用于制造靛蓝植物叶提取物的方法

摘要

本发明的目的是提供特别适合施用至皮肤的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物。本发明提供用于制造含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的方法，所述方法包括过滤靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇的混合物，并收集滤液。本发明还提供通过此方法制造的靛蓝植物叶提取物。

说明书

技术领域

本发明涉及用于制造靛蓝植物(indigo-plant)叶提取物的方法。更特别 地，本发明涉及用于制造含色胺酮(tryptanthrin)的靛蓝植物叶提取物的方 法。

背景技术

靛蓝植物的叶(靛蓝植物叶)含有β-吲哚葡糖苷(靛蓝由其制成)。因此， 在世界范围所述叶已经被优先用作用于制造蓝色染料的原材料。目前化学 合成的靛蓝染料经常用于工业中；然而，靛蓝植物叶继续被种植以用作染 料。

特别地，作为主要生长在日本的靛蓝植物，已知蓼蓝(Polygonum  tinctorium)的叶除了含有β-吲哚葡糖苷以外还含有多种有用成分。例如， 已知这种靛蓝植物的叶含有大量的色胺酮(结构式显示如下)。

已经报道，色胺酮具有针对马拉色霉菌属(genus Malassezia)的真菌的 抗菌作用并且因此针对涉及马拉色霉菌属的真菌的特应性皮炎(atopic  dermatitis)是有效的(专利文献(PLT)1)。已经报道色胺酮具有抑制IV型变 应性反应的效果(专利文献(PTL)2)。

因此变得日益明显的是，色胺酮展现出有用的作用，尤其是当施用至 皮肤时，并且对色胺酮的需求正在增加。

作为一种用于从靛蓝植物提取色胺酮的方法，已知的是通过使用有机 溶剂从靛蓝植物提取。例如，已知的是一种使用二氯甲烷作为提取剂的提 取方法(专利文献(PTL)1)和一种使用1，3-丁二醇等作为提取剂的方法。(用 水只能提取非常少的色胺酮。)

然而，使用有机溶剂可能导致高度刺激成分的提取。因此，取决于所 用有机溶剂的类型，所获得的提取物可能不适合施用至皮肤或者可能含有 处于不稳定状态的色胺酮。还未开发出适于施用至皮肤的提取方法。另一 个问题是色胺酮固有地具有较差的光稳定性。

引用列表

专利文献

PTL1：JP2004—189732A

PTL2：JP2006-241080A

发明概述

技术问题

本发明的一个目的是提供用于制造尤其适于施用至皮肤的含色胺酮 的靛蓝植物叶提取物的方法。

问题的解决方案

本发明的发明人令人惊奇地发现：当过滤包含靛蓝植物叶的乙醇提取 物和多元醇的混合物并收集滤液时，可以制得对皮肤没有刺激(尤其是没 有使皮肤致敏的潜力)的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物。基于此发现，本 发明的发明人完成了具有进一步改善的本发明。

因此，本发明包括，例如，列于以下的方法、提取物和组合物。

项目1.一种用于制造含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的方法，所述方 法包括过滤靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇的混合物，并收集滤 液。

项目2.根据项目1所述的方法，其中所述混合物还包含水。

项目3.根据项目1所述的方法，其中所述多元醇是选自由1，3-丁二醇、 丙二醇、异戊二醇和戊二醇组成的组中的至少一种二醇。

项目4.根据项目1至3中任一项所述的方法，所述方法包括将所述 靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物与含水多元醇混合，过滤所得到的包含所述 靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和所述含水多元醇的混合物，并收集滤液。

项目5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中所述靛蓝植物叶 是干燥叶(dried leaves)。

项目6.根据项目5所述的方法，其中所述靛蓝植物叶是晒干的叶 (sun-dried leaves)。

项目7.一种含色胺酮的靛蓝植物叶提取物，其是通过根据项目1至6 中任一项所述的方法获得的。

项目8.一种用于外部施用至皮肤的组合物，所述组合物包含根据项 目7所述的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物。

项目A.一种用于改善在靛蓝植物叶提取物中含有的色胺酮的光稳定 性的方法，所述方法包括过滤靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇的混 合物，并收集滤液。

项目B.一种用于增加靛蓝植物叶提取物的色胺酮含量的方法，所述 方法包括从晒干的靛蓝植物叶提取所述靛蓝植物叶提取物。

项目C.一种用于增加靛蓝植物叶的色胺酮含量的方法，所述方法包 括在阳光下干燥所述靛蓝植物叶。

项目D.一种溶液形式的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物，其中在用白 光照射2周后所述提取物的色胺酮含量为所述照射前的80％以上。

