与黄瓜抗、感黑斑病基因紧密连锁的基因片段及抗性鉴定方法

摘要

本发明公开了与黄瓜抗、感黑斑病基因紧密连锁的基因片段及抗性鉴定方法，用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列，由上游引物和下游引物组成，上游引物是SEQ ID No1所述序列，下游引物是SEQ ID No2所述序列。利用本发明的引物序列及其扩增出的黄瓜抗黑斑病基因片段和黄瓜感黑斑病基因片段对构建的F2代分离群体和黄瓜种质资源进行黑斑病抗性评价，其结果与人工接种鉴定符合率分别达95.60%、93.42%，在黄瓜育种中进行资源抗性筛选具有很大的应用价值。以这些序列为依据，可以进行抗黑斑病标记辅助选择、育种，用作黄瓜育种中检测黄瓜抗黑斑病基因的探针；可以为进行抗黑斑病基因定位、作图与克隆。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，涉及黄瓜常规杂交育种、分子标记辅助育种的方法 与技术。特别是与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段、与黄瓜感黑斑病基因紧密连锁的 基因片段，鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法。

背景技术

黄瓜（Cucumis Sativus L.）是葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis）一年蔓生草本 植物，是全球普遍栽培的主要蔬菜作物，是中国种植面积最大的蔬菜之一。黄瓜黑斑病 [Cucumber alternaria leaf spot，Alternaria cucumerina]是近几年发展起来的一种由瓜链格孢菌 引起、为害严重的真菌性病害，目前已成为黄瓜保护地、露地栽培的重要病害之一。俗称烤 叶病、烧叶病，幼苗、成株均可发病。主要危害叶片，一般先从黄瓜的中、下部叶片开始发 生，而后逐渐向上蔓延，最后仅剩下顶端几片绿叶，病株似火烤状。病斑多数沿叶脉两侧的 叶肉组织发展，主脉一般不受害。发病严重时多个病斑连成一片，叶肉组织枯死，叶缘向上 卷起，叶子焦枯，但不脱落。黄瓜黑斑病一般在4月中旬至5月上、中旬发生，发病率高达60% 以上，减产10～20％。结瓜期发病，如果防治不及时，会造成绝产，给种植户造成巨大经济 损失。尤其在蔬菜高度产业化的今天，基于传统的抗病育种模式严重制约着黄瓜品种的更新 换代、生产产业化的步伐，利用现代生物技术手段进行黄瓜抗病分子标记辅助育种势在必行。

分子标记的应用为蔬菜育种学开辟了崭新的研究和应用领域，它使蔬菜育种学家能直接 从分子水平了解物种间的差异,也使育种过程更直观，目的性更强。分子标记辅助选择 （Molecular marker-assisted selection，MAS）技术目前已成为育种研究的热点和重要手段，将 分子遗传技术应用于蔬菜抗病遗传育种的研究上，为材料的选择提供了全新的手段。可在早 代对表现优良的基因型进行鉴定，苗期即可在DNA水平上对目标性状进行选择，抗病性鉴定 可在室内完成，鉴定周期缩短到2天，而且稳定可靠，不受季节、环境条件等因素的影响， 可提高选择速度，增强选择的准确性和可靠性，加快育种进程，因此具有广阔的应用前景。

随着蔬菜集约化生产和栽培技术的提高，黄瓜抗病育种已提到重要位置。黄瓜黑斑病是 黄瓜生产上的重要病害。查阅国内外文献，迄今为止，有关黄瓜黑斑病的分子标记辅助育种 研究尚缺乏系统的研究和报道。因而将黄瓜抗黑斑病基因与不抗黑斑病的其它品种的优良品 质基因相结合，培育优良抗病的黄瓜新品种和创造黄瓜新种质是生产实践中亟需解决的实际 问题。筛选与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的分子标记，获得与黄瓜抗、感黑斑病基因紧密连 锁的基因片段，建立黄瓜抗黑斑病分子标记辅助育种体系，将会推动传统的“经验育种”向高 效的“精确育种”转变，提升育种效率和技术水平，加速抗病育种的进程，为黄瓜遗传和育种 工作奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列。

本发明的第二个目的是提供一种与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段。

本发明的第三个目的是提供一种与黄瓜感黑斑病基因紧密连锁的基因片段。

本发明的最后一个目的是提供一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法。

本发明的技术方案概述如下：

用于鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列，它由上游引物和下游引物组成，上游引物是序列 表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，下游引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。

与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段，是SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

与黄瓜感黑斑病基因紧密连锁的基因片段，是SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。

一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，包括如下步骤：

（1）提取被鉴定样品黄瓜基因组DNA；

（2）以所述黄瓜基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所述核苷酸序列为上、 下游引物，进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物进行凝胶电泳，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观 察、照相；

（4）依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性：凡扩增产物出现 SEQ ID No.3所述的核苷酸序列的材料，为抗黑斑病资源；凡扩增产物出现SEQ ID No.4所述 的核苷酸序列的材料以及同时具有SEQ ID No.3所述的核苷酸序列和SEQ ID No.4所述的核苷 酸序列的材料，为感黑斑病资源；对黄瓜抗黑斑病种质资源或对黄瓜进行抗黑斑病分子标记 辅助育种。

