含有与聚阴离子多肽偶联的、衍生自CD4受体的肽的用于治疗艾滋病的新共轭分子

摘要

本发明涉及共轭分子及其制备方法，所述共轭分子含有衍生自CD4受体的肽，所述肽通过接头与有机分子偶联。所述有机分子包括5至21个氨基酸阴离子多肽。所述共轭分子可以用于抗病毒治疗，也就是用于艾滋病的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及含有衍生自CD4受体的肽和有机分子的共轭分子，有机分子例如 聚阴离子多肽。该共轭分子可以用于抗病毒治疗，也就是用于艾滋病的治疗。本 发明进一步涉及制备所述共轭分子的方法。

背景技术

在大量血清反应阳性的HIV患者中，结合核苷（NRTI）、非–核苷（NNRTI） 和/或蛋白酶抑制剂（PI）的三联疗法导致病毒载量（viral charge）降低至检测水平 以下。这些治疗同时靶向逆转录和蛋白质水解。这种功效已经导致由HIV感染导 致的死亡数目的本质的减少。但不幸地，约80%的患者显示了抗病毒抗性的基因 型，更忧虑地，45.5%的病毒群对NRTI/PI联合治疗具有抗性，而26%对三种抗–HIV 类的联合治疗具有抗性（Tamalet等人,AIDS.2003Nov7;17(16):2383–8）。这种观 察特别令人不安，是因为在70%接受治疗的患者中发现长期三联疗法治疗的副作 用（皮下脂肪萎缩、脂肪营养不良、高三酸甘油酯血症、高胆固醇血症、神经病 等）导致顺应性差以及通常导致抗性的治疗“突然”停止。因此，优先考虑开发 具有较少副作用和没有交叉抗性的较低严重形式的治疗，尽管市场上目前可以得 到大量的药物。鉴于此，有必要以HIV复制步骤为靶向，而非逆转录和蛋白质水 解。

在病毒性感染循环中，病毒进入细胞是重要步骤。该过程被分成两个阶段： 第一，病毒在细胞表面与特定宿主受体相互作用，接着病毒遗传物质渗透入靶细 胞。关于HIV，参与粘附和进入机制的分子伴侣已很好地确定。gp120病毒包膜糖 蛋白，通过结合宿主细胞的跨膜糖蛋白CD4，本质上决定病毒/细胞相互作用的复 合物。这种相互作用导致gp120中构象的改变，gp120暴露出特定的表位，称为 CD4-诱导（CD4i），因此建立趋化因子受体（基本上为CCR5和CXCR4）的结合 位点。因此，CCR5和CXCR4在细胞表面充当gp120共受体。第二种相互作用导 致gp120/gp41蛋白质复合物的重新组织和细胞/病毒膜融合的开始。

通过所用共受体的类型定义HIV病毒的细胞趋向性。更具体地说，所谓的X4 或“T向性（T–tropic）”病毒倾向于感染在它们的表面表达CXCR4的细胞株，例 如T淋巴细胞。所谓的R5或“M向性（M–tropic）”病毒使用共受体CCR5且主 要感染巨噬细胞和单核细胞。R5或X4病毒的存在通常与完全不同的艾滋病发展 阶段相关（对R5无症状阶段，X4病毒的出现通常与不利的疾病发展结果相联系， 表明共受体CXCR4的用途是艾滋病发病机理的重要因素）。由于gp120带有对 CCR5和CXCR4识别的结构决定簇，所以R5和X4病毒代表两种分开的靶标。

国际专利申请WO2008/015273中显示，衍生自CD4受体的特定活化的肽可 以和有机分子选择性反应，提供化学定义地共价共轭物。这种活化需要在衍生自 CD4受体的肽序列中的特定位置上插入一个且只有一个氨基酸残基赖氨酸。这种 插入允许在miniCD4合成和纯化之后，通过接头将有机化合物和化学物 （chemistries）偶联。

WO2009/098147中公开了多种潜在抗病毒衍生物，抗病毒衍生物由包含CD4 肽的共轭分子组成，其中CD4肽通过接头特异性地偶联至聚阴离子硫酸类肝素 （HS）。这些共轭物表现出强大的抗病毒活性。通过gp120中存在至少两种不同 的HS识别位点激发HS的作用，即V3可变环和CD4（CD4i）诱导的位点：mCD4-HS 的CD4部分（moiety）被认为是通过直接相互作用触发gp120的构象变化，因此 导致CD4i表位的暴露，然后共价结合的HS可以与CD4i表位相互作用，从而削 弱X4和R5细胞系的HIV病毒感染。

由抑制病毒附着至细胞组成的这种方法是治疗有利的，因为它直接靶向病毒 而非细胞本身。因此，其没有用结合至共受体的疗法所观察到的细胞作用。另外， 考虑到保留作为各种病毒向性功能而参与其中的位点，根据本发明的化合物应当 与不同的病毒分离株的gp120相互作用。尽管可能误导认为绝不会产生抗性，无 论如何可以预期和其它治疗相比它将以低得多的比例发生。事实上，gp120的CD4 位点需保持完整以便继续结合CD4，如参与和聚阴离子多糖的结合以便与共受体 相互作用的碱性残基。这两个位点中任何一个突变的确都将导致病毒传染性降低。

本发明人现在已经鉴定了一种新共轭分子，其能够阻断HIV病毒进入到细胞 中。它们表明，mCD4共轭分子中存在硫酸类肝素低聚糖，对于抑制病毒进入X4 或R5细胞系而言不是绝对必需的，并且通过由5至21，有利地5至17、特别是5、 9、13、17或21，优选13个氨基酸组成的阴离子多肽代替以前所用的HS分子， 也可以得到非常有效的抗病毒活性。在一个优选的实施方式中，一些氨基酸带负 电荷，特别是至少1个，有利地至少2个，优选至少3个。在更优选的实施方式 中，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸带负电荷（取决于阴离子 多肽的长度）。在最优选的实施方式中，当阴离子多肽由13个氨基酸组成时，9 个氨基酸带负电荷。更重要的是，它们还表明，令人惊讶的是，这些新mCD4共 轭分子（包括所述阴离子多肽），相较于现有技术中所公开的共轭分子，对R5或 X4病毒都具有更好的抗病毒活性。

发明内容

根据第一方面，本发明涵盖含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通 过接头被偶联至有机分子，其中

·所述衍生自CD4受体的肽含有下列通用序列（I）：

Xaa^f-Pl-Lys-Cys-P2-Cys-P3-Cys-Xaa^g-Xaa^h-Xaaⁱ-Xaa^j-Cys-Xaa^k-Cys-Xaa¹-Xaa^m，(I)

其中：

-P1代表3至6个氨基酸残基，

-P2代表2至4个氨基酸残基，

-P3代表6至10个氨基酸残基，

-Xaa^f代表N-乙酰半胱氨酸（Ac-Cys）或巯基丙酸（thiopropionic acid）（TPA），

-Xaa^g代表Ala或Gln，

-Xaa^h代表Gly或（D）Asp或Ser，

-Xaaⁱ表示Ser或His或Asn，

-Xaa^j代表联苯基丙氨酸（Bip）、苯丙氨酸或[β]–萘基丙氨酸，

-Xaa^k代表Thr或Ala，

-Xaa^l代表Gly、Val或Leu，并且

-Xaa^m的代表-NH₂或-OH，

P1、P2和P3中氨基酸残基是天然的或非天然的，相同或不同的，P1、P2和 P3的所述残基均不同于Lys残基，并且P1、P2和P3具有共同的或不同的序列， 以及

·所述有机分子包括

-阴离子多肽，其由5至21，有利地5至17，优选13个天然或非天然的、相 同或不同的氨基酸残基组成，其中至少3个，特别是3至15，如3至13个氨基酸 带负电荷，

-分子基团A-Z，其中：

○A包括选自如下的式–CO(CH₂)₃NH-CO(CH₂)₂-、–CO(CH₂)_p-NH-CO- (CH₂)_q-、–CO(CH₂-CH₂)-(O-CH₂-CH₂)_p-NH-CO-(CH₂)_q-、–CO(CH₂)_p-NH-CO-(CH₂- CH₂-O)_q-(CH₂-CH₂)-和–CO(CH₂-CH₂)–(O-CH₂-CH₂)_p-NH-CO-(CH₂-CH₂-O)_q-(CH₂- CH₂)-，其中p代表包括在1和10之间的整数，q代表包括在1和10之间的整数， 其中第一个羰基偶联至N-端丝氨酸的αNH₂，有利地A代表式-CO(CH₂)₃NH- CO(CH₂)₂-的基团，以及