发明的有益效果

在通过根据本发明的用于制造靛蓝植物叶提取物的方法获得的靛蓝 植物叶提取物中含有的色胺酮具有优异的温度稳定性和光稳定性。此外， 与常规制得的靛蓝植物叶提取物相比，根据本发明的靛蓝植物叶提取物引 起更少的对皮肤的刺激(特别地，皮肤致敏)。另外，所述靛蓝植物叶提取 物具有优异的抗微生物活性。因此，所述靛蓝植物叶提取物适合用作用于 外部施用至皮肤的组合物或用于制造用于外部施用至皮肤的组合物。

而且，与常规方法相比，根据本发明的制造靛蓝植物叶提取物的方法 可以增加所获得的靛蓝植物叶提取物的色胺酮含量，并且还可以调节色胺 酮含量。

附图简述

图1是根据本发明的用于制造含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的方法的 一个实例的示意图。

图2是一种用于制造含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的常规方法的一个 实例的示意图。

图3显示考察在通过图1中所示的制造方法获得的靛蓝植物Et-BG提 取物中含有的色胺酮的稳定性的结果。

图4显示考察在通过图2中所示的制造方法获得的靛蓝植物BG提取 物中含有的色胺酮的稳定性的结果。

图5概述在试验例1中用于考察靛蓝植物BG提取物的皮肤致敏的程 序。

图6显示在试验例中考察靛蓝植物叶提取物的皮肤致敏中使用的标 准。

图7概述在试验例2中用于考察靛蓝植物Et提取物和靛蓝植物Et-BG 提取物的皮肤致敏的程序。

图8显示关于所获得的靛蓝植物叶提取物的色胺酮含量是否根据靛蓝 植物叶的状况而变化的试验结果。

图9是柱形图，其比较了通过在各自含有以下中的一种的培养基中培 养金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)获得的活细胞比率：靛蓝植物 Et-BG提取物，靛蓝植物BG提取物，靛蓝植物的水提取物，和水。

具体实施方式

以下更详细地解释本发明。

根据本发明的用于制造含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的方法包括过 滤包含靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇的混合物，并收集滤液。本 发明还包括通过所述制造方法获得的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物。

靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物

靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物可以通过浓缩靛蓝植物叶的乙醇提取 物获得。

靛蓝植物叶的乙醇提取物可以通过利用乙醇对靛蓝植物叶进行提取 获得。用于从其收集靛蓝植物叶的靛蓝植物的类型优选是其叶含有色胺酮 的靛蓝植物。蓼蓝(Polygonum tinctorium)是特别优选的。待使用的靛蓝植 物叶优选是干燥叶。干燥的靛蓝植物叶的实例包括冻干的靛蓝植物叶，热 干(heat-dried)的靛蓝植物叶，和晒干的靛蓝植物叶。使用晒干的靛蓝植物 叶是特别优选的，因为所获得的靛蓝植物叶提取物具有非常高的色胺酮含 量。用于获得干燥的靛蓝植物叶的方法没有特别限制。例如，靛蓝植物叶 可以在摘取叶后被干燥。备选地，在整个植物被干燥后，可以收集叶子。 当在阳光下干燥叶子时，可以根据天气状况等适当地选择干燥时间。例如， 在九月至十一月，当在日本收获靛蓝植物叶时，可以通过暴露于太阳达约 2至7天来干燥所述叶子。

乙醇提取方法没有特别限制并且可以适当地从已知的方法选取。例 如，可以在回流下用乙醇对靛蓝植物叶进行提取。更具体地，例如，可以 将靛蓝植物叶和乙醇放入与冷凝器相连的烧瓶中并回流约1至6小时。可 以适当地选择要加入到乙醇中的靛蓝植物叶的量。例如，可以将基于干质 量的1至10g的靛蓝植物叶加入到100mL乙醇中。尽管含水乙醇(水和乙 醇的混合物)可以用于所述提取，但是具有高乙醇含量的含水乙醇是优选 的。例如，含水乙醇优选含有比例为70体积％以上，更优选90体积％以 上，甚至更优选95体积％以上，并且还更优选99体积％以上的乙醇。

浓缩乙醇提取物可以通过对乙醇提取物进行浓缩获得。浓缩乙醇提取 物的方法没有特别限制，并且可以适当地从已知的方法选择。优选的浓缩 方法可以是，例如，在减压下蒸馏。具体地，减压蒸馏浓缩物适合作为浓 缩乙醇提取物。在减压下蒸馏可以例如通过使用减压蒸馏浓缩器或真空蒸 馏浓缩器进行。虽然浓缩的程度没有特别限制，但是可以浓缩乙醇提取物 以去除例如90％(优选约90至99.99％)以上的提取物的质量。如上所述， 可以例如通过在减压下蒸馏或通过真空蒸馏来进行所述去除。可以对提取 物进行浓缩例如直至减压下的蒸馏几乎不使质量发生变化(没有实质性变 化)。

