人白介素-1受体拮抗剂的新用途

摘要

本发明公开了人IL-1Ra在预防和治疗溃疡性结肠炎癌变中的新用途。本发明建立了UC癌变的动物模型，考察人IL-1Ra全程治疗和末期治疗的治疗效果，发现人IL-1Ra全程治疗可有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量，减轻肠道损伤程度，促进肿瘤上皮细胞的凋亡；人IL-1Ra末期治疗能有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量，缩减肿瘤体积，抑制肿瘤的形成。说明人IL-1Ra可应用于制备预防和治疗溃疡性结肠炎癌变药物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及人白介素-1 受体拮抗剂(Interleukin-1ReceptorAntagonist，IL-1Ra)的新用途，更 具体的而言，本发明涉及人IL-1Ra在预防和治疗溃疡性结肠炎 (Ulcerative Colitis，UC)癌变的新用途。

背景技术

溃疡性结肠炎是一种结肠与直肠慢性非特异性炎症疾病，而病因 尚不明确。该病的病变部位主要是在大肠黏膜以及黏膜下层，病程长 久，复发率相当高。病症主要有反复性的腹痛、腹泻和长期炎症等多 种并发症状。UC在欧美较为常见，患病率为40-100／10万，发病率 为20-40／10万，多见于20-40岁年龄段。在我国，随着人民生活质量 的不断改善和诊疗技术的不断提高，UC的发病率逐年升高，据多家 医院的病例统计分析，UC的患病率为10-20／10万，在一些发达城市 甚至接近欧美国家的水平。

UC相关结直肠癌(Colitis-associated Cancer，CAC)是溃疡性结 肠炎的严重并发症，因为CAC占所有结肠癌的比例虽然不高，只有 2％左右，但是却占UC患者死亡原因的15％左右。研究发现UC患 者由炎症到不典型增生再到癌变的过程与一般肿瘤到癌变过程时间 相比更加迅速。伴随着科技的发展，检测器材与医学治疗的完善，在 临床上广泛应用结肠镜监测及早期预防性结肠切除术的普及，近期研 究显示，UC的病程20年癌变的风险为2.5％，30年癌变的风险为 7.6％，40年癌变的风险为10.8％。

目前对溃疡性结肠炎传统内科治疗常规药物有三类：氨基水杨酸 类、类固醇糖皮质激素及免疫抑制剂。而这些药物均存在疗效欠佳及 副作用较大的问题，如临床常用治疗中、轻度结肠炎的柳氮磺吡啶， 约有近半数人不能耐受其副作用；类固醇糖皮质激素类药物包括氢化 可的松、泼尼松、地塞米松等，这些药物不宜长期使用；免疫抑制剂 主要有氨甲喋呤、硫唑嘌呤等，该类药物因毒性较大而限制了其应用。 正是由于缺乏有效的治疗手段和该疾病自身的发展进程，UC具有病 程长、易反复、难治愈、症状难以控制等特点。

人白介素-1受体拮抗剂是人体内存在的蛋白分子，在体内可与人 白介素-1(Interleukin-1，IL-1)的受体特异性地结合，从而保护由IL-1 引起的机体损伤。2001年底FDA批准美国Amgen公司人白介素-1 受体拮抗剂上市，主要用于顽固性类风湿关节炎；也用于II型糖尿病、 红斑狼疮和脓血症。但目前尚无报道其在CAC治疗中的应用。

发明内容

本发明一个目的是提供人IL-1Ra在预防和治疗溃疡性结肠炎癌 变的新用途，将成为临床上预防和治疗UC癌变的有效候选药物，即 CAC将成为人IL-1Ra临床治疗新的适应症。所述的人IL-1Ra (GenBank号：P18510.1)采用常规方法表达得到。

本发明的另一个目的是提供一种方案评价人IL-1Ra在预防UC 癌变中的疗效：通过偶氮甲烷(AOM)和硫酸葡聚糖钠(DSS)的联 合应用(AOM(12mg／kg)的一次注射+4轮2％DSS水喂饮)建立了 UC癌变的动物模型，建模开始后进行治疗，分别在每轮喂饮DSS水 的第1，3，5天腹腔注射人IL-1Ra，剂量为25mg／kg，观察时间为 100天，结果显示，此方案能有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量，减 轻肠道损伤程度，促进肿瘤上皮细胞的凋亡。