○Z表示卤原子、巯基或马来酰亚胺基团，

所述阴离子多肽通过式A-Z的所述分子基团被连接至接头，以及所述接头在 其末端之一共价结合至所述衍生自CD4受体的肽的通用序列（I）中存在的氨基酸 残基Lys的游离氨基（-NH₂），并且所述接头在其另一末端共价结合至所述有机 分子的Z基团。

优选P3含有至少一个碱性氨基酸，所述碱性氨基酸甚至更优选为精氨酸。在 CD4受体片段该部分中存在碱性氨基酸残基有助于其结合gp120蛋白。因此，本 发明人更优选将至少一个碱性氨基酸引入P3，优选精氨酸。因此，其保持了在pH 7-8时在衍生物中不反应的碱性部分，但是发现该碱性部分对于miniCD4肽结合 gp120蛋白是有用的。

在本申请中，术语“miniCD4肽”、“CD4肽”和“miniCD4”可互换使用， 表示衍生自CD4受体的肽，其包括或由上面定义的通用序列（I）组成。

如WO2009/098147中所公开的，要求本发明的miniCD4肽包含一个且只有 一个赖氨酸（Lys）氨基酸残基，且所述赖氨酸位于通用序列（I）中所定义的位置。 通用序列（I）中的Cys残基允许形成三个miniCD4折叠回来所需的二硫键。当它 位于通用序列（I）的肽的N-端位置时，巯基丙酸（TPA）使得有可能降低N-端的 阻碍并克服胺基团的存在。因此，根据一个优选的实施方案，Xaa^f代表通用序列 （I）中的TPA。

Bip增加在腔中与糖蛋白gp120的接触，其中CD4受体的Phe43位于腔中。 因此，在一个优选的实施方案中，Xaa^j代表Bip。无论如何，有利地在通用序列（I） 中令Phe作为Xaa^j，因为结构分析表明这种miniCD4可有效模拟CD4（Huang CC  等人，Structure.2005May;13(5):755–68）。因此，根据另一个优选的实施方案， Xaa^j代表Phe。

衍生自CD4受体的通用序列（I）的肽形成α-螺旋结构，随后是β片层。氨 基酸Xaa^g–Xaa^h–Xaaⁱ–Xaa^j–Cys–Xaa^k–Cys–Xaa^l参与gp120结合的重要途径。这些 肽显示和sCD4（可溶性CD4）相似的IC₅₀（对gp120的亲和性）。

可以通过常规固相化学合成技术制备本发明的CD4肽，例如根据Fmoc固相 肽合成方法（“Fmoc solid phase peptide synthesis,a practical approach”，W.C.Chan 和P.D.White编辑，Oxford University Press,2000）和/或通过基因重组。

优选地，所述CD4肽选自序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。更优选地， 本发明的CD4肽具有SEQ ID NO：1所示的序列。

在本发明中术语“接头”是指通过如下所定义的双官能化合物与衍生自CD4 受体的肽和有机分子偶联所获得的接头。因此，接头的长度随所用双官能化合物 的功能而变化。

特别是，接头有利地选自：

其中k代表包括在2至24之间的整数，有利地2、4、8或12，

k1代表包括在1和10之间的整数，因此等于1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10，有利地等于1、2、3、5或10，

当Z代表巯基时，以及选自：

当Z代表马来酰亚胺基团或卤原子时。

在一个优选的实施方式中，接头选自：

k代表包括在2至24之间的整数，有利地2、4、8或12，以及

k1代表包括在1和10之间的整数，因此等 于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，有利地等于1、2、3、5或10，

当Z代表巯基时，

选自：

和当Z代表马来酰亚胺基团或卤原 子时。

从而这样的接头对应着使用琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰氨基]己酸 酯（SMPH）、NHS-PEO_n-马来酰亚胺（其中n代表包括在2至24之间的整数， 有利地2、4、8或12）、SATA（N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯）和SATP （N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯）作为双官能化合物。

在另一个优选的实施方式中，接头是

本发明的共轭分子包括阴离子多肽，所述阴离子多肽由13个氨基酸组成，其 中3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基带负电荷。在一个优选 的实施方案中，阴离子多肽由13个氨基酸组成，其中9个氨基酸残基带负电荷。

有利地，本发明的阴离子肽通过N-端连接至式I化合物的A基团。有利地， 所述阴离子肽和A基团之间形成的键是肽键，因此包括所述肽的氨基（NH₂）和A 基团上的羧基（COOH）。

不受理论的约束，可以认为所述13个氨基酸长的阴离子多肽减弱了CD4i暴 露位点和CXCR4（或CCR5）趋化因子受体之间的相互作用，从而减弱细胞/病毒 膜融合的启动。

