1：3传代。

（2）消化对数生长期的Plat-E细胞，计数。（当一个T75培养瓶中的Plat-E细胞汇合度 达到80-90%时，可以传到2个100mm皿中）。

（3）按每100mm皿8x10⁶-1x10⁷接种细胞。

（4）17-20h左右，观察细胞汇合度是否到90%。

（5）将培养皿中的细胞培养液换成5ml新鲜DMEM+10%FBS。

（6）配备质粒和lipofectamine2000混合液（每100mm皿）比例如下：

a)10μl lipofectamine2000+500μl OPTI-MEM，室温放置5min；

b)目的质粒10μg（PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4）+500μl  OPTI-MEM，室温放置5min；将上述两种液体a和b轻轻混合，室温静置20min。

（7）将混合液逐滴加入100mm皿中，1ml/皿，混匀，37℃，5%CO₂培养箱培养。

（8）培养8h后换新鲜的DMEM+10%FBS，37℃，5%CO₂培养箱培养。

（9）分别在培养后48h和72h收集逆转录病毒上清，用0.45μm的小滤器过滤。直接用 于实验或按需要浓缩冻存。

（10）浓缩：使用Amicon Ultra-15centrifugal filter devices(100K NMWL)进行浓缩。4,000 rpm4℃离心40min，浓缩100倍。吸取浓缩液，直接用于实验或分装冻存于-80℃。

3.2病毒滴度（TU）测定：

（1）在6孔板中铺293T细胞，1x10⁵/孔。

（2）第2天，按(原液，1：10，1：100，1：1000，1：10000)的方案对病毒进行稀释， 将病毒加入孔中，并加入polybrene（聚凝胺）至终浓度为6μg/ml。继续在培养箱中培养。

（3）感染后48h，收集感染的细胞，用流式检测GFP阳性率。按如下公式进行计算梯度： GFP+细胞%×Day1接种的293T细胞数×稀释倍数×病毒原液体积（ml）计算病毒滴度 （TU/ml）。例如：如果1：1000孔中的GFP阳性率为10%，而病毒原液体积为100μl，则病 毒滴度为：10%x10⁵x1000x0.1=10⁶TU/ml。MOI=病毒滴度/病毒液体积/感染细胞数。

（4）根据滴度及MOI，确定是否要浓缩病毒。一般情况下，若感染常规细胞系（或较 容易感染的细胞），MOI为5-10；若感染造血祖细胞，MOI为10-20；若感染造血干细胞（较 难感染的细胞），MOI为20-50。做iPS时一般采用MOI为5-10。

实施例4PUMA^-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程

（1）将P2代PUMA^-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF细胞解冻1X10⁶种在100mm的皿中， 第2天，观察细胞，根据所测病毒滴度（一般按MOI为10），计算每一个病毒所用的量，根 据用量复苏病毒。将复苏的携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4个转 录因子的逆转录病毒加入到100mm皿中，并加入polybrene至终浓度为6μg/ml。