多元醇

通常用于外部制剂(如化妆品、类药品或外用药)的任何多元醇可以用 作本发明中的多元醇。在多元醇中，一元醇或二元醇是优选的。更具体地， 甘醇或甘油是优选的。其具体实例包括1，3-丁二醇，丙二醇，戊二醇(1，2- 戊二醇)，丙三醇，二丙二醇，1，3-丙二醇，异戊二醇(isopentyldiol)等。其 中，1，3-丁二醇，丙二醇，戊二醇和异戊二醇是优选的，并且1，3-丁二醇 是特别优选的。这些多元醇可以单独使用或以两种以上的组合使用。

包含靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇的混合物

用于本发明的包含靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇的混合物 可以例如通过混合靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇来获得，如上所 述。所述浓缩乙醇提取物与多元醇的混合比率没有特别限制并且可以适当 地选择。例如，浓缩乙醇提取物：多元醇的质量比优选在1：16至2：1，更优 选在1：13至1：1，并且甚至更优选在1：10至1：5的范围。

当使用通过浓缩乙醇提取物制备的浓缩乙醇提取物并且添加相对较 小量的多元醇时，通过以下所述的过滤步骤获得的滤液的量可以被减少， 因此提供含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的更浓的溶液。这可以增加或调节 溶液形式的靛蓝植物叶提取物中的色胺酮浓度并且由此增强提取效率。

包含靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇的混合物还可以含有水。 所述混合物可以通过混合靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇并且进 一步添加水来制备。备选地，所述混合物也可以通过混合靛蓝植物叶的浓 缩乙醇提取物和含水多元醇(水和多元醇的混合物)来制备。在任一种情况 中，水与多元醇的混合比率没有特别限制，并且可以适当地选择。水与多 元醇的质量比优选在25：75至75：25，更优选在40：60至60：40，并且甚至 更优选在45：55至55：45的范围。当使用含水多元醇时，该含水多元醇中 的水与多元醇的混合比优选为上述质量比。在混合含水多元醇后，可以加 入水和／或多元醇或乙醇。

如上所述，根据本发明的用于制造所述提取物的方法可以包括以下四 个步骤：

(i)利用乙醇对靛蓝植物叶进行提取，

(ii)浓缩该靛蓝植物叶的乙醇提取物，

(iii)将该靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物与多元醇或含水多元醇混合 (并且任选地进一步将水与其混合)，以及

(iv)过滤该靛蓝植物叶的浓缩乙醇提取物和多元醇的混合物，并收集 滤液。

特别地，本发明的方法的优选实施方案包括：包括步骤(iv)的方法， 包括步骤(iii)和(iv)的方法，包括步骤(ii)至(iv)的方法，和包括步骤(i)至(iv) 的方法。

过滤

在根据本发明的用于制造提取物的方法中，将所述混合物过滤并收集 滤液。用于过滤所述混合物的方法不受特别限制，并且可以适当地选自己 知的方法。例如，可以单独地或组合地使用以下各项：过滤器，压力过滤 器，压滤机，冷却过滤器，吸滤器，以及使用滤纸、滤布、楔形丝筛、聚 氨酯筛网的类似过滤器，薄膜过滤器，玻璃过滤器等。例如，一种优选的 方法包括通过使混合物通过具有滤布的过滤器(例如，叶片式过滤器或 Fundabac过滤器)获得滤液并且使用薄膜过滤器或玻璃过滤器进一步过滤 所述滤液。另一种优选的方法可以是这样的方法，所述方法可以通过使用 可以保留粒度为约10μm以上的粒子的滤纸(例如，由Advantech Co.，Ltd. 制造的1号定性滤纸(Qualitative Filter Paper No.1))进行过滤，如吸滤，来 除去粒度为约15μm以上(优选约10μm以上)的粒子。

通过过滤获得的滤液可以被用作含色胺酮的靛蓝叶提取物而不需要 对滤液进行任何改变。备选地，获得的滤液可以被干燥(例如，在减压下干 燥或冻干)成固体(例如，粉末)，并且所得的固体可以用作含色胺酮的靛蓝 植物叶提取物。本发明的范围还包括这样的含色胺酮的靛蓝植物叶提取 物。

