一种蝉棒束孢菌株的试管筛选方法及培养基

摘要

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种蝉棒束孢菌株试管筛选法，其步骤包括：采集野生蝉花或其分生孢子，通过平板培养基对其进行分离纯化，获得蝉棒束孢单菌落；从上一步的平板培养基上挑取蝉棒束孢单菌落至斜面培养基，培养获得分生孢子；收集上一步获得的分生孢子，配制孢子液，接种到装有小麦制备的试管培养基的试管内；培养并观察试管中子实体、孢子或菌丝产生情况。本发明的蝉棒束孢菌株试管筛选法采用试管培养，占用培养面积小、操作方便、培育周期短，减少了摇瓶种子培养过程、劳动强度大大降低、并且还降低了筛选过程中的能耗；并且小麦培养基还起到了较好的蝉棒束孢菌株选择培养效果。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种蝉棒束孢菌株的试管筛选方法及培养基。

背景技术

蝉花是药用虫生真菌，为我国传统名贵中药材，又名蝉蛹草、蝉茸、胡蝉、蜩等，其 天然寄主有竹蝉、蟪蛄、山蝉、小鸣蝉等。其药用始载于南北朝刘宋时代的《雷公炮炙论》。 传统医学认为，蝉花具有疏散风热、透疹、熄风止痉、明目退翳之功效。现代医学研究表 明，它具有免疫调节、改善机体营养状况、改善肾功能、抗肿瘤、抗病毒、解热镇痛、镇 静催眠、滋补强壮等多种生理功能。研究证实蝉花含有丰富的生物活性物质和营养成分， 蝉花含有丰富的蛋白质、氨基酸、微量元素、脂肪酸、维生素以及糖类等营养物质，是不 可多得的营养保健食品；此外还含有多糖、虫草酸、腺苷、麦角甾醇、透明质酸、多球壳 菌素等生理活性成分。

蝉花因其药用价值已经被老百姓所广泛认可，但野生蝉花资源的稀缺和产生的季节限 制，其产量远不能满足市场需求。蝉花的人工培养将是满足市场需求的重要途径。但是， 由于寄主、环境、气候等影响，形成了蝉棒束孢菌株的生物多样性（刘爱英，贵州农业科 学，2007，35(2)：9～11），有的菌株适合形成子实体，有的菌株适合产生分生孢子，还有 的菌株适合产生菌丝。如何从丰富的蝉棒束孢菌株中快速筛选出目的菌株，是人工培养蝉 棒束孢的重要环节。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种操作方便、培育周期短、节省能源 的蝉棒束孢菌株的试管筛选方法及培养基，通过试管培养对菌株的产子实体、产孢子或产 菌丝体能力进行初步判断。

本发明第一方面公开了一种蝉棒束孢菌株的试管筛选法，步骤如下：

1）采集野生蝉花或其分生孢子，通过含抗生素的马铃薯-葡萄糖或含抗生素的马铃薯-蔗 糖平板培养基对其进行分离纯化，获得蝉棒束孢单菌落；

2）从步骤1）的平板培养基上挑取蝉棒束孢单菌落至马铃薯-葡萄糖或马铃薯-蔗糖斜面培 养基，培养获得分生孢子；

3）收集步骤2）获得的分生孢子，加灭菌水充分震荡混匀，配制孢子液；将小麦用水浸泡 充分吸胀后沥干，将吸涨后的小麦装入试管中，并按照吸涨后的小麦：水=1：1~1.5的 质量比向试管中加水，塞上棉塞，灭菌，制备得到试管培养基；

4）将步骤3）的孢子液接种到试管培养基内，培养并观察试管中子实体、孢子或菌丝产生 情况。

较优的，步骤1）所述含抗生素的马铃薯-葡萄糖平板培养基配方为：

所述含抗生素的马铃薯-蔗糖平板培养基配方为：

较优的，步骤1）平板培养基的培养条件为23~26℃，黑暗培养4~6天。

较优的，步骤2）所述马铃薯-葡萄糖斜面培养基配方为：马铃薯15～25wt％，葡萄 糖1.5～2.5wt％，琼脂1.5～2.5wt％，余量为水；所述马铃薯-蔗糖斜面培养基配方为：马铃 薯15～25wt％，蔗糖1.5～2.5wt％，琼脂1.5～2.5wt％，余量为水。