（2）病毒感染12h后，进行换液，换为新鲜的DMEM培养基。

（3）感染48h后，复苏饲养层细胞。

（4）第3天时，将感染的MEF细胞，按常规方法消化传代至铺有饲养层细胞的100mm 皿中，细胞密度为1x10⁵/孔，培养基为小鼠ES培养基。

（5）以后每3天换液一次。

（6）第12天时，开始出现PUMA^-/-小鼠iPS克隆，支持克隆的生长。

（7）第15天，将克隆挑出。

（8）传代培养的细胞放37℃，5%CO₂培养箱培养，每天换液，大约3天扩增传代一次。 P3代以后可以冻存。

实施例5PUMA^-/-小鼠iPS细胞的培养、传代与冻存

5.1PUMA^-/-小鼠iPS细胞的培养

（1）将灭菌的0.1%Gelatin（明胶）铺于35mm皿中（Gelatin的量为覆盖培养皿底部即 可），0.5h后吸出Gelatin。

（2）复苏冻存的饲养层细胞，将冻存的饲养层细胞快速放入39℃的水浴锅内快速融化。

（3）加入DMEM培养基，1000rpm离心5min，弃掉上清。

（4）加入DMEM+10%FBS培养基中重悬细胞，用台盼蓝计数，饲养层细胞的接种密度 为2-4×10⁴/cm²，复苏后过夜。

（5）第二天，复苏PUMA^-/-小鼠iPS细胞：复苏时加入小鼠ES培养基，1000rpm，离 心5min，弃掉上清。

（6）重新加入小鼠ES培养基，用2ml的吸管，轻轻吹打，放入预先铺上饲养层细胞的 培养皿中。

（7）第三天给复苏的PUMA^-/-小鼠iPS细胞换液，隔一天PUMA^-/-小鼠iPS细胞长的足 够大时，传代。

5.2PUMA^-/-小鼠iPS细胞的传代

（1）吸出培养基，加PBS洗一遍，加适量0.025%胰酶（量不用太多，覆盖培养皿底部 即可）消化3min。

（2）显微镜下观察，见饲养层细胞已经开始松动，加入两倍体积的PBS。

（3）将所有的液体吸出，加入少量小鼠ES培养基，用移液管或枪尖吹下细胞，放入离 心管中，1000rpm离心5min。

（4）弃上清，用小鼠ES培养基重悬细胞，传至预先铺有饲养层细胞的培养皿中，传代 的数量根据细胞的数量为1：3-1：12。

5.3PUMA^-/-小鼠iPS细胞的冻存

（1）细胞长到足够大以及出现未分化细胞时，可通过胰酶的方法将细胞从培养皿上消化 下来。

（2）放入离心管中，1000rpm离心5min。

（3）弃掉上清，加入小鼠ES细胞冻存液重悬，放入2ml冻存管中，放入程序性降温冻 存盒中，放入-80℃，隔天放入液氮中。细胞冻存的数量，由细胞数量确定。

实施例6敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程

针对PUMA的shRNA的PUMA shRNA的序列如下:

克隆编号01:TTGGCTCATTTGCTCTTCACG(SEQ ID NO:1)；

克隆编号02:ATGAGATTGTACAGGACCCTC(SEQ ID NO:2)；

克隆编号03:AGTCCCATGATGAGATTGTAC(SEQ ID NO:3)；

克隆编号04：TCTCTAAACCTATGCAATG(SEQ ID NO:4)；

克隆编号05：TGTCTCCGCCGCTCGTACT(SEQ ID NO:5)；

克隆编号06：TGAGGTCGTCCGCCATCCG(SEQ ID NO:6)；

克隆编号07：AATTGGGCTCCATCTCGGG(SEQ ID NO:7)。

其中附图7和附图8中的shPUMA#1代表PUMA shRNA的克隆编号01，序列为: TTGGCTCATTTGCTCTTCACG;shPUMA#2代表PUMA shRNA的克隆编号02，序列为: ATGAGATTGTACAGGACCCTC。PUMA shRNA和siRNA购自open biosystem。

具体步骤为：

（1）人PUMA shRNA（载体Plk0.1）和人PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc、PMX-KLF 转录因子的病毒载体包装步骤如以上所述实施例3逆转录病毒的包装步骤所述。