含色胺酮的靛蓝叶提取物

本发明的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物以溶液形式表现出高的光稳 定性并且对皮肤引起很少的刺激(特别地，皮肤致敏)；因此，所述提取物 适于施用至皮肤。特别地，当通过以上过滤获得的滤液以其当前状态被用 作含色胺酮的靛蓝植物叶提取物时，浓度几乎没有变化，即使是在暴露于 白光达2周后。更具体地，优选的是在用白光照射后保持至少80％(更优 选90％以上)的所述照射前的色胺酮含量。在本文中利用白光照射是指利 用约10，000勒克斯(lux)的白光照射。照射可以通过使用普通白色荧光灯进 行。

此外，当将通过浓缩或干燥滤液获得的糊状物、固体(例如，粉末)等 再次溶解在合适的溶剂中时，可以提供与以上所述相同的效果。作为合适 的溶剂，例如，可以使用选自由水、乙醇和以上提及的多元醇组成的组中 的至少一种溶剂。

当提取物以溶液形式使用时，滤液可以以原样使用。备选地，可以将 干燥(例如，冻干)或以其他方式加工成固体(例如，粉末)的滤液溶解在合适 的溶剂中并使用。

提取物引起皮肤刺激(特别地，皮肤致敏)，不管提取物是靛蓝植物叶 的乙醇提取物还是靛蓝植物叶的多元醇提取物。然而，通过本发明的制造 方法获得的靛蓝植物叶提取物引起小得多的皮肤刺激(特别地，皮肤致敏)。 虽然不期望限制性的阐明，但是实现此效果大概是由于以下原因：虽然靛 蓝植物叶含有多种皮肤刺激物，但是其中的一些溶解在乙醇中而其他一些 溶解在多元醇中，靛蓝植物叶不含被溶解在乙醇和多元醇两者中的皮肤刺 激物。基于该假设，对于用作浓缩乙醇提取物，认为优选的是尽最大可能 地从乙醇提取物中除去乙醇。此外，据信提供相似效果的靛蓝植物叶提取 物也可以通过混合靛蓝植物叶的浓缩多元醇提取物和乙醇，过滤所述混合 物，并收集滤液来制造。

包含含色胺酮的靛蓝叶提取物的用于外部施用至皮肤的组合物

本发明还包括一种用于外部施用至皮肤的组合物，其包含含色胺酮的 靛蓝植物叶提取物。本发明的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物具有优异的对 光的稳定性(光稳定性)和温度稳定性，对皮肤引起很少的刺激，并且适合 施用至皮肤。因此，在使用根据本发明的用于外部施用至皮肤的组合物的 情况下，可以优选享有色胺酮的效果。具体地，根据本发明的用于外部施 用至皮肤的组合物的色胺酮含量几乎不会由于温度或光而减少，即使是在 长期储存后，并且该组合物对皮肤引起很少的刺激并且可以优选表现出色 胺酮的作用，如抗炎作用和抗变应性作用。

根据本发明的用于外部施用至皮肤的组合物可以是单独的含色胺酮 的靛蓝植物叶提取物(包括其溶液形式)，或者除了含色胺酮的靛蓝植物叶 提取物以外还可以包含任选的已知用于外部施用至皮肤的成分，只要不损 害本发明的效果。任选成分的量可以适当地选择，只要不损害本发明的效 果。例如，基于用于外部施用至皮肤的组合物的总重量，任选成分可以以 0.1至99％的量使用。任选成分的实例包括已知的表面活性剂，水溶性聚 合物，着色剂，抗氧化剂，螯合剂，防腐剂，pH调节剂，冷却剂，调味 剂，增湿剂，UV吸收剂，UV散射剂，抗氧化试剂，酯油，动物和植物 油等。此外，也可以掺入用于外部施用至皮肤的其他活性成分，只要可以 提供本发明的效果。这样的活性成分的实例包括已知的增白剂，抗炎剂， 抗皱剂，脂肪分解剂，毛发生长剂等。

本发明的用于外部施用至皮肤的组合物可以用作，例如，用于皮肤的 外部制剂(药物或类药物)或化妆品。用于皮肤的外部制剂可以以适合施用 至皮肤的剂型使用，如凝胶剂，霜剂，软膏剂，擦剂，洗剂，乳剂，粉剂， 混悬剂，气溶胶，硬膏剂，泥敷剂，扎带(tapes)，膏药等。凝胶剂、霜剂 和乳剂是优选的。所述化妆品可以用作皮肤化妆品如洗剂，乳剂，霜剂， 浆液，保冷剂(packs)，化妆打底洗剂(makeup base lotions)，化妆打底霜剂 (makeup base creams)，粉底，眼彩，颊彩，唇膏和遮光剂；皮肤清洁剂如 清洁洗剂，清洁霜剂，清洁泡沫剂，面皂，面部洗涤剂和体用香波；毛发 化妆品如洗发香波，毛发漂洗剂，和毛发处理剂(hair treatments)；浴盐等。 霜剂，浆液，和遮光剂是优选的。这些产品可以通过已知方法，使用任选 地具有以上任选成分和活性成分的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物制造。

