解淀粉芽孢杆菌HRH317及其抑菌物质的制备方法

摘要

从土壤中分离筛选的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HRH.317菌株于2013年3月15日保藏，保藏号CGMCCNo.7314。该菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，菌体形成大量芽孢，形成芽孢前菌体呈杆状，排列为单个或成链，革兰氏阳性；培养3天，菌落形态乳白色，直径约6.75mm，表面有褶皱，光学特征不透明、有凸起、圆形、边缘呈波状或花瓣状；液体静置培养时有菌膜生成；与已知菌株的16SrDNA基因序列进行同源性比对，与解淀粉芽孢杆菌的同源性达到了99%-100%，从16SrDNA序列的系统进化树显示，与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens strain BGP20）的相似性最高，经生理生化鉴定，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说是涉及一株广谱抑菌的解淀粉芽孢杆菌新菌株及其所产生抑菌物质的制备方法。

背景技术

近年来,食品卫生安全问题比较突出,人民群众盼望吃上放心食品、安全食品的呼声越来越高,但食品安全问题一直没有得到很好的解决。食品安全问题中最主要的问题之一就是食品腐败变质,据世界卫生组织（WHO）统计,每年全球仅因食品腐败变质而造成的经济损失就多达几百亿美元。食品腐败变质通常是由于微生物引起的，果蔬产品的霉烂更是由真菌引起，而目前真菌防治主要以化学合成防腐剂及化学农药为主，化学农药引起的环境污染已经对人类健康造成潜在的威胁，亟待有新的、高效的微生物防腐剂及农药新品种或新剂型投放市场，以满足该领域的需求。

发明内容

本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌HRH.317及其抑菌物质的制备方法，该抑菌物质具有抑菌谱广、抑菌活性高, 能抑制多种真菌和细菌。

本发明的技术方案如下：

一株解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens) HRH.317菌株，于2013 年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7314，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述的解淀粉芽孢杆菌HRH.317是从田间土壤中分离筛选得到的。在由下列成分的质量/体积份组成的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.5份，蛋白胨1份，NaCl 0.5份，琼脂1.5份，蒸馏水100份，培养液的PH值为7.2-7.4)上37℃恒温培养24小时，菌体形成大量芽孢，形成芽孢前菌体杆状（0.9~1.4×2.7~3.9μm），排列为单个或成链（见图1），革兰氏阳性；培养3天，菌落形态为：乳白色，直径约为6.75mm、表面不光滑有褶皱，光学特征不透明、有凸起、圆形、边缘呈波状或花瓣状（见图2）；液体静置培养时，有菌膜生成；穿刺接种培养菌体在试管的培养基内云雾状扩散生长，表明有运动性；经生理生化鉴定，其特征见表1；

表1解淀粉芽孢杆菌HRH.317的生理生化特征

检测指标结果检测指标结果硝酸盐还原+柠檬酸盐利用+接触酶+苯丙氨酸脱氨酶—V-P测定+产吲哚—淀粉水解+吲哚丙酮酸（IPA）测定—耐盐性和需盐性 卵磷脂酶+2%NaCl+葡萄糖氧化发酵发酵型5%NaCl+明胶液化—7%NaCl+酪素水解+10%NaCl—水解马尿酸+  甲基红（M.R）—

注：“+”表示该项指标为阳性；“—”表示该项指标为阴性。

将提取所得解淀粉芽孢杆菌HRH.317的16S rDNA序列输入NCBI的GeneBank数据库中，与已知菌株的16S rDNA基因序列进行同源性比对，可知解淀粉芽孢杆菌HRH.317的16S rDNA序列与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ）的同源性最高，达到了99%-100%(见表2)。

表2解淀粉芽孢杆菌HRH.317序列同源性比对结果

从16S rDNA序列的系统进化树显示(见图3)，解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA序列与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens strain BGP20）的相似性最高。因此，将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )，并命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens ) HRH.317。

解淀粉芽孢杆菌HRH.317菌株所产抑菌物质的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备发酵液  将解淀粉芽孢杆菌HRH.317菌株接种到灭菌后的发酵用培养液中，在36-38℃、160 r/min条件下，培养20-24小时，得到发酵液；