在本发明这个意义上，“氨基酸”是指所有D或L形式的天然α-氨基酸残基 （例如丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、 半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、组氨酸 （His）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）、 苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、色氨酸（Trp）、 酪氨酸（Tyr）和缬氨酸（Val）），以及非天然氨基酸（例如，β-丙氨酸、烯丙 基甘氨酸、叔亮氨酸、正亮氨酸（Nle）、3-氨基己二酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基 苯甲酸、4-氨基苯甲酸、2-氨基丁酸、4-氨基-1-羧甲基哌啶、1-氨基-1-环丁烷羧酸、 4-氨基环己基乙酸、1-氨基-1-环己烷羧酸、（1R，2R）-2-氨基环己烷羧酸、（1R， 2S）-2-氨基环己烷羧酸、（1S，2R）-2-氨基环己烷羧酸、（1S，2S）-2-氨基环己 烷羧酸、3-氨基环己烷羧酸、4-氨基环己烷羧酸、（1R，2R）-2-氨基环戊烷羧酸、 （lR，2S）-2-氨基环戊烷羧酸、1-氨基-1-环戊烷羧酸、1-氨基-1-环丙烷羧酸、4- （2-氨基乙氧基）-苯甲酸、3-氨基甲基苯甲酸、4-氨基甲基苯甲酸、2-氨基丁酸、 4-氨基丁酸、6-氨基己酸、1-氨基茚满-1-羧酸、4-氨基甲基-苯乙酸、4-氨基苯基乙 酸、3-氨基-2-萘甲酸、4-氨基苯丁酸、4-氨基-5-（3-吲哚基）-戊酸、（4R，5S） -4-氨基-5-甲基庚酸、（R）-4-氨基-5-甲基己酸、（R）-4-氨基-6-甲基硫代己酸、 （S）-4-氨基-戊酸、（R）-4-氨基-5-苯基戊酸、4-氨基苯基丙酸、（R）-4-氨基庚 二酸、（4R，5R）-4-氨基-5-羟基己酸、（R）-4-氨基-5-羟基戊酸、（R）-4-氨基 -5-（对-羟基苯基）-戊酸、8-氨基辛酸、（2S，4R）-4-氨基-吡咯烷-2-羧酸、（2S， 4S）-4-氨基-吡咯烷-2-羧酸、氮杂环丁烷-2-羧酸、（2S，4R）-4-苄基-吡咯烷-2- 羧酸、（S）-4,8-二氨基辛酸、叔丁基甘氨酸、γ-羧基谷氨酸、β-环己基丙氨酸， 瓜氨酸、2,3-二氨基丙酸、马尿酸、环己基高丙氨酸（homocyclohexylalanine）、 moleucine（无对应译文）、高苯丙氨酸、4-羟基脯氨酸、吲哚啉-2-羧酸、异哌啶 酸、磺基酪氨酸（sulfotyrosine）、氨基辛二酸、对-羧甲基苯丙氨酸、α-甲基-丙氨 酸、烟酸、正缬氨酸、八氢吲哚-2-羧酸、鸟氨酸、青霉胺、苯基甘氨酸（Phg）、 4-苯基-吡咯烷-2-羧酸、哌啶酸、炔丙基甘氨酸、3-吡啶基丙氨酸 （3-pyridinylalanine）、4-吡啶基丙氨酸（4-pyridinylalanine）、1-吡咯烷-3-羧酸、 肌氨酸、他汀类药物、四氢异喹啉-1-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨甲环酸、 4,4-二氟脯氨酸、4-氟脯氨酸、α-（3,4-二氟苄基）-脯氨酸、γ-（3,4-二氟苄基）- 脯氨酸、α-（三氟甲基）苯丙氨酸、六氟亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸、6,6,6-三氟正 亮氨酸、2-（三氟甲基）亮氨酸、2-（三氟甲基）正亮氨酸、4,4,4-三氟缬氨酸、 4,4,4,4',4',4'-六氟缬氨酸、五氟苯丙氨酸、2,3-二氟苯丙氨酸、2,4-二氟苯丙氨酸、 2,5-二氟苯丙氨酸、2,6-二氟苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、3,5-二氟苯丙氨酸、3,3- 二氟-3-（4-氟苯基）丙氨酸、2,3-二氟苯基甘氨酸、2,4-二氟苯基甘氨酸、2,5-二氟 苯基甘氨酸、3,4-二氟苯基甘氨酸、4,4-二氟乙基甘氨酸、4,4,4-三氟乙基甘氨酸和 六氟正亮氨酸）。术语还包括带有常规氨基保护基团（例如，乙酰基、叔丁氧羰 基、苄氧基羰基或9-芴基甲基羰基（fluorenylmethylcarbonyl））的天然和非天然 氨基酸，以及在羧基端（有利地通过C₁-C₁₈烷基、酯、苯基酰胺或苄基酰胺或酰 胺，分别赋予如下式的羧基端：-CO（C₁-C₁₈烷基）、-COO（C₁-C₁₈烷基）、-CONH 苯基、CONH苄基、或CONH₂）保护的天然和非天然氨基酸。

如此处所用，术语“阴离子”指带负电荷的分子，例如其在电解中迁移到正 极。另外，“带负电荷”的氨基酸指带有侧链电荷的氨基酸，侧链电荷在pH7.4 时呈负值。因此，根据本发明的带负电荷的氨基酸残基包括，例如天冬氨酸、酪 氨酸、磺基酪氨酸、酪氨酸磺酸酯、氨基辛二酸、对-羧甲基苯丙氨酸、和谷氨酸 残基。

如此处所用，磺基酪氨酸（或2-氨基-3-（4-（硫氧基）苯基）丙酸）是具有 下式的非天然氨基酸：

如此处所用，术语“酪氨酸磺酸酯”（或“2-氨基-3-（4-（磺基甲基）苯基） 丙酸”）是指具有下式的非天然氨基酸：

根据本发明，氨基辛二酸是具有下式的非天然氨基酸：

如此处所用，对-羧甲基苯丙氨酸是指具有下式的非天然氨基酸：

在本发明的一个实施方式中，所述阴离子多肽由13个相同的带负电荷的氨基 酸组成。它可以是，例如，由13个天冬氨酸残基（SEQ ID NO：9）、13个磺基 酪氨酸残基（SEQ ID NO：10）、13个酪氨酸磺酸酯残基（SEQ ID NO：11）、 13个氨基辛二酸残基（SEQ ID NO：12）、13个对-羧甲基苯丙氨酸残基（SEQ ID  NO：13）和13个谷氨酸残基（SEQ ID NO：3）组成的多肽。在一个优选的实施 方案中，所述相同氨基酸是谷氨酸E以及本发明共轭分子的阴离子多肽是SEQ ID  NO：3。

在本发明的另一个实施方式中，本发明的阴离子肽包括带负电荷的和不带电 荷的氨基酸。优选地，所述阴离子肽包括至少一个带负电的氨基酸和至少另一个 氨基酸。优选地，所述其它氨基酸是携带极性不带电荷的侧链的氨基酸。这样的 氨基酸包括，例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。在另一个优选的实施 方式中，所述其它氨基酸是丝氨酸或苏氨酸。在又一个优选的实施方案中，所述 其它氨基酸是丝氨酸。在另一个优选的实施方式中，带负电荷的氨基酸是天冬氨 酸。

在又一个优选的实施方案中，本发明所述阴离子多肽，除了至少一个其它氨 基酸，还包括至少两个不同的带负电荷的氨基酸。在这种情况下，所述阴离子多 肽具有例如序列S-(X-D-X-S)_n，比如S-X-D-X-S-X-D-X-S-X-D-X-S，其中n是包括 在1和5之间的整数，优选3，S代表丝氨酸，D代表天冬氨酸，以及X选自：酪 氨酸、磺基酪氨酸、酪氨酸磺酸酯、氨基辛二酸和对-羧甲基苯丙氨酸（SEQ ID NO： 19）以及其中各X基团可以是相同的或不同的，优选是相同的。

在本实施方式中，所述阴离子多肽可以尤其具有以下的任意序列：

-S-(Y_SO3-D-Y_SO3-S)_n，比如S-Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S (SEQ ID NO:4)，其中Y_SO3是磺基酪氨酸；

-S-(Y_SN-D-Y_SN-S)_n，比如S-Y_SN-D-Y_SN-S-Y_SN-D-Y_SN-S-Y_SN-D-Y_SN-S(SEQ ID  NO:5)，其中Y_SO3是酪氨酸磺酸酯；

-S-(pF-D-pF-S)_n，比如S-pF-D-pF-S-pF-D-pF-S-pF-D-pF-S(SEQ ID NO:6)， 其中pF是对-羧甲基苯丙氨酸；

-S-(Asu-D-Asu-S)_n，比如S-Asu-D-Asu-S-Asu-D-Asu-F-Asu-F-D-Asu-S(SEQ ID  NO:7)，其中Asu是氨基辛二酸；以及

-S-(Y-D-Y-S)_n，比如S-Y-D-Y-S-Y-D-Y-S-Y-D-Y-S(SEQ ID NO:8)，其中Y 是酪氨酸。

阴离子多肽也可以具有下面的序列：

-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y-S-Y-D-Y-S(SEQ ID NO:20)或

-S-Y-D-Y-S-Y-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S(SEQ ID NO:21)。

根据本发明最优选，X代表磺基酪氨酸。因此，在最优选的实施方案中，本 发明的阴离子多肽具有序列：S-(Y_SO3-D-Y_SO3-S)_n，以及尤其是S-Y_SO3-D-Y_SO3-S- Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S(SEQ ID NO:4)。