本发明的另一个目的是提供一种方案评价人IL-1Ra在治疗UC癌 变中的疗效：通过偶氮甲烷(AOM)和硫酸葡聚糖钠(DSS)的联合 应用(AOM(12mg／kg)的一次注射+4轮2％DSS水喂饮)建立了 UC癌变的动物模型，在末轮DSS水喂饮结束后1周，连续腹腔注射 人IL-1Ra，剂量为25mg／kg，总观察时间为100天，对照小鼠注射磷 酸盐缓冲生理盐水(Phosphate Buffered Saline，PBS)。该方案则能 减少肿瘤数量，缩减肿瘤体积，从而抑制肿瘤的形成。

本发明治疗方法中所用的人IL-1Ra还可以为人白介素-1受体拮 抗剂，以及所述两种拮抗剂的修饰形式，所述拮抗剂可以进一步含有 一种或多种化学修饰以增加其在循环中的半衰期，例如交联于聚乙二 醇(即聚乙二醇化)。

对本发明所述的人IL-1Ra和人白介素1受体拮抗剂的氨基酸或核 苷酸序列进行浅显的或微小的修改，所得的突变体蛋白在预防和治疗 UC癌变中的应用，也在本发明的保护范围之内。人IL-1Ra的功能保 守变异体在预防和治疗UC癌变中的应用也在本发明的保护范围之 内，所述“功能保守变异体”是指蛋白质中一个或多个氨基酸残基发生 改变，但不影响此多肽的总体构象和功能，包括(但绝不限于)把一 个氨基酸残基替换成另外一个具有类似特征的氨基酸。具有特征类似 的氨基酸被本领域所熟知。例如可互相替换的极性／亲水氨基酸包括 天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、 组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可互相替换的非极性／疏水氨基酸，包 括甘胺酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可互相替换的酸性氨基酸，包括天冬 氨酸和谷氨酸；可以互相替换的碱性氨基酸，包括组胺酸、赖氨酸和 精氨酸。

本发明的其它实施方案进一步包括一种或多种其它治疗，诸如免 疫抑制剂、抗炎药、类固醇和免疫调节剂。所述的免疫抑制剂包括硫 唑嘌呤、甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素和麦考酚酸吗乙酯。 所述的抗炎药包括5-氨基水杨酸、柳氮磺吡啶和奥沙拉嗪。所述的类 固醇包括皮质类固醇、糖皮质激素、泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、 甲泼尼龙、地塞米松和ACTH。所述的免疫调节剂包括PVAC、抗CD40 配体、抗CD40、那他珠单抗(AntegrenTM)、抗VCAMI和抗ICAMl。

如果需要，还可以将本发明拮抗剂和其他试剂联合给药，诸如其 它蛋白质或多肽类或各种药物活性剂。实际上，对还可以包括的其它 成分几乎没有限制，只要所述的其它试剂不会在接触靶细胞或宿主组 织时产生显著的不良作用。由此可以将拮抗剂与如具体情况所要求的 各种其它活性剂一起递送。

可药用载体是常规的，为本领域所熟知。例子包括生理相容的水 性和非水性载体、稳定剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、抗 微生物剂、缓冲液、血清蛋白、等渗和吸收减缓剂等类似物。优选的 载体要适于注射进入受试者体内。

可以通过任意合适的递药途经给予所述的拮抗剂以便确保合适的 生物利用度。因此，在某些实施方案中，合适的给药途径可以包括静 脉内快速浓注、静脉内缓慢浓注或输注。通过其它实施方案，可以通 过皮下、肌内、透皮或真皮内注射给予所述的人IL-1Ra。备选的实施 方案提供了可以通过粘膜递送，诸如通过吸入或通过鼻咽或口服给药 实现的给药。

附图说明

图1.A：人IL-1Ra全程治疗后肿瘤数量，B：人IL-1Ra全程治 疗后结肠形态；

图2.A：对照全程治疗后结肠病理图，B：人IL-1Ra全程治疗后 结肠病理图；

图3.A：人IL-1Ra末期治疗后肿瘤数量，B：人IL-1Ra末期治疗 后结肠形态；

图4.人IL-1Ra末期治疗后不同大小肿瘤的数量统计。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但绝不局限于实施 例所述的范围。下面实施例中未表明具体条件的试验方法，通常按照 常规的条件。