利用本发明的鉴定黄瓜黑斑病抗性的引物序列及其扩增出的黄瓜抗黑斑病基因片段和黄 瓜感黑斑病基因片段对构建的F2代分离群体和黄瓜种质资源进行黑斑病抗性评价，其结果与 人工接种鉴定符合率分别达95.60%、93.42%，在黄瓜育种中进行资源抗性筛选具有很大的应 用价值。以这些序列为依据，可以进行抗黑斑病标记辅助选择、育种，用作黄瓜育种中检测 黄瓜抗黑斑病基因的探针；可以为进行抗黑斑病基因定位、作图与克隆，通过基因工程改良 黄瓜品种的抗病性奠定基础。

附图说明

图1是利用鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法获得的与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段 和感黑斑病基因紧密连锁的基因片段电泳图：

A为与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段（SEQ ID No.3所示，122bp）；

B为与黄瓜感黑斑病基因紧密连锁的基因片段（SEQ ID No.4示，126bp）；

1、4、7、8、10、11为抗病单株；2、3、5、6、9为感病单株，纯合抗性株仅有抗性基 因片段，纯合感性株仅有感性基因片段。

图2是利用一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，获得的黄瓜感黑斑病母本L63和抗黑斑病 父本L9杂交后代F2代分离情况图谱：1、2、7、9、10、12、16、18、21、24、26、37、44、 48、50、55、65、67、68、70、75、82、83、85为抗病单株；3、6、13、17、20、28、31、 42、43、46、49、52、58、59、60、62、63、64、69、71、76、80为感病单株；4、5、8、 11、14、15、19、22、23、25、27、29、30、32～36、38～41、45、47、51、53、54、56、 57、61、66、72～74、77～79、81、84、86为杂合类型单株，M为DNA标准，纯合抗性株 仅有抗性基因片段，纯合感性株仅有感性基因片段，杂合类型单株同时具有抗性基因片段和 感性基因片段。

图3是利用一种鉴定黄瓜黑斑病抗性的方法，对黄瓜种质资源进行黑斑病抗性检测：A 为与黄瓜抗黑斑病基因紧密连锁的基因片段（SEQ ID No.3所示，122bp），B为与黄瓜感黑 斑病基因紧密连锁的基因片段（SEQ ID No.4所示，126bp）；51、52、89～92、102、104、 127～129、131、135～137、144、151为抗病种质资源；1～50、53～70、72～88、93～101、 103、105～126、130、132～134、138～141、143、145～149、152～189为感病种质资源； 71、142、150为杂合类型种质资源。纯合抗病种质资源仅有抗性基因片段，纯合感病种质资 源仅有感性基因片段，杂合类型种质资源同时具有抗性基因片段和感性基因片段。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，下面的实施例可以使本专业技术人员更 全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

（1）提取被鉴定样品黄瓜基因组DNA；

（2）以所述黄瓜基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所述核苷酸序列为上、 下游引物，进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：所述黄瓜基因组DNA20ng、序 列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列25ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列25ng、 dNTP0.20mM、Mg²⁺1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.0单位，加无菌重蒸馏 水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180 秒，94℃变性60秒，51℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸350秒，扩 增完成；

（3）PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将步骤（2）获得的PCR扩增产物采用5%变性聚丙烯 酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的 变性聚丙烯酰胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染 色后在可见光下观察、照相；

（4）依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜黑斑病的抗性。由于抗病单株、 感病单株或中间类型单株经扩增以后产生不同分子量的DNA片段，在凝胶上分离时其在凝胶 上的迁移速率不同，从而形成位置上存在差异的条带，通过条带在凝胶上的相对位置就可对 黄瓜黑斑病材料的抗性进行快速鉴定凡扩增产物出现SEQ ID No.3所述的核苷酸序列的材 料，为抗黑斑病资源；凡扩增产物出现SEQ ID No.4所述的核苷酸序列的材料以及同时具有 SEQ ID No.3所述的核苷酸序列和SEQ ID No.4所述的核苷酸序列的材料，为感黑斑病资源； 对黄瓜抗黑斑病种质资源或对黄瓜进行抗黑斑病分子标记辅助育种。

实施例2

鉴定黄瓜种质资源黑斑病抗性

根据实施例1的方法，对不同黄瓜种质资源基因组DNA进行PCR扩增，凡扩增产物出 现122bp（SEQ ID No.3所述的核苷酸序列）的特异片段的材料，为抗黑斑病资源；凡扩增 产物出现126bp（SEQ ID No.4所述的核苷酸序列）的特异片段的材料，为感黑斑病资源； 凡同时扩增出该两个特异片段的材料，为不纯合材料，见图3。抗黑斑病资源，或者是抗黑 斑病基因的携带者，可以用作进一步抗病品种选育的材料和育种种质。