在具体的实施方式中，本发明的共轭分子含有衍生自CD4受体的肽，所述肽 通过接头偶联至有机分子，其中：

-衍生自CD4受体的肽选自序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，

-接头是CO-(CH₂O)₂CH₂NHCO(CH₂)₂-吡咯烷基-2,5-二酮，

-有机分子包括具有选自如下的序列的阴离子多肽：S-(Y_SO3-D-Y_SO3-S)_n、 S-(Y_SN-D-Y_SN-S)_n、S-(pF-D-pF-S)_n、S-(Asu-D-Asu-S)_n和S-(Y-D-Y-S)_n；尤其选自： S-Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S(SEQ ID NO4)、S-Y_SN-D-Y_SN-S-Y_SN-D-Y_SN-S-Y_SN-D-Y_SN-S(SEQ ID NO:5)、S-pF-D-pF-S-pF-D-pF-S-pF-D-pF-S(SEQ ID  NO:6)、S-Asu-D-Asu-S-Asu-D-Asu-F-Asu-F-D-Asu-S(SEQ ID NO:7)、S-Y-D-Y-S -Y-D-Y-S-Y-D-Y-S(SEQ ID NO:8)，所述序列通过式A-Z的分子基团连接至接头， 其中A是-NHCO(CH₂)₃NH-CO(CH₂)₂-以及Z是巯基。

在一个优选的实施方案中，本发明的共轭分子包括衍生自CD4受体的肽，衍 生自CD4受体的肽选自序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，所述肽通过接头 CO-(CH₂O)₂CH₂NHCO(CH₂)₂吡咯烷基-2,5-二酮偶联至有机分子，阴离子多肽具有 序列S-(Y_SO3-D-Y_SO3-S)_n，以及尤其是S-Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y_SO3- S-Y_SO3-D-Y_SO3-S(SEQ ID NO4)，所述序列通过式A-Z的分子基团连接至接头，其 中A是-NHCO(CH₂)₃NH-CO(CH₂)₂-以及Z为巯基。

本发明的共轭物，通过阻断病毒附着至细胞膜上以及随后的病毒进入，能抑 制HIV进入细胞。因此，本发明的共轭物可以用于治疗。更优选地，本发明的共 轭物可用于治疗病毒感染。甚至更优选地，所述共轭物可用于治疗艾滋病。因此， 根据第二方面，本发明涵盖如上所定义的共轭分子，其作为药物的用途。本发明 还涉及用于治疗病毒感染，特别是用于治疗艾滋病的如上所定义的共轭物。如上 所定义的共轭分子在制造用于抗病毒治疗特别是用于艾滋病治疗的药物中的用途 也是本发明的一个目的。

根据第三方面，本发明涵盖了药物组合物，该药物组合物包括如上所定义的 共轭分子和药学上可接受的载体。该组合物可以用作药物，优选用于治疗病毒感 染，并且，更优选用于治疗艾滋病。

在用于口服、鼻内、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、局部或直肠施用 的本发明的药物组合物中，活性成分可以单位形式施用、其与常规药物载体混合 施用至动物或人类。用于施用的合适的施用单位形式包括用于口服施用的形式（例 如片剂、明胶胶囊剂、粉剂、颗粒剂和口服溶液或混悬液）、用于舌下和含服施 用的形式、用于皮下、肌肉内、静脉内、鼻内或眼内施用的形式和用于直肠施用 的形式。

除了载体和本发明的共轭物外，本发明的药物组合物可以含有本领域中公知 的各种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、和其它材料。

如此处所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的溶剂、缓冲液、盐 溶液、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等的任何和全部。 根据预期的施用途径选择载体类型。在各种实施方式中，载体适于静脉内、腹膜 内、皮下、肌肉内、局部、经皮或口服施用。药学上可接受的载体包括无菌水溶 液或分散液以及无菌注射溶液或分散液的即配型无菌粉末。用于药物活性物质的 介质和试剂的使用在本领域中是众所周知的。一个典型的用于静脉输注的药物组 合物可以被制成以含有250ml无菌林格氏溶液和100mg的组合。用于制备肠胃外 可施用的化合物的实际方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的，并更详 细地描述于例如Remington’s Pharmaceutical Science,第17版,Mack Publishing  Company,Easton,Pa.(1985)及其第18版和第19版，并入此处作为参考。

优选组合物中的共轭分子以有效量配制。“有效量”是指，在剂量下持续必 要的时间，足以获得所需结果（比如诱导肿瘤细胞凋亡）的有效量。“治疗有效 量”是指足以影响某种疾病状态的治疗过程的量。治疗有效量也是药物的治疗有 益作用优于任何毒性或有害作用的量。

可调整剂量方案以提供最佳的响应。例如，可以施用单次大剂量（bolus）， 可随着时间的推移施用几个分开的剂量，或按比例减少或增加剂量。可以向受试 者施用本发明的组合物以影响受试者中的病毒感染。如此处所用，术语“受试者” 意图包括对病毒感染易感的活的生物体，特别包括哺乳动物，如兔、狗、猫、小 鼠、大鼠、猴、其转基因品种，优选人类。

对于治疗应用，以药学上可接受的剂型，比如上面讨论的那些，包括可作为 大剂量通过静脉内或持续一段时间连续输注而向人类施用的那些剂型，通过肌肉 内、腹膜内、脑脊髓内（intracerebrospinal）、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口 服、局部或吸入途径，向哺乳动物优选人施用本发明的共轭分子。

本发明还涉及抗病毒的治疗方法，优选抗艾滋病的治疗方法，包括向有需求 的患者施用本发明的共轭分子或包含共轭分子的药物组合物。

第四方面，本发明提供一种如上定义的共轭分子的制备方法，其特征在于方 法包括以下步骤：

a.用带有两个活性基团的双官能化合物接触如上定义的通用序列（I）的 miniCD4肽，使两个活性基团的中的一个与通用序列（I）中存在的氨基酸Lys残 基的游离氨基（-NH₂）形成共价键，以便获得带有双官能化合物第二活性基团的 活化肽，以及

b.用带有如上定义的官能团的有机分子接触步骤（a）获得的活化肽，其中如 上定义的官能团带有巯基，其中巯基（SH）已被保护性巯基（protective thiol group） 所保护，从而活化肽的活性基团与有机分子的官能团，无论官能团被保护与否， 形成共价键以获得共轭分子。

在本申请中，步骤（a）获得的化合物将被无差别地称为“活化肽”、“活化 miniCD4”、“活化CD4肽”或“活化miniCD4肽”。

根据本发明的官能团是指卤原子、马来酰亚胺、巯基或保护性巯基。

本发明中所用术语“保护性巯基”是指硫原子被S-保护基所取代以保护巯基 免于合成过程中不希望的反应。常用的S-保护基公开于Greene,“Protective Groups  In Organic Synthesis”（John Wiley&Sons,New York(1981)）。S-保护基包括取代 的或未取代的苄基醚，如对甲氧基苄基或对硝基苄基、三苯甲基醚、硫醚、硫代 乙酸酯或硫缩醛。优选地，所述受保护的巯基是硫代乙酰基。

当有机化合物带有保护性巯基时，所述保护性基团在步骤（b）之前或期间进 行脱保护以恢复游离巯基，并允许该巯基与活化肽的活性基团偶联。

衍生自CD4受体的肽的特征与上面所定义的相同。具体而言，P3优选含有至 少一个碱性氨基酸，所述碱性氨基酸甚至更优选为精氨酸。根据一个优选的实施 方案，Xaa^f代表通用序列（I）中的TPA。根据另一个优选的实施方案，Xaa^j代表 Phe。优选，通用序列（I）的衍生自CD4受体的肽的序列选自序列SEQ ID NO：1 和SEQ ID NO：2，有利地SEQ ID NO：1。

本专利申请中术语“双官能化合物”是指并入两个活性基团的任何化合物， 其中两个活性基团中的一个能与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨 基(-NH₂)形成共价键，且另一个活性基团能与有机分子形成共价键。

