芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(PLGGPS)基因及其编码产物和应用

摘要

本发明公开了一种芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(PLGGPS)基因及其编码蛋白与用途，该基因为首次利用构建cDNA文库从芍药中克隆而得，填补了从我国传统中药材芍药中分离克隆出牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶基因的空白。本发明所提供的芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(PLGGPS)基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(PLGGPS)基因可以通过生物技术提高芍药中二萜类代谢产物的含量，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及利用芍药cDNA文库克隆牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合 酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的有机酸、萜类酶基因及其 编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因 组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的 研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其 调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直 接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。药用植物的化学成分复杂，种类繁多，其中 主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分，芍药Paeonia  lactiflora不仅是名花，还是一味常用中药，其根可供药用。其中白芍具有镇痉、镇痛、通经 等作用。芍药根中含有芍药苷、安息香酸等活性成分，其中芍药苷属于单萜类化合物，具有 显著的镇痛、镇静、抗惊厥、，解痉、解热、抗炎、抗溃疡、抗过敏、降血糖、调节免疫、保 护肝脏等作用(杨俊，方红编。芍药[M]。北京：中国中医药出版社，2001，113)。

牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，type II，GGPS)可催化15 碳的法呢基焦磷酸(FPP)与另一个5碳分子异戊烯基焦磷酸(IPP)可合成20碳的牻牛儿牻牛儿基 焦磷酸(GGPP)，GGPP是二萜类物质的生物合成的关键前体物质，植物中许多重要成分均是 二萜类化合物，其表达量可能与芍药苷等萜类成分的含量密切相关。FPP是倍半萜的前体物 质，可由法呢基焦磷酸合酶(FPS)催化牻牛儿基焦磷酸(GPP)和IPP生成，而GPP是单萜的直 接前体物质，GGPS活性可能与GPP的含量存在一定关系。芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶 (PLGGPS)基因的克隆，为利用基因工程提高芍药活性成分含量提供重要基础，在药材芍药的 品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。在本发明被公布之前，尚未 有任何公开或报道过本专利申请中所提及的芍药中牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶基因及其氨基 酸序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(PLGGPS)基因。

本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。

本发明所提供的芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(PLGGPS)基因，为以下核苷酸序列之 一：

(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或 者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

该基因所编码的蛋白质为芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(PLGGPS)基因，是以下氨基酸 序列之一：

(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。

本发明所提供的芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶(PLGGPS)基因是首次从芍药中克隆制 备的，体外实验表明，PLGGPS具有催化15碳的法呢基焦磷酸(FPP)与另一个5碳分子异戊 烯基焦磷酸(IPP)可合成20碳的牻牛儿牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的活性。利用本发明可以通过 基因工程技术来提高芍药等植物中萜类物质含量。

附图说明：

图1：PLGGPS功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；

图2：PLGGPS系统进化树(邻接法)；

图3：表达载体pQE30-PLGGPS构建；

具体实施方式

实施例1、芍药cDNA文库的构建

1、芍药总RNA的分离和检测

取芍药(Paeonia lactiflora)的根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃ 预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L^-1，EDTA 25m mol·L^-1，NaCl 2.0mol·L^-1，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等 体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃ 沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5％，NaCl 1mol·L^-1，Tris-HCl (pH8.0)10mmol·L^-1，EDTA 1mmol·L^-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g 离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2小时；4℃13000g离心20分钟， 沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完 整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

2、cDNA文库的构建

采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit，Pharmacia公司) 分离mRNA后，采用Clontech公司的Creator Smart cDNA Library Construction Kit (Cat.No.634903)进行建库，原理为SMART(switch mechanism at 5′end ofmRNA template)。

实施例2：芍药相关基因的克隆

随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加 入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次 加入：Taq buffer  2.5μL，MgCl₂(25mM)1.8μL，dNTP(2.5mM)1μL，M13+引物(10pmol) 1μL，M13-引物(10pmol)1μL，Taq酶0.4μL。PCR反应条件为94℃预变性5分钟后， 94℃40秒，54℃40秒，72℃4分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。待PCR 反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半 小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。选择条带单一扩增 产物送至华大基因公司进行测序，获得芍药相关基因序列。