（2）制备抑菌物质液  将（1）制备的发酵液经5000r/min 离心20 min后取上清液，即得液体抑菌物质。

本发明所述的发酵液是由下列质量/体积份的原料组成：牛肉膏 0.5份，蛋白胨1份，NaCl 0.5份，蒸馏水100份，pH 7.2。

通过下列试验显示本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质的特性

1、抑菌活力及抑菌范围

本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质通过牛津杯法试验，即将15mL牛肉膏蛋白胨培养基平铺于直径90mm，深20mm的培养皿中，置于水平台面上静置凝固，再取稀释至10⁶cfu/mL的指示菌菌悬液0.2 mL于上述凝固后的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，然后用无菌涂布棒将指示菌菌悬液涂匀，培养皿盖打开使无菌空气流通约40min，待指示菌菌悬液被牛肉膏蛋白胨培养基平板充分吸收略干后，将内径6mm、外径8mm、高10mm的无菌牛津杯用镊子轻轻放置于平板上，将200μL解淀粉芽孢杆菌HRH.317发酵液上清液加入牛津杯后，在4-5℃条件下扩散12小时，待发酵液充分扩散后于30℃培养3-5天（指示菌为细菌时3天；指示菌为酵母或霉菌时5天）观察抑菌圈情况。试验结果表明，该细菌的抑菌物质具有较高的抑菌活力，其效价为128AU/mL（指示菌为芽孢杆菌（Bacillus.sp）H108），且抑菌谱广，可以抑制多种食源性致病菌及引起食品腐败变质的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，可抑制的革兰氏阳性菌株包括：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）；可抑制的革兰氏阴性菌株包括：大肠杆菌（Escherichia coli）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）；还可抑制如酿酒酵母、红酵母、葡萄酒酵母、梨黑斑病菌菊池链格孢霉、葡萄霜霉、黑曲霉、青霉等多种真菌。试验结果详见表3、图4-图16。

表3  解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产抑菌物质的抑菌谱

序号指示菌来源抑菌圈直径（平均值：mm）1芽孢杆菌（Bacillus.sp）H108山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏312凝结芽孢杆菌(Bcillus>)CICC 10144中国工业微生物菌种保藏管理中心193枯草芽孢杆菌(Bcillus>)CMCC 63501-2aq中国医学微生物菌种保藏管理中心154金黄色葡萄球菌(Staphlococcus>)CMCC 26003-5a1中国医学微生物菌种保藏管理中心175大肠埃希氏菌(Escherichia>)CMCC 44102-3a11中国医学微生物菌种保藏管理中心156肠炎沙门氏菌（Salmonella>）山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏157酿酒酵母(Saccharomyces>)H226山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏168红酵母（Rhodotorula）H215山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏179葡萄酒酵母(Saccharomyces>)H222山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏1610梨黑斑病菌菊池链格孢(Alternaria>)山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏24.511葡萄霜霉（Plasmopara>）山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏20.512 黑曲霉(Aspergillus>)山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏2313青霉(Penicillium.sp)山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏20

2、酸抑制排除试验、排除过氧化氢试验和蛋白酶消化试验

用本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质，用青霉为指示菌，进行解淀粉芽孢杆菌HRH.317产生的抑菌物质的酸抑制排除试验、排除过氧化氢试验和蛋白酶消化试验,试验方法及结果如下：

（1）酸抑制排除试验方法： 将本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质的pH用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调至为7，以青霉为指示菌用牛津杯法作抑菌试验。试验结果见图17，图中a为酸抑制排除前，抑菌圈直径14㎜；b为酸抑制排除后，抑菌圈直径13.7㎜，两者之间无显著差异。

（2）排除过氧化氢试验方法： 取本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质，加过氧化氢酶，在37℃下水浴4小时后，以青霉为指示菌用牛津杯法做抑菌试验。试验结果见图18，图中a为排除过氧化氢前，抑菌圈直径14.5㎜；b为排除过氧化氢后，抑菌圈直径2.2㎜，两者之间的差异显著(P＜0.05）。

（3）蛋白酶消化试验方法：取本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质，先用1mol/L NaOH和1mol/L HCL调pH为蛋白酶K的最适作用pH5-9，按0.5mol/L量加入蛋白酶K，在37℃下水浴恒温2小时，再将pH值调回原来的数值，以青霉为指示菌用牛津杯法做抑菌试验。试验结果见图19，图中a为蛋白酶K消化前，抑菌圈直径16㎜；b为蛋白酶K消化后，抑菌圈直径14㎜，两者之间的差异显著(P＜0.05）。

试验结果表明：发酵上清液经酸抑制排除试验，表明该菌株发酵液上清液的抑菌活性不是来自于酸；过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径显著缩小；蛋白酶K处理后抑菌圈有所减小。表明解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens) HRH.317所产生的抑菌物质可能是过氧化氢和一种蛋白类或多肽类物质。

3、抑菌稳定性

（1）本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质具有良好的热稳定性

将本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质在60-90℃下热处理30min，其抑菌效果没有显著变化；在100℃下热处理15min，其抑菌活性为原来（CK）的67%；在100℃下热处理30min，抑菌活性为原来（CK）的57%；121℃下热处理15min，抑菌活性仍可保持原来（CK）的57%（见表4）。

表4  解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产抑菌物质的热稳定性

处理 60℃70℃80℃90℃100℃121℃热处理15min抑菌圈直径（mm） 201918181412热处理30min抑菌圈直径（mm） 191816.51512 CK 抑菌圈直径（mm）21      

因此，本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质具有良好的热稳定性，该特点决定其在食品工业生产中有很大的应用价值。