本领域技术人员非常清楚能用于本发明框架内的双官能化合物。也就是，本 发明的双官能化合物可以选自下列非限制性的列表：NHS–PEO_n–马来酰亚胺，其 中n是包括在2至24之间的整数，有利地n=2、4、8或12，硫代–KMUS（N–[k- 马来酰亚胺基十一烷酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯）、LC–SMCC（琥珀酰亚胺基 –4–[N–马来酰亚胺基甲基]环己烷–1–羧基–[6–氨基己酸酯]）、KMUA（N–k–马来酰 亚胺基十一烷酸）、SMPB（琥珀酰亚胺基4–[p–马来酰亚胺基苯基]丁酸酯）、硫代 –SMPB（硫代琥珀酰亚胺基4–[p–马来酰亚胺基苯基]丁酸酯）、硫代–SIAB（N–硫 代琥珀酰亚胺基[4–碘乙酰基]氨基苯甲酸酯）、SIAB（N–琥珀酰亚胺基[4–碘乙酰 基]氨基苯甲酸）、硫代–EMCS（[N–e–马来酰亚胺基己酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯）、 EMCA（N–e–马来酰亚胺基己酸）、EMCS（[N–e–马来酰亚胺基己酰氧基]琥珀酰 亚胺酯）、SMCC（琥珀酰亚胺基4–[N–马来酰亚胺基甲基]环己烷–1–羧酸酯）、硫 代–SMCC（硫代琥珀酰亚胺基4–[N–马来酰亚胺基甲基]环己烷–1–羧酸酯）、MBS （m–马来酰亚胺基苯甲酰基–N–羟基琥珀酰亚胺酯）、硫代–MBS（m–马来酰亚胺 基苯甲酰基–N–羟基硫代琥珀酰亚胺酯）、GMBS（N–[g–马来酰亚胺基丁酰氧基] 琥珀酰亚胺酯）、硫代–GMBS（N–[g–马来酰亚胺基丁酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯）、 SPDP（N–琥珀酰亚胺基–3–(2–吡啶二硫代)丙酸酯）、SBAP（琥珀酰亚胺基3–[溴 乙酰氨基]丙酸酯）、BMPS（N–[β]–马来酰亚胺基丙酰氧基]琥珀酰亚胺酯）、BMPA （N–[β]–马来酰亚胺基丙酸）、AMAS N–(a–马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺 酯）、SIA（N–琥珀酰亚胺基碘乙酸酯）、SMPH(琥珀酰亚胺基–6–[β-马来酰亚胺基 丙酰氨基]己酸酯）、SATA（N–琥珀酰亚胺基–S–乙酰硫代乙酸酯)和SATP（N–琥 珀酰亚胺基–S–乙酰硫代丙酸酯）。

根据本发明，NHS–PEO_n–马来酰亚胺，其中n=2，也被称为琥珀酰亚胺基–[(N– 马来酰亚胺基丙酰氨基)–二甘醇]酯，

NHS–PEO_n–马来酰亚胺，其中n=4，也被称为琥珀酰亚胺基–[(N–马来酰亚胺 基丙酰氨基)–四甘醇]酯，

NHS–PEO_n–马来酰亚胺，其中n=8，也被称为琥珀酰亚胺基–[(N–马来酰亚胺 基丙酰氨基)–八甘醇]酯，

NHS–PEO_n–马来酰亚胺，其中n=12，也被称为琥珀酰亚胺基–[(N–马来酰亚胺 基丙酰氨基)–十二甘醇]酯。

能与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH₂)形成共价键的 活性基团可以是任何活性酯基团。

优选，能与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH₂)形成共价 键的活性基团是活性基团N–羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）或N-羟基-4-硫代-琥珀酰 亚胺酯，有利地为NHS活性基团。甚至更优选，双官能化合物的两个活性基团是 不同的（杂双官能基团），且两个基团中的一个为NHS活性基团或N-羟基-4-硫代 -琥珀酰亚胺酯，有利地为NHS活性基团。

有利地，当有机分子的官能团为巯基或保护性巯基时，能与有机分子的官能 团形成共价基团的双官能化合物的活性基团为卤原子或马来酰亚胺基，当有机分 子的官能团为卤原子或马来酰亚胺基时，所述双官能化合物的活性基团为如上所 定义的巯基或保护性巯基。

根据一个优选的实施方案，当有机分子的官能团为巯基或保护性巯基时，双 官能化合物选自琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺丙酰胺基]己酸酯（SMPH）和 NHS–PEO_n–马来酰亚胺，n为包括在2至24之间的整数，有利地为2、4、8或12。

根据一个特别优选的实施方案，双官能化合物为SMPH。

SMPH的分子结构如下：

根据另一个特别优选的实施方案，双官能化合物为琥珀酰亚胺基–[(N–马来酰 亚胺基丙酰氨基)–二甘醇]酯，也称为NHS–PEO₂–马来酰亚胺，琥珀酰亚胺基–[(N– 马来酰亚胺基丙酰氨基)–四甘醇]酯，也称为NHS–PEO₄–马来酰亚胺，琥珀酰亚胺 基–[(N–马来酰亚胺基丙酰氨基)–八甘醇]酯，也称为NHS–PEO₈–马来酰亚胺，琥 珀酰亚胺基–[(N–马来酰亚胺基丙酰氨基)–十二甘醇]酯，也称为NHS–PEO₁₂–马来 酰亚胺，更优选双官能化合物为NHS–PEO₂–马来酰亚胺。

NHS–PEO₂–马来酰亚胺的分子结构如下：

根据另一个特别优选的实施方案，当有机分子的官能团为卤原子或马来酰亚 胺基时，所述双官能化合物选自N–琥珀酰亚胺基–S–乙酰硫代乙酸酯（SATA）或 N–琥珀酰亚胺基–S–乙酰硫代丙酸酯（SATP）。

SATA的分子结构如下：

SATP的分子结构如下：

所述双官能化合物可以从PIERCE（Rockford,IL）获得。

再次优选，当Xaa^f代表TPA时，本发明的方法包括用于制备通用序列(I)的衍 生自CD4受体的肽的初步步骤，所述步骤包括用N–琥珀酰亚胺基–3–(2–吡啶二硫 代)丙酸酯(SPDP)接触如下通用序列(III)的衍生自CD4受体的肽，从而在通用序列 (III)的衍生自CD4受体的肽的N端引入TPA：

l-Lys-Cys-P2-Cys-P3-Cys-Xaa^g-Xaa^h-Xaaⁱ-Xaa^j-Cys-Xaa^k-Cys- Xaa¹-Xaa^m，(III)

其中P1至P3和Xaa^g至Xaa^m如通用序列(I)中所定义。

SPDP的分子结构如下：

此外，作为能通过共价键偶联至有机分子的活性基团的实例，可以引用下列 基团：马来酰亚胺或溴乙酰基，S–S–吡啶或硫代乙酰基。

当miniCD4被受保护的巯基（例如，硫代乙酰基）活化时，其有可能偶联至 带有例如马来酰亚胺基的有机分子。当聚阴离子多肽被巯基或受保护的巯基，例 如硫代乙酰基官能化有问题时，这是可能的。那么，这称为“逆偶联”。

优选地，所述活性基团为马来酰亚胺基。

当SMPH为所用双官能化合物时，本发明的活化肽（其活性基团为马来酰亚 胺）的分子结构如下：

在本申请中，术语“SMPH活化的miniCD4肽”是指本发明的活化肽，其氨 基酸Lys残基经衍生自SMPH的接头，有利地通过胺键，共价键合至马来酰亚胺 活性基团。

根据另一个有利的实施方案，当NHS–PEO₂–马来酰亚胺为所用双官能化合物 时，本发明的活化肽（其活性基团为马来酰亚胺基）的分子结构如下：

在本申请中，术语“经PEO₂接头的马来酰亚胺活化的miniCD4肽”是指本发 明的活化肽，其氨基酸Lys残基经PEO₂接头，有利地通过胺键，共价键合至马来 酰亚胺活性基团。