实施例

以下更具体地解释本发明。然而，本发明不限于以下实施例。

含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的制备

制造例：制造程序的概要显示在图1中。

将50g蓼蓝(Polygonum tinctorium)的晒干的叶(在整个植物在阳光下 干燥后收集的叶)添加到800mL(740g)的99.5％乙醇中并在回流下用乙醇 提取达2小时。在提取后，使提取物冷却至室温并且通过300-目不锈钢过 滤器进行过滤以除去叶。获得的滤液(靛蓝植物叶的乙醇提取物)在下文中 也被称为“靛蓝植物Et提取物”。

通过使用旋转蒸发器将约530g的靛蓝植物Et提取物在减压下蒸馏并 且浓缩直至总重量减至7.9g以下。获得的浓缩物在下文中有时被称为“浓 缩靛蓝植物Et提取物”。

此外，将80mL的50％(w／w)含水1，3-丁二醇添加到约5g的浓缩靛 蓝植物Et提取物中以溶解该提取物。过滤所获得的浓缩靛蓝植物Et提取 物的溶液，并且收集滤液。使用能够保留粒度为约10μm以上的粒子的滤 纸(由Advantech Co.，Ltd.制造的1号定性滤纸)通过吸滤进行过滤。将用于 获得滤液的程序重复22次。每次获得的滤液的平均重量为约74g。该滤 液在下文中被称为“靛蓝植物Et-BG提取物”。靛蓝植物Et-BG提取物是本 发明的含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的一种优选实施方案的一个实例。

比较制造例：制造程序的概要显示在图2中。

将五十克蓼蓝(Polygonum tinctorium)的晒干的叶(在整个植物在阳光 下干燥后收集的叶)浸没在50％(w／w)含水1，3-丁二醇中并且使其在55℃ 静置5小时。通过吸滤(使用由Advantech Co.，Ltd.制造的1号定性滤纸) 过滤所得的产物。该滤液在下文中被称为“靛蓝植物BG提取物”。

包含在靛蓝植物提取物中的色胺酮的稳定性的考察

将靛蓝植物Et-BG提取物和靛蓝植物BG提取物储存在四种条件(1) 至(4)下，并且在储存开始后1个月、2个月和3个月测量每种提取物的色 胺酮含量。此外，在储存开始后2周测量靛蓝植物Et-BG提取物。对于用 白色荧光灯的照射，用约10,000勒克斯的白光照射每种提取物。更具体地， 将两个白色荧光灯(FL40SS-EX-D／37(长形状)，由Panasonic Corporation制 造，长度：1198mm，玻璃管直径：28mm)平行放置(灯之间的距离：约 30cm)，并且将每种提取物放置在灯之间的位置(即，每个白色荧光灯到提 取物的距离为约15cm)。

条件(1)：在室温在暗处储存。

条件(2)：在40℃在暗处储存。

条件(3)：在-5℃在暗处储存。

条件(4)：在室温在白色荧光灯的恒定照射下储存。

在以下条件下使用HPLC通过与参考样品比较来测量色胺酮含量：

HPLC条件

柱：Cosmosil5C18MS-II4.6x150mm(5μm)

洗脱剂：水／甲醇=50／50

流速：1mL／min

柱温度：40℃

检测波长：254nm

注射体积：20μL

图3显示靛蓝植物Et-BG提取物的结果。图4显示靛蓝植物BG提取 物的结果。由图3和4确认的是，靛蓝植物Et-BG提取物表现出优异的光 稳定性(即使是在光照射下，稳定达至少1个月)，而在靛蓝植物BG提取 物中色胺酮被光分解并且色胺酮含量下降。这些结果还显示两种提取物都 具有优异的温度稳定性。此外，与靛蓝植物BG提取物相比，靛蓝植物 Et-BG提取物具有明显高的色胺酮浓度。这表明靛蓝植物Et-BG提取物是 富含色胺酮的提取物。假定以上用光照射一个月的条件(4)对应于提取物的 约1年的光照射(如果提取物作为储存的产品展示呈现)。因此，据信，如 果商业化，则所述提取物将表现出足够的光稳定性。