较优的，步骤2）所述斜面培养基的培养条件为23~25℃，黑暗培养10~15天。

较优的，步骤3）所述孢子液的浓度为10⁶~10⁷个/ml。

较优的，步骤3）中，每支试管装入1/7～1/3试管体积的吸涨后的小麦。

步骤3）灭菌条件为121℃灭菌40～60分钟。

较优的，步骤4）孢子液接种到试管培养基的接种量为5%~10v/w%；所述试管培养基 的培养条件为20~25℃下，光照强度50~200Lux，培养20~25天。

本法第二方面，公开了一种小麦培养基在筛选蝉棒束孢菌株中的应用，所述小麦培养 基的组成为充分吸涨并沥干的小麦以及水，并且充分吸涨并沥干的小麦和水的质量比为1： 1～1.5。

较优的，所述充分吸涨并沥干的小麦的制备方法为将小麦浸入水中浸泡8～12h，取出 小麦并沥干。

本发明的优点在于：1）本发明的试管培养法占用培养面积小、操作方便、培育周期短， 相比于传统罐头瓶培养筛选法，本发明的试管筛选法减少了摇瓶种子培养过程、劳动强度 大大降低、同时降低了能耗；2）本发明创新性的采用了小麦培养基对蝉棒束孢菌株的生长 类型进行区分，实现了蝉棒束孢菌种较好的选择培养效果，能够区分从野外采集到的蝉棒 束孢菌株的适宜培养类型。

附图说明

图1：本发明来自实施例1编号1菌株试管培养物

图2：本发明来自实施例2编号2菌株试管培养物

图3：本发明来自实施例3编号3菌株试管培养物

图4：本发明来自实施例4编号1菌株罐头瓶培养物

图5：本发明来自实施例4编号2菌株罐头瓶培养物

图6：本发明来自实施例4编号3菌株罐头瓶培养物

图7：本发明来自实施例5编号1菌株罐头瓶培养物

图8：本发明来自实施例5编号2菌株罐头瓶培养物

图9：本发明来自实施例5编号3菌株罐头瓶培养物

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步描述，应理解实例并非用于限制本发明的保护 范围。

实施例1

从野外采集野生蝉花（编号1），带回实验室，用接种针挑取分生孢子至含抗细菌抗生 素的马铃薯葡萄糖平板培养基，平板培养基的成分为：马铃薯20wt％，葡萄糖2wt％，琼 脂2wt％，抗生素0.01％。25℃黑暗培养4天。从平板培养基中挑取蝉棒束孢菌落至马铃薯 葡萄糖斜面培养基中，斜面培养基的组成为：马铃薯15wt％，葡萄糖2.5wt％，琼脂2.5wt％， 25℃培养10天，获得编号1菌株。用接种环从斜面刮取成熟的分生孢子，加入灭菌水中充 分震荡混匀，配制成10⁶个/ml的孢子悬浮液。将小麦浸泡过夜后沥干，并向试管中加入1/4 试管体积的吸涨小麦（4g），并加水6ml，塞上棉塞，121℃灭菌50分钟，冷却。将孢子悬 浮液按照5v/w%接种量（0.5ml）接到小麦培养基上，重复3管。20℃条件，光照强度 50~200Lux，培养25天。将培养物取出观察、描述。实验结果如图1所示，每根试管中均 长出1~2根子实体。