（2）人成纤维细胞的培养基为EMDM+10%FBS，培养和传代参照PUMA^-/-小鼠的MEF 细胞。

（3）将步骤（1）中的四种逆转录病毒和人PUMA shRNA（载体Plk0.1）慢病毒一起 转入人成纤维细胞，连续两天，两次病毒转染。

（4）第三天洗掉病毒培养液，换为人成纤维细胞培养液。

（5）第四天，接种饲养层细胞于培养皿中。

（6）第五天，将诱导的人成纤维细胞培养在铺好的饲养层细胞上，利用人成纤维培养基 培养。

（7）第六天将培养基换为人ES培养基：人成纤维细胞培养基=1：1的混合培养基。

（8）第七天换为完全的人ES培养基。

（9）在饲养层细胞上培养7天后，加条件培养基，条件培养基为用人ES培养基培养饲 养层细胞一天的培养基。隔天换液一次。

（10）在20天左右出现敲降PUMA功能的人iPS细胞克隆，记为第一代敲降PUMA功 能的人iPS细胞。

（11）25天左右用机械方法将克隆挑出;

（12）第一代-第三代敲降PUMA功能的人iPS细胞代利用机械方法传代，之后可换为 1mg/ml的dispase(分散酶)化学消化传代，冷冻。

试验例1小鼠iPS细胞碱性磷酸酶染色试验

（1）重编程14天时，将已经有克隆的培养皿中的培养液洗掉，用PBS洗两次。在2%多 聚甲醛中固定2min，用PBS洗2次。

（2）加入显色液避光显色15min。

（3）再用PBS洗2次。

（4）计数紫色克隆数，克隆效率就是克隆数除以转染细胞数。

显色液来自StemTAG^TMAlkaline Phosphatase Activity Assay Kit(Colorimetric)，主要成分是 p-Nitrophenol（对硝基苯酚）。

如图1和图2所示，WT代表野生型，p53^-/-、p21^-/-、PUMA^-/-分别代表敲除相应基因形 成的iPS细胞。从图中可以看出，敲除p53^-/-、p21^-/-、PUMA^-/-都能提高iPS细胞形成率，但 与野生型的iPS细胞相比，PUMA^-/-小鼠iPS细胞形成率最高。

试验例2PUMA^-/-小鼠iPS细胞的多能性基因鉴定

4%多聚甲醛PFA配制：1)称取4g PFA（有毒，注意防护），置于三角烧瓶或烧杯中。 2)加入50-80ml DPBS（杜氏磷酸缓冲液），加热至60℃左右，磁力搅拌使粉末完全溶解。3) 通常加入几滴1N NaOH可以使溶液清亮。4)最后补足PBS于100ml，充分混匀。

（1）第一天，按常规方法将冻存的饲养层细胞，放入39℃的水浴锅中，快速解冻，按 上述细胞密度接种于铺有0.1%的Gelatin（明胶）的12孔板中。

（2）第二天将培养的PUMA^-/-小鼠iPS细胞按人ES细胞方法进行传代，将消化好的细 胞传至预先铺有饲养层细胞的12孔板中。

（3）细胞大约3天时状态比较好（分化细胞较少，细胞足够大），将长好的PUMA^-/-小 鼠iPS细胞用PBS洗涤2次，每次5min。

（4）4%多聚甲醛室温固定15min。

（5）PBS洗涤3次，每次5min。

（6）用含0.1%的Triton-X-100透膜10min。

（7）PBS浸泡5min。

（8）将几个孔中加入山羊血清工作液，室温封闭15min。

（9）吸出山羊血清工作液后，每孔分别加入稀释好的anti-Sox2(1:300)，anti-SSEA-1 (1:500)，anti-Nanog(1:100)，anti-Oct4(1:200)抗体工作液50μl，4℃过夜。

（10）吸出液体，然后用PBS洗涤3次，每次5min。

（11）每孔再加入相对应的二抗Alexa FLuor488Donkeny Anti-rabbit IgG或 Alexa555-conjugated goat anti-mouse IgM/IgG(1:1000)，室温避光孵育1h。

（12）吸出液体，PBS洗涤3次，每次5min。

（13）DAPI复染，5min。

（14）PBS洗涤两次，然后用蒸馏水冲洗后晾干。

（15）荧光显微镜下观察试验结果。

如图3所示，图A1标记的是Oct4基因，图A2标记的是Nanog基因，图A3标记的是Sox2 基因，图A4标记的是SSEA-1基因，PUMA^-/-小鼠iPS细胞能像ES细胞一样表达4个标记基 因。