含色胺酮的靛蓝植物叶提取物的皮肤刺激(致敏)的考察

试验例1：靛蓝植物BG提取物的皮肤致敏

通过豚鼠最大值试验法(GPMT法)，使用豚鼠(5只豚鼠在致敏组中并 且3只豚鼠在对照组中；购自Japan SLC，Inc.)来测试靛蓝植物BG提取物 的皮肤致敏。用于此试验的靛蓝植物BG提取物具有20.4μg/mL的色胺酮 浓度。试验中使用的弗氏完全佐剂(FCA)购自Difco Laboratories，Inc.。

以如下详述的方式进行皮内致敏。具体地，在致敏的第一天，致敏组 被施用以下物质(a)、(b)和(c)(以此次序)，并且对照组被施用以下物质(a)、 (d)和(a)(以此次序)，以0.1mL部分施用到每只豚鼠的颈部皮肤的右侧和 左侧(即，两个位置)，其施用的方式为使得每个施用位置稍微错开。换言 之，向每只豚鼠颈部皮肤右侧上的三个部位及其左侧上的三个部位进行皮 内施用。在致敏组中，(a)和(b)之间的施用间隔被设定为短于(b)和(c)之间 的施用间隔。在对照组中，(a)和(d)之间的施用间隔被设定为短于(d)和(a) 之间的施用间隔。此外，致敏组中(a)和(b)之间的施用间隔与对照组中(a) 和(d)之间的施用间隔被设定为彼此几乎相等。致敏组中(b)和(c)之间的的 施用间隔与对照组中(d)和(a)之间的施用间隔被设定为彼此几乎相等。

(a)：含有等量的弗氏完全佐剂(FCA)和生理盐水的乳剂

(b)：30w／w％靛蓝植物BG提取物溶液(溶剂：生理盐水)，

(c)：含有等量的60w／w％靛蓝植物BG提取物溶液(溶剂：生理盐水)和FCA 的乳剂

(d)：生理盐水

如下进行接触致敏。在皮内致敏(第0天)起的第7天，将2x4cm棉 绒布用0.2mL的靛蓝植物Et提取物浸渍并且封闭地施用至皮内施用的部 位达48小时。

如下进行攻击(challenge)。在从致敏起的第21天，将用于斑贴试验的 绷带的布部分用0.1mL的50w／w％靛蓝植物BG提取物溶液(溶剂：注射 用水)浸渍，并且将所得到的斑贴(patch)封闭地施用到每只豚鼠的腹侧达 24小时。在去除攻击斑贴后24小时和48小时进行皮肤反应的观察。考察 的概要显示在图5和以下中。

试验方法：豚鼠最大值试验法(GPMT法)

所使用的动物：白色豚鼠(5只豚鼠用于致敏组并且3只豚鼠用于对照组)

样品：靛蓝植物BG提取物

方法：第0天：将FCA，样品(30％)，以及FCA和样品(60％)的组合皮内

施用至颈部的背侧。(致敏)

第7天：将样品(100％)封闭地施用达48小时。(致敏)

第21天：将样品(50％)封闭地施用到腹侧。(攻击)

第22天至第23天：在致敏后24小时和48小时进行观察。

在测试期间，在受试者的总体状况方面没有观察到异常，每个受试者 的体重也稳定地增加。皮肤观察的结果(去除斑贴后48小时)显示在表1中。

表1

用于计算表1中的阳性率和平均评分等的方法显示在图6和以下中。 评估：皮肤反应标准(Draize法)

红斑和痂形成0至4+浮肿形成0至4=总的0至8(得分)

红斑和痂形成

0：无红斑

1：非常轻微的红斑(几乎察觉不到)

2：明显的红斑

3：中度至重度的红斑

4：严重的红斑(深红色)至轻微的痂形成(深度损伤)

浮肿形成

0：无浮肿

1：非常轻微的浮肿(几乎察觉不到)

2：轻微的浮肿(明显的凸起良好界定的区域边缘)

3：中度的浮肿(凸起大约1毫米)

4：严重的浮肿(凸起超过1毫米并且延伸超出暴露区域)

在每次判断中，对于“红斑和痂形成”以及“浮肿”，将等于或高于1的 总评分判断为阳性，并且阳性率从以下公式获得。致敏组的阳性率和对照 组的阳性率之间的差被用作致敏率，并且依照以上标准进行致敏评价分 级。然而，0％的致敏被定义为无致敏。平均评分同样从以下公式计算。致 敏率从以下公式计算。