实施示例1人IL-1Ra全程治疗UC癌变动物模型

1.实验材料

Balb／c小鼠：vehicle组12只，人IL-1Ra组15只；偶氮甲烷(AOM)； 2％硫酸葡聚糖钠(2％DSS)。

2.实验方法

取15只小鼠进行一次注射偶氮甲烷(AOM，12mg／kg)+4轮2％ 硫酸葡聚糖钠(DSS)水喂饮建立了UC癌变的动物模型，其中4轮 2％硫酸葡聚糖钠(DSS)水喂饮具体方法为：实验小鼠喂饮DSS水 1周后，换成喂饮清水2周，再喂饮DSS水1周，如此循环，总共喂 饮4次DSS水。建模开始后进行治疗，分别在每轮喂饮DSS水的第 1，3，5天腹腔注射人IL-1Ra，剂量为25mg／kg，观察时间为100天。 对照Vehicle组的12只小鼠是注射同体积的缓冲液PBS。

通过肉眼观察实验组及对照组小鼠结直肠交界处的肿瘤数量以 及结肠形态。

另外通过HE染色观察，小鼠肠道损伤情况，具体方法如下：

选取部分人IL-1Ra全程治疗后结肠组织和对照组结肠组织分别 投入预先配好的固定液中使其蛋白质变性凝固，然后用从低浓度到高 浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份，再将组织块置于既溶 于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块 的中酒精，将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，待石蜡完全浸入 组织块后进行包埋，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入事先备好的纸 盒中，冷却凝固成块即成，将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄 片，一般为5-8微米厚，切下的薄片如果皱折，要放到加热的水中烫 平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。苏木精(Hematoxylin， H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性 染料染色的结构具有嗜碱性；伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将 细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色 前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最 后入蒸馏水，就可染色。HE染色过程是：将已入蒸馏水后的切片放 入苏木精水溶液中染色数分钟；酸水及氨水中分色，各数秒钟；流水 冲洗1小时后入蒸馏水片刻；入70％和90％酒精中脱水各10分钟； 入酒精伊红染色液染色2-3分钟；染色后的切片经纯酒精脱水，再经 二甲苯使切片透明；将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封 固。待树胶略干后，贴上标笺。光镜检查，进行显微组织彩色照相。

3.实验结果

通过肉眼观察，统计各组小鼠结直肠交界处的肿瘤数量。结果显 示本发明所述的人IL-1Ra全称治疗能有效减少结肠病灶部位的肿瘤 数量，结果如图1A所示。结肠形态如图图1B所示，结果显示此方 案能减轻肠道损伤程度，促进肿瘤上皮细胞的凋亡。

通过HE染色发现，人IL-1Ra全程治疗明显减轻肠粘膜的破坏程 度，减少炎性细胞浸润，结果如图2A(对照组)和2B(人IL-1Ra 全程治疗)所示。

从以上实验结果显示：人IL-1Ra能有效预防UC的癌变。

实施示例2人IL-1Ra末期治疗UC癌变动物模型

1.实验材料

Balb／c小鼠：vehicle组10只，人IL-1Ra组10只；偶氮甲烷(AOM)； 2％硫酸葡聚糖钠(2％DSS)。

2.实验方法

取10只小鼠进行一次注射偶氮甲烷(AOM，12mg／kg)+4轮2％ 硫酸葡聚糖钠(DSS)水喂饮建立了UC癌变的动物模型，其中4轮 2％硫酸葡聚糖钠(DSS)水喂饮具体方法为：实验小鼠喂饮DSS水 1周后，换成喂饮清水2周，再喂饮DSS水1周，如此循环，总共喂 饮4次DSS水。在末轮DSS水喂饮结束后1周，连续腹腔注射人 IL-1Ra，剂量为25mg／kg，总观察时间为100天，对照Vehicle组的 10只小鼠是注射同体积的缓冲液PBS。

实验结束后通过肉眼观察实验组及对照组小鼠结直肠交界处的 肿瘤数量以及结肠形态，并且取出位于结直肠交界处的肿瘤置于带有 刻度的平皿中，分别测量肿瘤的直径，最后统计不同大小肿瘤所占的 百分率。

3.实验结果

通过肉眼观察，统计各组小鼠结直肠交界处的肿瘤数量。结果如 图3A所示，人IL-1Ra能有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量。结肠形 态如图图3B所示，结果显示人IL-1Ra能缩减肿瘤体积，从而抑制肿 瘤的形成。

测量对照组合实验组位于结直肠交界处的肿瘤置肿瘤直径，最后 统计不同大小肿瘤所占的百分率。结果如图4所示，经人IL-1Ra末 期治疗后的小鼠肿瘤体积整体小于对照vehicle组，体积大于等于 2mm的肿瘤比例明显下降，近50％的肿瘤体积小于等于1mm。

以上实验结果显示：人IL-1Ra能有效治疗UC的癌变。