根据另一个优选，所述活性基团为硫代乙酰基。

例如，当SATA为所用双官能化合物时，本发明的活化肽（其活性基团为硫代 乙酰基）的分子结构如下：

相似地，当SATP为所用双官能化合物时，本发明的活化肽（其活性基团为硫 代乙酰基）的分子结构如下：

硫代乙酰基为巯基的受保护形式。为了巯基的脱保护，我们使用例如羟胺。 该步骤与偶联至有机分子所带有的马来酰亚胺基同时进行。

在本申请中，术语“SATA活化的miniCD4肽”和“SATP活化的miniCD4肽” 是指本发明的活化肽，其氨基酸Lys残基经衍生自SATA或SATP的接头，有利地 通过胺键，共价键合至受保护的巯基（例如，硫代乙酰基）。

因此，根据一个具体实施方案，活化肽的活性基团为马来酰亚胺基，且有机 分子带有巯基或硫代乙酰基。

当SMPH作为双官能化合物用于偶联时，本发明共轭分子的分子结构如下， 其中共轭分子包括通用序列(I)的衍生自CD4受体的肽，所述肽偶联至带有巯基或 受保护的巯基（例如硫代乙酰基）的修饰阴离子多肽（聚阴离子）：

当NHS–PEO₂–马来酰亚胺作为所用双官能化合物时，其也可以是下列共轭分 子：

根据另一个实施方案，本发明的共轭分子含有衍生自CD4受体的肽和带有马 来酰亚胺或卤素基团的有机分子，其中所述肽含有通用序列(I)或由通用序列(I)组 成，优选序列SEQ ID NO：1。

根据另一个具体实施方案，活化肽的活性基团为硫代乙酰基，且有机分子带 有马来酰亚胺或卤素基团。

例如，当SATA用于偶联时，共轭分子的分子结构如下，该共轭分子含有通用 序列(I)的衍生自CD4受体的肽，所述肽偶联至带有马来酰亚胺基的有机分子：

根据本发明，所述阴离子多肽（本发明的有机分子）可以通过本领域中公知 的任何常规合成方法进行制备。用于制备活化肽和共轭分子的本发明方法的操作 条件为本领域技术人员所熟知，正如如下实施例所阐述的。

下面的实施例和附图阐明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1公开了本发明的肽的结构。

图2代表包含在本发明共轭分子中的阴离子多肽的HPLC谱（从上至下： P3Y_SO3、P3Y、P3pF、P3Asu和E13）。

图3代表偶联至S-乙酰硫代丙酸酯（SATP）基团的本发明阴离子多肽的HPLC 谱。

图4代表本发明共轭肽的HPLC谱。

图5代表通过表面等离子体共振（SPR-Biacore）技术进行的结合分析的结果， 并显示mAb17b(15μg/ml)与包被有来自X4(MN)或R5(YU2)病毒的gp120的表 面的相互作用，用100nM如下进行预处理：单独mCD4(A)、mCD4-P3Y(B)或 mCD4-P3YSO3(C)。当表面包被有mAb17b时（D和G），来自X4(MN)的gp120 或来自R5(YU2)的gp120的相互作用依赖于mCD4（其诱导mAb17b表位的暴露） 的存在，但是当用mCD4-P3Y或mCD4-P3YSO3替代mCD4时，相互作用完全被 抑制。当表面包被有sCD4时（E和H），相互作用被mCD4部分抑制，被mCD4-P3Y 或mCD4-P3YSO3完全抑制。当表面包被有肝素时（F），相互作用不被mCD4抑 制，被mCD4-P3Y和mCD4-P3YSO3部分抑制，后者更具活性。

具体实施方式

实施例

实施例1：本发明共轭分子的合成

1.1式H-γ-Abu-SXDXSXDXSXDXS-OH的肽的合成，其中X=YSO3 (P3YSO3)、Y(P3Y)、Asu(P3Asu)、或pF(P3pF)； H-γ-Abu-SY_SO3DY_SO3SY_SO3DYSYDYS-OH（Nter3硫酸酯）；H-γ-Abu- SYDYSYDY_SO3SY_SO3DY_SO3S-OH（Cter3硫酸酯）；和H-γ-Abu-(Glu)₁₃-OH(E13)； 其中γ-Abu:NH₂-(CH₂)₃-CO。

如下实施例描述式H-γ-Abu-SXDXSXDXSXDXS-OH的修饰肽的合成，其中 X=YSO3(P3YSO3)、Y(P3Y)、Asu(P3Asu)或pF(P3pF)； H-γ-Abu-SY_SO3DY_SO3SY_SO3DYSYDYS-OH（Nter3硫酸酯）；H-γ-Abu- SYDYSYDY_SO3SY_SO3DY_SO3S-OH（Cter3硫酸酯）；H-γ-Abu-(Glu)₁₃-OH(E13)；其 中γ-Abu:NH₂-(CH₂)₃-CO。此式中，本发明的阴离子肽（除了肽E13以外）对应着 SXDXSXDXSXDXS-OH(SEQ ID NO:19)，其中X如上（相同或不同）。

所得修饰肽为：

P3YSO3（SEQ ID NO:14）：NH₂-(CH₂)₃-CO-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S- Y_SO3-D-Y_SO3-S

P3Y（SEQ ID NO:15）：NH₂-(CH₂)₃-CO-S-Y-D-Y-S-Y-D-Y-S-Y-D-Y-S

P3pF（SEQ ID NO:16）：NH₂-(CH₂)₃-CO-S-pF-D-pF-S-pF-D-pF-S-pF-D-pF-S

P3Asu（SEQ ID NO:17）：NH₂-(CH₂)₃-CO-S-Asu-D-Asu-S-Asu-D-Asu-F -Asu-F-D-Asu-S

E13（SEQ ID NO:18）：NH₂-(CH₂)₃-CO-EEEEEEEEEEEEE

Nter3硫酸酯（SEQ ID NO:20）：NH₂-(CH₂)₃-CO-S-Y_SO3-D-Y_SO3-S-Y_SO3-D -Y-S-Y-D-Y-S

Cter3硫酸酯（SEQ ID NO:21）：NH₂-(CH₂)₃-CO-S-Y-D-Y-S-Y-D-Y_SO3-S-Y_SO3- D-Y_SO3-S

试剂

树脂购自RAPP Polymere GmbH，Fmoc AAs、HATU、NMP、DMF、TFA来 自Applied Biosystems和Sigma的Piperidin。Fmoc-Tyr(SO3.NnBu4)-OH和Fmoc-γ- 氨基丁酸-OH(γ-Abu)来自Novabiochem，(S)-Fmoc-2-氨基-辛二酸-8-叔-丁酯(Asu) 来自Polypeptides以及Fmoc-L-4(O-叔丁基羧甲基)-Phe-OH(pF)来自Anaspec。 HPLC级三乙胺乙酸缓冲液来自GlenResearch。N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯 （SATP）来自Pierce。

用于肽合成的通用操作

在Applied433肽合成仪上在H-Ser(tBu)-2-ClTrt-PS-树脂（100μmoles;0.78 mmole/g）上合成肽。在Fmoc-Glu(tBu)-PHB-PS-树脂（100μmoles;0.61mmole/g） 上合成E13肽。用10当量的Fmoc氨基酸和HATU/DIEA活化进行链延伸。在室 温下持续1小时30，通过TFA/TIS/H2O（95/2,5/2,5）处理从树脂上释放肽，除了 硫酸化肽，其在4℃（冰浴）进行。通过冷二乙醚沉淀分离粗肽，通过加入3%NH₄OH 使其溶于水，除了硫酸化肽，其迅速溶于100mM碳酸氢铵缓冲液中。冻干后，通 过C18RP-HPLC使用50mM NEt3-AcOH水溶液（对于硫酸化的和E13肽，100 mM）和CH₃CN作为洗脱剂纯化粗肽。通过质谱（Waters ionspray Q-TOF–micro） 检查纯化肽，通过氨基酸分析（Hitachi L-8800设备）定性。通过分析型C18RP-HPLC 使用50mM NEt3-AcOH水溶液中的CH₃CN线性梯度持续20分钟控制肽纯度 （Waters Symetry3.5μm,2.1x100mm柱,0.35ml/min流速）。