阳性率(％)=(阳性动物的数目／动物的总数)x100

平均评分=(红斑和浮肿的总分)／动物的数目

致敏率(％)=致敏组的阳性率-对照组的阳性率

由获得的致敏率，可以如下地确定致敏评价分级。

如上所示，靛蓝植物BG提取物表现出皮肤致敏作用。靛蓝植物BG 提取物在50w／w％的攻击浓度的致敏评价分级为V级(极强)。

试验例2：靛蓝植物Et提取物和靛蓝植物Et-BG提取物的皮肤致敏

通过佐剂和斑贴试验方法，使用豚鼠(致敏组中的5只豚鼠和对照组中 的3只豚鼠；购自Japan SLC)，考察靛蓝植物Et提取物和靛蓝植物Et-BG 提取物的皮肤致敏。此测试中所用的靛蓝植物Et提取物的色胺酮浓度为 17.0μg/mL，并且测试中使用的靛蓝植物Et-BG提取物中的色胺酮浓度为 17.2μg／mL。此外，测试中使用的弗氏完全佐剂(FCA)购自Difco  Laboratories。

如下进行致敏组的致敏。在致敏的第0天，将含有等量的弗氏完全佐 剂(FCA)和生理盐水的乳剂皮内地施用于施用部位(颈部皮肤)的四个角落 处，并且通过用皮下注射针在其上划出井号(#)来标记施用地点。然后，通 过使用用0.1mL的靛蓝植物Et提取物浸渍的2x4cm棉绒布，施加封闭 斑贴达24小时以使四个井号的划痕都被覆盖。在第1天和第2天，进行 相同的程序，不同之处在于皮内施用。在第7天，将用0.2mL靛蓝植物 Et提取物浸渍的2x4cm棉绒布的封闭斑贴施加至相同部位达48小时。 对于对照组，使用注射用水代替提取物进行类似处理。

如下进行攻击。在致敏起的第21天，将用于斑贴试验的每个绑带的 布部分用0.1mL的50w／w％靛蓝植物Et提取物溶液或50w／w％靛蓝植物 Et-BG提取物溶液浸渍(在两种情况中都使用注射用水作为溶剂)，并且将 封闭斑贴施加至豚鼠的右腹部和左腹部达24小时。在除去攻击斑贴后24 小时和48小时进行对皮肤反应的观察。考察的概要显示在图7和以下中。 试验方法：佐剂和斑贴试验

使用的动物：白色豚鼠(5只豚鼠用于处理组并且3只豚鼠用于对照组)

方法：第0天：皮内施用FCA至颈部的背侧。(在图7中，在豚鼠的图上， 施用的位置由在数字1(颈部)处的四个角落处的井号显示)。

方法：第0天：将FCA皮内施用到颈部的背侧。(在图7中，在豚鼠的图 上，施用的位置由在数字1(颈部)处的四个角落处的井号显示)。

第0至2天：封闭地施加样品(100％)的斑贴达24小时x3天(靛蓝植 物Et提取物)。

第7至9天：在腹侧部分封闭地施加样品(100％)的斑贴达48小时(靛 蓝植物Et提取物)

第21至22天：在腹侧部分封闭地施加样品(50％)的斑贴(靛蓝植物Et 提取物，靛蓝植物Et-BG提取物)

第23至24天：除去斑贴，然后在24和48小时后进行观察。

图7中的豚鼠的图显示具有井号形状的划痕(4个位置)，用于致敏的 封闭斑贴部位，和用于攻击的封闭斑贴部位的概要。

在测试期间，在受试者的一般状况方面没有观察到异常，每个受试者 的体重也稳定地增加。当使用50w／w％溶液进行攻击时的皮肤观察的结果 (去除斑贴后48小时)显示在表2中。表2中的“阳性率”和“平均评分”的计 算方法等与试验例1中的那些(显示在以上或图6中)相似。

表2

如上所示，虽然在使用靛蓝植物Et提取物的情况下观察到皮肤致敏， 但是在使用靛蓝植物Et-BG提取物的情况下没有观察到皮肤致敏。靛蓝植 物Et提取物在50w／w％的攻击浓度的致敏评价分级为III级(中度)。

由以上结果，确认的是，靛蓝植物BG提取物和靛蓝植物Et提取物具 有引起皮肤致敏的潜力，而靛蓝植物Et-BG提取物不具有引起皮肤致敏的 潜力并因此对于施用至皮肤是优选的。