试验例3畸胎瘤形成实验

（1）选取核型鉴定为正常染色体的PUMA^-/-小鼠iPS细胞，核型鉴定正常染色体的比例 大于80%为可用的PUMA^-/-小鼠iPS细胞，传代培养扩增核型鉴定合格的PUMA^-/-小鼠iPS细 胞，扩增至约两个100mm皿。

（2）用trypsin（胰蛋白酶）消化细胞。

（3）将消化好的PUMA^-/-小鼠iPS细胞收集到15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃 掉上清。

（5）加入Knockout DMEM重悬细胞，并计数，调至终浓度为2x10⁶/100μl左右。

（7）用1ml注射器吸取100μl细胞悬液，注射到SCID小鼠腹股沟皮下。

（8）1个月左右可见SCID小鼠皮下形成畸胎瘤。

（9）将长畸胎瘤的小鼠处死后，用剪刀小心的在肿瘤四周将肿瘤剥离下来（注意不要碰 到肿瘤组织，以免破坏肿瘤的结构）。

（10）将切下的肿瘤组织，放入10%甲醛溶液中固定24h后，进行石蜡包埋和组织切片。

（11）将组织切片进行H.E染色来确定肿瘤的组织形态。

如图4所示，图4A为外胚层，图4B为中胚层，图4C为内胚层，PUMA^-/-小鼠iPS细胞 能使小鼠形成正常的畸胎瘤。

试验例4嵌合体小鼠形成试验

（1）第一天下午5点左右给8-10周的雌性BDF1小鼠腹腔注射10U PMSG催卵。

（2）48h后给予打过PMSG的母鼠继续打10U HCG，并立刻将打过的母鼠置于公鼠笼 内进行交配。同时将ICR母鼠置于结扎的公鼠笼内，进行交配。

（3）第四天上午去检查母鼠阴道口是否有阴道栓，并将具有阴道栓的小鼠收集，备用。

（4）第五天检查ICR母鼠阴道口是否有阴道栓，然后将具有阴道栓的母鼠视为代孕母 鼠取出备用。

（5）取3.5天的囊胚：用CO2猝死方法杀死具有阴道栓的BDF1母鼠，取出子宫后将 0.5ml囊胚培养基（H-CZB）用1ml针筒注射入子宫腔内冲出囊胚，并移入培养箱中进行培 养。

（6）准备iPS细胞进行囊胚注射：细胞状态最好的时候，消化贴壁离心，去除饲养层细 胞并吹打成单细胞后，用少量DMEM重悬，放于冰上备用。

（7）10-15个多功能干细胞被注射到扩张的E3.5囊胚（来自BDF1×BDF1）中，体外恢 复5min之后，放入37°C，5%CO2的培养箱中恢复3h。

（8）将恢复后的好的囊胚移植到假孕见栓2.5天的小鼠（ICR）子宫内，每侧子宫移植 15个左右的胚胎。

（9）移植后19天时，假孕小鼠会生下嵌合体小鼠（毛色黑白相间），如图5所示，通 过毛色对比观察小鼠的嵌合率，从而确定iPS的多能性。因为iPS细胞来自C57背景（毛色 为黑色），而囊胚来自ICR小鼠（毛色为白色），如果嵌合体黑色比例较高，说明iPS嵌合率 较高，即iPS分化的细胞类型更多。

试验例5细胞核型鉴定

准备配置：1)低渗液配制：0.4%氯化钾用时放入37℃水中预热。2)固定液配制：甲 醇：冰醋酸=3：1，现用现配。3)G显带消化液配制：胰酶(Sigma G4507-5G)30mg，加入 0.9%生理盐水（or D-Hanks）50ml中，用时37℃水浴30min。