表1：通过HPLC进行的肽纯度分析

1.2S–乙酰硫代丙酸酯肽（SATP肽）

肽溶于100mM磷酸钠缓冲液pH8.2（1mM终浓度）。通过持续40min逐步 加入10当量SATP（0.26M于DMSO中）引入S-乙酰硫代丙酸酯基团。1小时30 后，通过C18RP-HPLC使用在50mM NEt3-AcOH水溶液中的CH₃CN线性梯度持 续20分钟纯化S–乙酰硫代丙酸酯肽（5μm,10x250mm柱,6ml/min 流速）。通过分析型C18RP-HPLC使用在50mM NEt3-AcOH水溶液中的CH₃CN 线性梯度持续20分钟控制SATP衍生肽纯度（Waters Symetry3.5μm, 2.1x100mm柱,0.35ml/min流速）。

表2：S–乙酰硫代丙酸酯肽的纯度分析

*在0.08%TFA水溶液中，CH₃CN的10-30%线性梯度持续20min。

1.3.马来酰亚胺活化的miniCD4(mCD4-Mal)

按WO2009/098147和Nature Chemical Biology,2009,5(10),743-748中所述， 获得本发明的mini-CD4肽。

Mini-CD4-PEO2-马来酰亚胺=mini-CD4+接头

在1ml H₂O中10mg mCD4(MW:2897;3.4mmoles)的溶液稀释于1ml磷酸盐 缓冲液0.1M pH8中。4.5mg NHS–PEO₂–马来酰亚胺(MW:325;13.8mmoles;4当 量)搅拌加入至20μl DMSO的此浑浊溶液中。10分钟后，85%(HPLC)的起始材 料转化成马来酰亚胺衍生物。由于马来酰亚胺基团在pH8时的稳定性低，偶联反 应直接加载至SepaK C18柱上，该柱用TFA0.08%水溶液中的10%CH₃CN校正。 用50%CH₃CN洗脱马来酰亚胺衍生物。冻干后，而后在半制备型柱上纯化化合物。

1.4.mCD4-肽共轭物

SATP肽溶于100mM磷酸钠缓冲液pH7.2（1mM终浓度）。加入100mM 磷酸钠缓冲液（4N NaOH调整至pH7.2）中100当量的0.5M NH₂OH，HCl。通过 HPLC监测巯基官能的脱保护。30min后，加入H₂O中0.3当量的mCD4-Mal(1.5 mM)。30min后，通过C18RP-HPLC使用在50mM NEt3-AcOH水溶液中的CH₃CN 线性梯度持续20分钟纯化mCD4-肽共轭物（5μm,10x250mm柱,6 ml/min流速）。通过分析型C18RP-HPLC使用在50mM NEt3-AcOH水溶液中的 CH₃CN线性梯度持续20分钟控制mCD4-肽共轭物（Waters Symetry3.5 μm,2.1x100mm柱,0.35ml/min流速），负离子模式质谱以及氨基酸分析定量。

表3：mCD4-肽共轭物的HPLC分析

对照肽mCD4-HS12的合成按照WO/2009/098147和Nature Chemical Biology, 2009,5(10),743-748中所述的进行。

实施例2：Biacore评价

2.1.操作

采用两种不同gp120，其源自X4型分离物（gp120MN）和R5型分离物（gp120 YU2）。通过表面等离子体共振（Biacore）测量不同分子对gp120与各种受体或 共受体相互作用的抑制能力。

为此，根据（Vivès等人.J.Biol.Chem.279,54327-54333,2005）所描述的操作， 蛋白（在此情况下是gp120包膜蛋白）可以固定在生物传感器（Sensorchip CM4 Biacore）的表面。当注射至包被有MN(X4)或YU2(R5)gp120包膜的表面时，mCD4 结合并暴露gp120上的CD4i表位，该表位负责mAb17b的包膜结合（图5A） （mAb17b抗体识别CD4诱导的表位并模拟共受体CCR5或CXCR4）。当mCD4 或待测试化合物注射至这些表面时，gp120和mAb17b之间的相互作用信号测量为 时间的函数（图5A至C）。

在另一套实验中，mAb17b包被至表面上，以及gp120单独（灰线）或用mCD4 预先孵育后、或待测试化合物注射至这些表面（图5D和5G）。gp120和mAb17b 之间的相互作用信号测量为时间的函数。

在另一套实验中，sCD4包被至表面上，以及gp120单独（灰线）或用待测试 化合物预先孵育后，注射至这些表面（图5E和5H）。gp120和sCD4之间的相互 作用信号测量为时间的函数。

在另一套实验中，肝素包被至表面上，以及gp120单独（灰线）或用待测试 化合物预先孵育后，注射至这些表面（图5F）。gp120和肝素之间的相互作用信 号测量为时间的函数。

浅色线和深色线之间的差异，显示测试化合物对于（vis-à-vis）gp120和固定 在生物传感器上的分子之间的相互作用的抑制能力。

2.2.结果

mCD4-P3Y_SO3完全抑制mAb17b结合至gp120/mCD4复合物

当注射至包被有MN(X4)或YU2(R5)包膜的gp120表面时，mCD4结合并暴露 gp120上的CD4i表位，该表位负责mAb17b的包膜结合（如5A）。用mCD4-P3Y 和mCD4-P3Y_SO3进行的相同实验（分别图5B和5C）显示mCD4-P3Y部分抑制 mAb17b对MN(X4)的结合（图5B），而mCD4-P3Y_SO3完全抑制mAb17b对MN(X4) 和YU2(R5)的结合（图5C）。

mCD4-P3Y_SO3完全抑制MN(X4)包膜对mAb17b和CD4的结合，以及部分抑 制对肝素的结合

当注射至mAb17b表面时，MN包膜不结合17b表面（CD4i表位被掩盖，浅 色线，图5D）。当gp120包膜处于和mCD4的复合物中时，发生这种结合。当注 射入与mCD4-P3Y_SO3的复合物时，结合被完全抑制（图5D）。MN包膜结合CD4 表面。当注入和mCD4-P3Y_SO3的复合物时，结合被完全抑制（图5E），而 mCD4-P3Y_SO3仅部分抑制MN对肝素的结合（图5F）。

mCD4-P3YSO3完全抑制YU2(R5)包膜对mAb17b和CD4的结合

当注射至mAb17b表面时，YU2包膜部分结合17b表面。当注射mCD4/YU2 复合物时，这种结合被增强。这种结合被mCD4-P3Y_SO3完全抑制（图5G）。YU2 包膜结合CD4表面。当注入与mCD4-P3Y_SO3的复合物时，结合被完全抑制（图 5H）。由于YU2包膜不结合肝素表面，在肝素表面上的实验未进行。

实施例3:本发明的肽对X4-向性HIV-1-LAI和R5-向性HIV-1/Ba-L株的抗 病毒活性

3.1.操作

如WO/2009/098147和Nature Chemical Biology,2009,5(10),743-748中所述进 行抗病毒活性。

简言之，在植物血细胞凝集素-P(PHA-P)-活化的外周血液单核细胞(PBMC)上 体外扩增和滴定X4-向性HIV-1-LAI(Barre-Sinoussi,Science220,868-71,1983)或 R5-向性HIV-1/Ba-L(Gartner等人,Science233,215-9,1986)株。使用公式 计算组织培养感染剂量（Arch.Exp.Path.Pharmak.162,480-483,1931）。 对于抗病毒试验，使用每种药物的六个浓度（在0.5μM至160pM之间1:5稀释） 预处理30分钟PHA-P-活化的PBMC，并用X4-向性LAI或R5-向性Ba-L株的一 百50%组织培养感染剂量（TCID50）感染。在培养阶段维持用药，在感染后第7 天收集细胞上清液并在-20℃贮存。在这些实验中使用叠氮胸苷(AZT)作为内部对 照。通过使用RetroSys HIV RT试剂盒(Innovagen)在细胞培养上清液中通过定量逆 转录酶(RT)的活性测定病毒的复制。平行地，通过甲基四唑盐(MTT)试验在第7天 在未感染的PHA-P-活化的PBMC中评价样品的细胞毒性。实验一式三份的进行， 使用SoftMaxPro软件计算50、70和90%有效剂量和细胞毒剂量。