（2）本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质具有良好的酸碱稳定性

将本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质在pH 5-9 的范围内处理30min，抑菌效果的差异不显著；在pH 2条件下处理30min，抑菌活性仍可保留原有活性（CK）的77%；在pH 11条件下处理30min，抑菌活性仍可保留原有活性（CK）的82%，见表5。

表5 解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产抑菌物质的酸碱稳定性

处理 pH2pH3pH4pH5pH6pH7pH8PH9pH10pH11抑菌圈直径（mm） 17181922212221.5231918CK22          

表明该抑菌物质的抑菌活性有较宽的pH的适应范围。因此可在偏酸性、中性、偏碱性的条件中使用。

（3）本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质对表面活性剂具有良好的稳定性

采用聚乙二醇、吐温80、吐温20三种表面活性剂作为试验材料，用三种表面活性剂分别与本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的抑菌物质菌液混合均匀，配制为表面活性剂的浓度为1%的混合液，对照（CK）用蒸馏水代替表面活性剂，分别以青霉为指示菌做抑菌实验，37℃下培养4小时，测其抑菌圈直径。试验结果表明，经聚乙二醇、吐温80处理与对照没有显著差异；经吐温20处理后，解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产抑菌物质的活性明显降低，为对照的76.6%，见表6。

表6解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产抑菌物质对表面活性剂的稳定性

表面活性剂CK吐温20吐温80聚乙二醇抑菌圈直径（mm）23.5182322

本发明的有益效果

本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317产生的抑菌物质具有较高的抑菌活力，其效价为128AU/mL（指示菌为芽孢杆菌H108），抑菌谱广，可抑制多种引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等，也可抑制引起食品腐败变质的革兰氏阴性菌，如大肠杆菌和肠炎沙门氏菌；还可抑制如酿酒酵母、红酵母、葡萄酒酵母、梨黑斑病菌菊池链格孢霉、葡萄霜霉、黑曲霉、青霉等多种真菌。该抑菌物质具有良好的热稳定性和酸碱稳定性，对聚乙二醇、吐温80、吐温20三种表面活性剂也有很好的稳定性。本发明的解淀粉芽孢杆菌HRH.317产生的抑菌物质作为果蔬及食品的天然防腐剂具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317的菌体形态。

图2是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317的菌落形态。

图3是与本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317相关的16S rDNA序列系统发育树。

图4是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产抑菌物质抑制芽孢杆菌（Bacillus.sp）H108结果。

图5是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制凝结芽孢杆菌(Bcillus coagulans)CICC 10144结果。

图6是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制枯草芽孢杆菌(Bcillus coagulans)CMCC 63501-2aq结果。

图7是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)CMCC 26003-5a1结果。

图8是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CMCC 44102-3a11结果。

图9是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）结果。

图10是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H226结果。

图11是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制红酵母（Rhodotorula）H215结果。

图12是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)H222结果。

图13是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制梨黑斑病菌菊池链格孢(Alternaria kikuchi-ana)结果。

图14是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制葡萄霜霉（Plasmopara uiticola）结果。

图15是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制黑曲霉(Aspergillus niger)结果。 

图16 是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质抑制青霉(Penicillium)结果。

图17是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质酸抑制排除试验结果。

图18是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质排除过氧化氢试验结果。

图19是本发明解淀粉芽孢杆菌HRH.317所产的液体抑菌物质蛋白酶K消化试验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一株解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens) HRH.317，已于2013 年3 月15 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( 简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号为：CGMCC No.7314。

所述的解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens) HRH.317是从田间土壤中无意分离筛选得到的。在牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏 0.5g，蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，琼脂1.5g，水100mL，_PH 7.2，121℃，灭菌20分钟）上37℃恒温培养24小时，菌体形成大量芽孢，形成芽孢前菌体杆状（0.9~1.4×2.7~3.9μm），排列为单个或成链，革兰氏阳性；培养3天，菌落形态为：乳白色，直径约为6.75mm、表面不光滑有褶皱，光学特征不透明、有凸起、圆形、边缘呈波状或花瓣状；液体静置培养时，有菌膜生成；穿刺接种培养菌体在试管的培养基内云雾状扩散生长，表明有运动性。

经过生理生化鉴定包括：硝酸盐还原、接触酶、V-P测定、淀粉水解、柠檬酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶、耐盐性和需盐性、产吲哚、吲哚丙酮酸（IPA）测定、卵磷脂酶、葡萄糖氧化发酵、明胶液化、酪素水解、水解马尿酸、甲基红（M.R）等试验和16S rDNA系统发育分析，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens) 。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens) HRH.317所产的抑菌物质的制备方法，首先将解淀粉芽孢杆菌HRH.317接种到发酵用培养液（牛肉膏 0.5g，蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，水100ml，pH 7.2，121℃，灭菌20min）中，在37℃，160 r/min条件下，培养24小时，得到发酵液；然后将制备的发酵液经5000r/min 离心20 min后取上清液，即得粗制液体抑菌物质。

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