具体步骤为：

（1）当iPS细胞大小合适时，约传代2天时，加入0.25g/ml的秋水仙素处理细胞3.5h。

（2）配低渗液：0.4%氯化钾现用现配，每个细胞系用5mL，并在水浴锅中预热胰酶（每 个细胞系约500μl胰酶）和低渗液。

（3）加入0.025%的胰酶消化，加入小鼠干细胞培养液进行中和，将中和后的细胞吹打 为单细胞，800rpm离心5min后，弃上清，收获细胞。

（4）将收获的细胞中加入预热的低渗液51ml，37℃中，低渗5min，同时配固定液： 甲醇与冰醋酸按3：1配，现用现配，每个细胞系为7mL。

（5）预固定，加固定液7滴，轻轻以气泡冲匀，800rpm离心5min。

（6）固定：去上清，加入固定液4ml，轻轻以气泡冲匀，固定40min，800rpm离心5min， 去上清，加固定液2ml，第二次固定20min（这两步固定都可以4℃或室温过夜）。

（7）滴片：800离心5min，去上清，加入新鲜固定液4滴，气泡冲匀，即可进行滴片 2-3张。

（8）滴片时将细胞悬液1-2滴，滴到预先遇冷过的4℃冰水或干燥的洁净玻片上，晾干。

（9）放入65℃烤箱中烘烤过夜。

（10）染色：第二天取出烤干的载玻片加入1滴Giemsa原液，15s后，加入2滴稀释后 的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液的稀释为：1份磷酸缓冲液原液加上9份等体积的蒸馏水），并用 吸耳球吹打均匀后，进行染色，染色时间为室温10min，10min后用流水轻轻清洗，室温晾干 后进行核型分析，在一组实验中，我们随机选择20个以上的细胞中期分裂相进行观察并统计 核型的正确率，核型正确率大于80%的为核型正常可用的细胞。

（11）核型显带：将配好的消化液放入37℃水浴中30min，并加入3%Tris1.5ml（PH=7.6）。

（12）放入烤后的片子，30s-50s（每个地方条件不一样，较干燥的地方时间较短)后， 取出片子迅速放入干净清水中洗掉胰酶，用Giemsa染液室温10min。然后用流水轻轻清洗， 室温晾干后就可以进行核型分析，结果如图6所示，PUMA^-/-小鼠iPS细胞基因组的稳定性与 野生型的iPS细胞相比无显著性差异P＜0.05，p53^-/-和p21^-/-的iPS细胞的基因组的稳定性和 野生型的iPS细胞相比有显著性差异P＜0.05，试验结果说明，敲除PUMA基因能够保护小 鼠iPS细胞的基因组稳定性。

试验例6人iPS细胞形成率的测定

（1）稀释抗体：TRA-1-60抗体（1:300）和Alexa Fluor555-conjugated二抗（1:500）稀 释到人ES培养基里。

（2）含有克隆的6孔板中，吸掉培养基，PBS洗一遍，每孔加入0.5ml含有抗体的人 ES培养基，37°C，5%CO2培养箱中孵育1h。

（3）吸掉培养基，每孔加入1ml PBS洗一遍。

（4）每孔加入1ml人ES培养基，在倒置荧光显微镜下计数阳性克隆数。iPS形成效率 就是将克隆数除以电转细胞数。

如图7所示，慢病毒shPUMA#1和shPUMA#2能敲降人iPS细胞的PUMA基因的表达， 如图8所示，将慢病毒shPUMA#1和shPUMA#2敲降人PUMA基因后，能够提高人iPS细 胞的形成率，且人iPS细胞的形成率与人PUMA功能的抑制程度成正比。

用慢病毒shRNA抑制人PUMA的表达但对基因组的稳定性没有影响，敲降PUMA功能 在小鼠iPS细胞核型鉴定实验结果中表明其对iPS细胞基因组稳定性具有很好的保护作用。 以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被 认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归 属于本发明的专利涵盖范围之内。