用每种调查中的药物（1:5稀释0.5μM至160pM之间）处理PHA-P-活化的 PBMC，并用100TCID₅₀的HIV-1-LAI（X4向性）或/Ba-L（R5向性）株感染PHA-P- 活化的PBMC。在培养过程维持分子和病毒，在感染后第7天收集细胞上清液用 于逆转录酶活性的定量。实验一式三份的进行，使用SoftMaxPro软件计算50、70 和90%有效剂量（ED），以nM计(±S.D.)。所有这些分子均没有显示超过1μM 的细胞毒性。

3.2.结果

当单独使用时，在最高测试浓度下（500nM）没有阴离子肽表现出抗病毒活 性。然而，当与mCD4共轭时，它们显示对LAI和/或Ba-L株的抑制活性，对于 mCD4-P3YSO₃低至0.5nM的有效剂量给出50%的抑制(ED₅₀)，对于mCD4-HS₁₂相当于1.4nM（见下表4）。

表4：本发明共轭肽的抗病毒活性（抑制50、70和90%HIV-1复制所需的有 效剂量（ED，三次测定的平均值），以nM(±s.d.)表示）

这些分子均未显示高达最高测试剂量的细胞毒性（0.5μM）。

实施例4：mCD4-P3YSO3对92UG029、SF162、92US723、96USHIPS4、 92HT599和98IN017株的抗病毒活性

4.1.操作

抗病毒分析延伸到一系列更加临床相关的主要株，包括92UG029、SF162、 92US723、96USHIPS4、92HT599和98IN017。

用参照淋巴向性HIV-1/LAI株（Barre-Sinoussi等人，1983）或用参照巨噬细 胞向性HIV-1/Ba-L株（Gartner等人，1986）感染植物血细胞凝集素（PHA）-P- 活化的PBMC。这些病毒在体外用PHA-P-活化的血单核细胞扩增。病毒储液（含 临床分离物）用PHA-P-活化的PBMC滴定，使用公式计算50%组织培养 感染剂量（TCID50）（1931）。用5个浓度（在500nM至320pM之间 1:5稀释）的各待测试分子孵育病毒（125TCID50）30分钟，并加入至150000PBMC （m.o.i.～0.001）。在感染后第7天收集细胞上清液并在-20℃贮存。在有些情况 下，在病毒攻击之前将化合物加入至细胞。通过使用Lenti RT Activity试剂盒(Cavisi) 在细胞培养上清液中通过定量逆转录酶(RT)的活性测定病毒复制，使用AZT作为 参照抗HIV-1分子。平行地，使用比色甲基四唑盐（MTS/PMS）分析（Promega） 在第7天在未感染的PHA-P-活化的PBMC中评价细胞毒性。实验一式三份的进行， 使用SoftMaxPro软件计算50、70和90%有效剂量（ED）。

4.2.结果

如下表5中所示，mCD4-P3YSO3显示高水平的抗病毒活性，其特征在于对于 它们五个而言ED₅₀在0.2至1.2nM的范围，对于HIV-198IN017（一种clade C病 毒）是29nM。对于LAI和Ba-L株，mCD4或P3YSO₃仅为微弱的活性或没有活 性，进一步支持了偶联策略所诱导的很强的协同效应。没有分子在高达1μM时表 现出细胞毒性。

表5：AZT、mCD4-P3YSO₃、P3YSO₃和mCD4对临床HIV-1分离物的抗HIV-1 活性（抑制50、70和90%HIV-1复制所需的有效剂量（ED，三次测定的平均值）， 以nM(±s.d.)表示）

我们还观察到mCD4-P3YSO3不需要用待活化的病毒进行预先孵育。实际上， 在病毒攻击之前将分子加入至细胞，或在细胞感染恢复之前将分子加入至病毒， 结果一致（cf.表7）。

表7：AZT、mCD4-P3YSO3、P3YSO3和mCD4对LAI HIV-1的抗HIV-1活 性（当化合物用细胞或用病毒预先孵育时，抑制50、70和90%HIV-1复制所需 的有效剂量（ED，三次测定的平均值），以nM(±s.d.)表示）

实施例5：mCD4-P3YSO₃对SHIVsf162p3细胞的细胞内抗病毒活性

5.1.操作

使用HIV LTR控制下表达荧光素酶的TZN-bl细胞。这些细胞表达高水平的 CD4和CCR5，并易于感染HIV-1/-2和SIV。这些细胞一经感染，病毒Tat将诱导 荧光素酶的转录。Luc信号和感染量成比例。我们将待测试化合物（mCD4、 mCD4-HS12或mCD4-P3YSO₃）的系列稀释添加至细胞中，并随后添加病毒。48 小时后，读出得到的Luc信号。

试验一式两份进行。

5.2.结果

获得的结果显示于下表6。

结论

因此，本研究表明相对较小的合成分子，其包括连接至阴离子多肽的3kDa CD4模拟物，能有效地模拟若干大的gp120配体，包括CD4和识别mAb的共受 体结合位点。值得注意的是，在本发明中所描述的共轭物中和R5和X4-向性HIV-1， 这是一个显著的优势，因为出现利用CXCR4的病毒株能危害CCR5特异性拮抗剂 的疗效，而对于CXCR4尚没有可用的抑制剂。

令人惊讶的是，本发明的肽，对于X4和R5病毒株，都比现有技术中的分子 （mCD4-HS12）表现出更好的抗病毒活性，从而可以提高对HIV病毒进入宿主细 胞的抑制。

共轭分子mCD4-P3Y_SO3具有比任何其它测试化合物好得多的抑制作用（针对 X4和R5，ED50分别为0.5和1.3）。

缩写：

Fmoc：9–芴甲氧羰基

DMF：二甲基甲酰胺

HATU:六氟磷酸化N[(二甲基氨基)–1H–1,2,3–三氮唑并[4,5–b]吡啶–1–基亚 甲基]–N–甲基甲胺的N–氧化物

DIEA：二异丙基乙基胺

SPDP：N–琥珀酰亚胺基–3(2–吡啶二硫代)丙酸酯

TFA：三氟乙酸

EDT：乙二硫醇

TIS：三异丙基硅烷

DTT：1,4–二硫苏糖醇

MPLC：中压液相色谱

ES⁺MS：电喷雾质谱，正模式

GSH：还原型谷胱甘肽

GSSG：氧化型谷胱甘肽

HPLC：高效液相色谱

RP-HPLC：反相高效液相色谱

SMPH：琥珀酰亚胺基–6–[β–马来酰亚胺基丙酰氨基]己酸酯

SATP：N–琥珀酰亚胺基–S–乙酰硫代丙酸酯

RT：室温

Rt：保留时间

Cbz：苄氧基羰基

pMBn：对甲氧苄基

Bn：苄基

Ac：乙酰基

Me：甲基

Et：乙基

eq：当量

HRMS：高分辨质谱

ESI：电喷雾电离

LC-ESI-TOF-MS：液相色谱/电喷雾电离飞行时间质谱

LCMS：液相色谱/质谱

DMSO：二甲基亚砜。