各种干燥的靛蓝植物的叶的考察

考察包含在所获得的靛蓝植物叶提取物中的色胺酮的量是否根据所 用靛蓝植物叶的状态而变化。

收获整棵蓼蓝(Polygonum tinctorium)(地上部分)，冷藏运输同时将其 插入供水海绵中，并且如下所述地干燥。

1)新鲜叶(未干燥的)。

2)叶子收集自整株植物然后冻干(12小时)。

3)叶子收集自整株植物然后通过加热干燥(80℃，24小时)。

4)叶子收集自整株植物然后晒干(2天；开花前)。

5)叶子收集自整株植物然后晒干(2天；开花后)。

6)将整株植物晒干(7天)，然后收集叶子。

在所有过程中，使用蓼蓝(蓼青黛，knotweed indigo)植物的40g新鲜 叶。干燥后，在所有情况下都获得约7.5g的干燥叶。

接下来，通过使用以上在1)至6)项中描述的新鲜叶或干燥叶，以及市 售的干燥靛蓝植物叶，以与在以上制造例1中描述的方法相似的方式制造 靛蓝植物Et提取物。然后，使用上述的HPLC条件测量每种提取物中的 色胺酮的量。

结果显示在图8中。由这些结果，揭示的是，通过使用干燥叶而不是 新鲜叶可以获得含有更大量的色胺酮的提取物，通过使用晒干的叶可以获 得含有显著更大量的色胺酮的提取物，并且通过在阳光下干燥靛蓝植物叶 可以提高包含在靛蓝植物叶中的色胺酮的量。

靛蓝植物叶提取物的抗菌活性的考察

如下所述考察各种靛蓝植物叶提取物的抗菌活性的强度。考察中使用 的SCD液体培养基和SCDLP琼脂培养基购自Merck Ltd。具体地，“大豆 酪蛋白消化液”(由Merck Ltd.制造)被用作SCD液体培养基，而“具有卵磷 脂和聚山梨醇酯80的大豆酪蛋白消化液琼脂”(由Merck Ltd.制造)被用作 SCDLP琼脂培养基。此外，考察中使用的“靛蓝植物的水提取物”是使用水 代替在制造靛蓝植物BG提取物的方法(即，在以上比较制造例中描述的方 法)中使用的50％(w／w)与水混合的1，3-丁二醇而获得的靛蓝植物叶提取 物。

将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(NBRC13276)悬浮在5mL  SCD液体培养基中，并且通过振荡在30℃过夜培养。使用SCD液体培养 基稀释该培养物以使其具有0.5McFarland(相当于约1.5x10⁸CFU／mL的 活细胞计数浓度)。使用SCD液体培养基将获得的稀释液进一步稀释100 倍以获得细菌悬浮液。

将150μL的靛蓝植物Et-BG提取物，靛蓝植物BG提取物，靛蓝植 物的水提取物或水添加到被分配在试管中的4.5mL SCD液体培养基中， 并且向其中进一步加入SCD液体培养基以获得5mL的总体积。将50μL 的细菌悬浮液添加到所获得的含提取物的培养基中，并充分搅拌该混合 物，并且通过振荡在30℃培养24小时。将以此方式获得的液体培养基用 作细菌培养液。将细菌培养液使用0.85％氯化钠溶液系列稀释10倍／稀释， 并且将100μL各系列稀释的溶液铺板在SCDLP琼脂培养基上并且在30℃ 培养1天。具体地，将含有靛蓝植物Et-BG提取物的细菌培养液稀释10⁴倍或10⁵倍，并且将由此获得的各个溶液铺板并且在两个琼脂培养基平板 (总计4个平板)上培养。相似地进行含有其他提取物或水的细菌培养液的 培养，不同之处在于所述液体被稀释10⁵倍或10⁶倍。计数在培养基的表 面上产生的菌落数，并且基于测得的菌落计数获得1mL细菌培养液中含 有的活细胞计数(CFU／mL)。图9是柱形图，其显示使用每种靛蓝植物叶提 取物获得的活细胞计数的相对比率，其中使用水而不是靛蓝植物叶提取物 获得的活细胞计数被定义为1。在图9中，单个星号(*)表示p<0.05，而 两个星号(**)表示p<0.005。在当通过将靛蓝植物BG提取物或靛蓝植物 的水提取物加入培养基进行培养时与当通过将水加入培养基进行培养时 之间没有观察到显著差异。

由以上结果，揭示的是：靛蓝植物Et-BG提取物具有极优异的抗菌活 性。

以下显示本发明的用于外部施用至皮肤的组合物的配方例。每个配方 例依照本领域通常使用的方法制备。在配方例中，“靛蓝植物提取物”是指 靛蓝植物Et-BG提取物；并且％表示质量％。

表3

配方例1：美容洗剂(Beauty Lotion)

表4

配方例2：面部洗剂(Face Lotion)

表5

配方例3：护肤霜

表6

配方例4：UV霜

表7

配方例5：洗面膏(Face Wash)

表8

配方例6：清洗剂