实施例3、PLGGPS基因的生物信息学分析

本发明涉及的芍药牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的长度为1110bp，详细序 列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于1-1110bp。将芍药全长cDNA序列用BLAST 程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基 酸水平上与其它物种中的GGPS有较高的同源性，同时具有典型的Geranylgeranyl  pyrophosphate synthase结构域。如图1。

实施例4、PLGGPS基因功能的研究

1.重组质粒的构建

以PLGGPS cDNA为模板，利用引物P1：5′- GAATTCATGAGTGCTGTGAATTTGAGTTCAT-3′，P2：5′- AAGCTTTTAATTCTGCCTGTGAGCAATGTAA-3’′进行PCR反应，反应体系同实验例2。取 5ul扩增产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为 1122bp。用EcoR I和Hind III在37℃下双酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara公 司，中国)纯化酶切产物。同时利用EcoR I和Hind III在37℃下酶切pMD-19TVector 2小时， 加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用回收试剂盒回收片段。

回收片段经T4连接酶在16℃连接过夜。电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有 氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。含PLGGPS克隆的pMD19质粒经PCR和限制性内切 酶酶切鉴定和DNA序列分析，保存具有正确目标序列的重组质粒pMD-PLGGPS。然后用EcoR

I和Hind III双酶切携带PLGGPS的pMD-19质粒，获得PLGGPS片段。 2.原核表达及载体构建

EcoR I和Hind III双酶切pQE30载体，2小时后回收开环的pQE30片段。PLGGPS和 pQE30回收片段于16℃连接过夜，获得重组质粒，经PCR和限制性内切酶酶切鉴定和DNA 序列分析，证明含有正确序列的PLGGPS，该表达载体命名为pQE30-PLGGPS(图3)。

用目标质粒pQE30-PLGGPS利用CaCl₂方法转入E.coli M15感受态细胞，培养筛选含有 pQE30-PLGGPS质粒的阳性菌株(M15-pQE30-PLGGPS)。挑取单菌落的M15-pQE30-PLGGPS 工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养过 夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡 那霉素)中培养约3小时，至OD600达O.5后，取1ml菌液作为诱导前对照，然后加入终 浓度为1mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在37℃振荡培养中诱导工程菌表达， 于诱导3h后取样1ml，以含有pQE30空载体的E.coli M15培养物为阴性对照。SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为39.6kD处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与 理论值一致。

3.PLGGPS基因功能分析

EcoR I和Hind III双酶切pBlueScript II KS(-)vector，2h后回收开环的pBlueScript II KS(-)片段。PLGGPS和pBlueScript II KS(-)回收片段于16℃连接过夜，获得重组质粒，经PCR 和限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析，证明含有正确序列的PLGGPS，该表达载体命名 为pBlueScript-PLGGPS。利用CaCl₂方法转入大肠杆菌DH10B(该菌带有pACCAR25ΔcrtE质 粒，质粒上带有来源于噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)合成类胡萝卡素的ctr基因簇，但缺 失该种中的ctrE即GGPS基因)在含100ug/mL氨苄青霉素的LB平板上培养，以没转入PLGGPS基 因的大肠杆菌DH10B为对照。

在生长大肠杆菌的平板上，没有转入PLGGPS基因的大肠杆菌DH10B在平板上生长的颜 色为白色，转入了PLGGPS基因的大肠杆菌DH10B在平板上生长的颜色为黄色，说明在转入 了PLGGPS基因的转化平板上有类胡萝卡素的生成，说明PLGGPS能代替噬夏孢欧文氏菌 (Erwiniauredovora)中的ctrE基因，促进类胡萝卡素的生成。

5.突变GGPS活性测定

以PLGGPS cDNA为模板，利用突变引物P3：5′- GAATTCATGAGCGCTGTGAATTTGAGTTCAT-3′，P4：5′- AAGCTTTTAATTCTGCCTGTGAGCAATGTAA-3′进行PCR反应，表达载体的构建、原核表 达及PLGGPS基因功能分析方法同上，结果表明突变PLGGPS转基因工程酵母与正常 PLGGPS酵母没有显著差异。