用于ATP合成的酿酒酵母菌及其应用

摘要

本发明公开了一种能够用于ATP合成的酿酒酵母菌及其应用。本发明的酿酒酵母菌能够高效的合成ATP，解决了ATP合成成本高的问题，具有广泛的工业应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体而言，涉及一种用于ATP合成的酿酒酵母菌及其应用。 

背景技术

ATP合成方法主要分为化学合成法、酶催化法以及微生物发酵体系： 

化学合成法 

一般是以带磷酸基团的化合物作为磷酸基给体，在催化剂的催化下磷酸给体的磷酸基团被选择性地活化后转移到反应底物AMP或ADP上生成ATP，反应专一性强，产物易分离，但磷酸化试剂盒催化剂比较昂贵，转化率相对较低，并且产物活性不太稳定，故此阻碍该方法在ATP工业化生产中的应用。 

生物合成法 

酶催化法 

酶催化合成ATP基本反应过程是磷酸基供体在磷酸化激酶的催化下，将磷酸基转移给AMP或ADP，生成ATP，该方法是ATP合成研究中的热点之一，目前，由于酶的价格昂贵，仍未在工业上得到广泛应用。 

光合磷酸化合成法 

该方法是在提供光照的条件下，利用光合细菌中分离的载色体或从植物组织中分离的叶绿体，以及具有光自养能力的藻类细胞，将底物AMP或ADP和无机磷酸反应生成ATP。该方法具有原料来源丰富，成本低廉等特点，也是目前研究的热点之一。 

氧化磷酸化合成法 

该方法是利用真核细胞的线粒体，在呼吸作用提供的能量下将底物AMP 或ADP磷酸和无机磷酸反应合成ATP。但由于真核细胞的线粒体分离困难，并且稳定性差等难题限制其在工业化中的应用。 

利用微生物酶系发酵合成法 

该方法是直接利用微生物细胞作为酶源转化合成ATP，与单一的酶催化不同，具有转化成本低，转化效果好等特点，在工业中应用比较广阔。 

1、产氨短杆菌 

乔宾福等人利用产氨短杆菌向培养基中添加腺嘌呤合成ATP，发酵液中ATP浓度达2g/L(3.94mmol/L)，存在的问题是底物浓度低，产物不易分离，总收率低等。 

2、面包酵母 

廖鲜艳等人对面包酵母合成ATP的影响因素的研究中，以AMP为底物合成ATP，产物浓度最高达9.02mmol/L。厉仓等人利用面包酵母细胞酶系作为酶源，以AMP为底物转化合成ATP，反应液产物浓度达到10mmol/L。 

3、啤酒酵母 

朱家荣等人利用固定化啤酒酵母为酶源，以腺嘌呤为底物转化合成ATP，其目的产物ATP最高达2.46g/L(4.85mmol/L) 

黎立奇等人利用啤酒酵母细胞为酶源，以腺苷为底物转化合成ATP，产物最终浓度达到68.1mmol/L以上。 

综合以上背景技术来看，如何获得高效的微生物来合成ATP仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能够用于ATP合成的酿酒酵母菌及其应用。 

本发明的酿酒酵母菌为保藏编号CGMCC NO.7397的酿酒酵母菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，或者是与CGMCC NO. 7397的酿酒酵母菌具有95％以上亲缘性的酿酒酵母菌。 

本发明另一方面还涉及上述酿酒酵母菌在合成ATP中的应用。 

本发明的酿酒酵母菌能够高效的合成ATP，解决了ATP合成成本高的问题，具有广泛的工业应用价值。 

微生物信息 

本发明的一个优选实施方式以及具体实施方式中所使用的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.7397，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年4月1日。 

酵母菌株CGMCC NO.7397采用下述流程进行选育： 

土壤样品→→富集培养→→麦芽汁琼脂平板初选→→液体发酵复筛→→麦汁琼脂平板分离纯化→→产酶发酵培养→→腺苷转化试验→→中试试验。 

在显微镜下观察，该菌体细胞呈球形，端生芽殖，在固体培养基上，该菌菌落为乳白色，表面平滑，边缘整齐，经中国科学院微生物研究所鉴定为酿酒酵母。利用该菌株能够以腺苷为起始原料合成腺苷三磷酸。 

本发明菌株ATP合成能力测试 

(1)测定条件按照高效液相色谱法(中国药典2010版)检测： 

①色谱柱条件：C18反向柱，250mm*4mm 

②色谱条件与系统实用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8g，磷酸二氢钾13.6g，加水900mL溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000mL，摇匀)-甲醇(95∶5)为流动相；柱温35℃，流速为1mL/min，检测波长为259nm，理论塔板数按三磷酸腺苷峰计算不低于1500，出峰次序 依次为一磷酸腺苷钠，二磷酸腺苷二钠和三磷酸腺苷二钠，各色谱峰的分离度应符合要求。 

(2)测定方法 

总核苷酸：取本品适量，精密称定，加0.1mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠35.8g，加水至1000mL，无水磷酸二氢钾13.6g，加水至1000mL，两液互调pH值至7.0)使溶解并定量稀释制成每mL中含20ug的溶液，照紫外-可见分光光度法(附录IVA)测定，在259nm的波长处测定吸光度，按C10H14N5Na2O13P3的吸收系数为279计算； 

三磷酸腺苷二钠的重量比：按照高效液相色谱法(附录VD)测定，取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含0.4mg的溶液，取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算三磷酸腺苷二钠(TATP)在总核苷酸中的重量比。 

T₁：一磷酸腺苷钠峰面积 

T₂：二磷酸腺苷二钠峰面积 

T_ATP：三磷酸腺苷二钠峰面积 

T_n：其他物质的峰面积 

按下式计算样品中三磷酸腺苷二钠含量： 

三磷酸腺苷二钠含量(％)＝总核苷酸×三磷酸腺苷二钠重量比×100％ 

3、菌体细胞酶活力测定方法 

以腺苷(0.5％)为底物，磷酸盐(50mmol/L)为缓冲液，在35℃水浴条件下反应2小时后，用3N盐酸调pH值至3.0左右，终止反应，终止液经过超声波破碎(800W，5min)处理，10000rpm离心30min，用纯化水稀释50倍 后检测目的产物含量。 

利用筛选到的菌株为酶源，以腺苷为底物，在ATP的转化合成条件下进行合成ATP试验，结果显示反应液中目标产物积累浓度最高达135.8mmol/L。 

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。