实施例2

从野外采集野生蝉花（编号2），带回实验室，用接种针挑取分生孢子至含抗细菌抗生 素的马铃薯蔗糖平板培养基中，平板培养基的组成为：25wt％，葡萄糖1.5wt％，琼脂2.5wt％， 抗生素0.02％，23℃黑暗培养5天。从平板培养基中挑取蝉棒束孢菌落至马铃薯蔗糖斜面 培养基中，斜面培养基的组成为：马铃薯20wt％，蔗糖1.5wt％，琼脂1.5wt％，23℃培养 15天，获得编号2菌株。用接种环从斜面刮取成熟的分生孢子，加入灭菌水中充分震荡混 匀，配制成10⁷个/ml的孢子悬浮液。将小麦浸泡过夜后沥干，并向试管中加入1/7试管体 积的吸涨小麦（2.5g），并加水3.75ml，塞上棉塞，121℃灭菌50分钟。将孢子悬浮液按照 10v/w%（0.625ml）接种量接种到小麦培养基上，重复3管。25℃条件，光照强度50~200Lux， 培养20天。将培养物取出观察、描述。实验结果如图2所示，每根试管中均只产生分生孢 子。

实施例3

从野外采集野生蝉花（编号3），带回实验室，用接种针挑取分生孢子至含抗细菌抗生 素的马铃薯蔗糖平板培养基，平板培养基的组成为：15wt％，蔗糖2.5wt％，琼脂1.5wt％， 抗生素0.015％，24℃黑暗培养5天。从平板培养基中挑取蝉棒束孢菌落至马铃薯蔗糖斜面 培养基中，斜面培养基的组成为：马铃薯25wt％，蔗糖2.0wt％，琼脂2.5wt％，24℃培养 13天，获得编号3菌株。用接种环从斜面刮取成熟的分生孢子，加入灭菌水中充分震荡混 匀，配制成5×10⁶个/ml的孢子悬浮液。将小麦浸泡过夜后沥干，并向试管中加入1/3试管 体积的吸涨小麦（5g），并加5ml水，塞上棉塞，121℃灭菌50分钟。将孢子悬浮液按照 7.5v/w%（0.75ml）接种量接种到小麦培养基上，重复3管。温度23℃，光照强度50~200Lux， 培养23天。将培养物取出观察、描述。实验结果如图3所示，每根试管中均只长菌丝。

实施例4

将编号1菌株、编号2菌株、编号3菌株培养成熟斜面，用接种接种环刮取分生孢子， 分别接入马铃薯蔗糖摇瓶培养基中，25℃,150rmp，摇床培养3天。

将小麦清洗、浸泡、沥干后，加等比的水，121℃灭菌50分钟，冷却。将摇瓶种子液 分别按5v/w%比例接种到小麦培养基上，充分混匀，重复5瓶。培养温度23℃，光照强度 50~200Lux，培养25天。将培养物取出观察、描述，并对照实施例1、实施例2、实施例3 进行评价。

结果显示，编号1菌株每瓶都长出了较多的子实体，实验结果见图4；编号2菌株每 瓶都只产生分生孢子，实验结果见图5；编号3菌株每瓶都只产生菌丝，实验结果见图6； 上述实验结果表明，实施例1-3方法获得菌株生长特性均与本实施例一致，证实了本发明的 蝉棒束孢菌株试管筛选法能够准确获得所采集的野生蝉花的生长特性，并且实验结果具有 可重复性能从丰富的蝉棒束孢菌株中快速筛选出目的菌株，用于蝉棒束孢的人工培养。

对照实验

将编号1菌株、编号2菌株、编号3菌株培养成熟斜面，用接种接种环刮取分生孢子， 分别接入马铃薯蔗糖摇瓶培养基中，25℃,150rmp，摇床培养3天。在大米中加加1.5倍重 量的水，121℃灭菌30分钟，冷却。将摇瓶种子液分别按5v/w%比例接种到大米培养基上， 充分混匀，重复5瓶。培养温度23℃，光照强度50~200Lux，培养25天。将培养物取出观 察、描述，并与实施例4对比评价。

结果显示，编号1菌株每瓶都长出大量分生孢子，子实体几乎不能生长，实验结果见 图7；编号2菌株每瓶都只产生分生孢子，实验结果见图8；编号3菌株每瓶都产生少量菌 丝，并伴有大量分生孢子，实验结果见图9；上述实验结果表明，实施例1-3方法获得菌株 生长特性均与产生分生孢子有关，表明实施例5中的培养基不能将一些具有特定生长特性 的菌株区分开。