使用用于癌症治疗的化合物FL118制剂的非水溶性化合物新型制剂及方法

摘要

提供组合物，制备所述组合物的方法和应用所述组合物的方法。可提供所述组合物为用于疾病治疗(例如癌症治疗)的药物制剂。所述组合物包括含有效浓度化合物的新型药物制剂。所用的一种化合物是10H-1,3-二氧戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]氮茚并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,12H)-二酮,7-乙基-7-羟基-,(S)-。本发明还提供制备静脉内和口服药物制剂的方法，所述药物制剂包含难溶于水的药物化合物。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年10月29日提交的临时申请号61/407,996的优先权，其公 开内容通过引用纳入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明在国立癌症研究院授予的奖金号CA109481下由政府资助完成。政府 对本发明拥有某些权利。

技术领域

本发明一般涉及用于癌症治疗的组合物和方法。

技术背景

抗癌效能和选择性是成功抗癌治疗的两个至关重要的因素。抗癌药物开发 的传统方法使用细胞毒性作为药物选择标志。然而，通过该方法鉴定的候选药 物通常显示对癌症与正常组织几乎无选择性。因此，由于所选化合物对正常细 胞和组织的高毒性，无法开发其作为抗癌药物的应用。抗癌药物发现和开发中 的另一个挑战是过去数十年基于细胞毒性筛选的化合物库已衍生出庞大数量 的显示体外抑制癌细胞生长的化合物。然而，鉴定在相关动物模型内能显示临 床相关抗癌作用的化合物已证明非常困难。因此，在鉴定和开发现有化合物使 其能用于以临床相关治疗形式抑制癌症生长方面有当前存在且未满足的需求。 本发明满足了这些和其他需求。

发明内容

本发明提供用于抑制个体内癌生长的方法。所述方法包括对所述个体给予 药物制剂，所述药物制剂包含有效量的10H-1,3-二氧戊环并[4,5-g]吡喃并 [3',4':6,7]氮茚并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,12H)-二酮,7-乙基-7-羟基-,(S)- (“FL118”)。所述给予之后，所述个体内的癌生长受到抑制。所述药物制剂适合 使用多种技术给予个体，且特定用于静脉内和/或口服给药。本发明提供的所述 药物制剂包含水溶液、环糊精和极性非质子溶剂或醇。其还可包含辅助共溶剂。 不同实施方式中的环糊精是环糊精(βCD)、羟基丙基-β-环糊精(HPβCD)磺基丁 基醚-β-环糊精(SBEβCD)或其组合。在某些实施方式中，所述环糊精以0.125 -2.5%存在于所述制剂中。所述极性非质子溶剂可以1-10%存在于所述制剂中。 在一个实施方式中，所述极性非质子溶剂是二甲亚砜(DMSO)。在另一个实施 方式中，包括乙醇以替代所述极性非质子溶剂。在某些实施方式中，本发明的 所述药物制剂包括除FL118以外的一种或多种额外抗癌剂。本发明还提供用 于抑制个体内癌生长的方法。所述方法包括对所述个体给予包含有效量FL118 的药物制剂。本文公开了包含多种FL118含量的制备物，且包括但不必限于0.25 -5.0mg/mL FL118。本文还公开了对怀疑或诊断患有癌症的人提供有效量FL118 的不同剂量方案和方法。此外，还提供了使用本发明的制剂和其它抗癌剂联合 治疗的方法。

本发明还提供制备用于静脉内或口服给药的非水溶性药物制剂所用的策 略。这些方法一般包括提供溶剂A和溶剂B，使溶剂A在溶剂B中溶解以生成主 要溶剂A/溶剂B混合物，然后使非水溶性化合物溶解于所述溶剂A/溶剂B混合 物。将这些方法分为策略I、II和III，将在下文对其详述。

附图说明

图1FL118相较于临床使用的抗肿瘤药物显示较高抗肿瘤活性：如图所示以 不同剂量实施由箭头指示的一次腹膜内(i.p.)药物注射。这些药物各自所用的剂 量约为就其一次剂量方案而言的最大耐受剂量(MTD)。所述FL118剂量是其每 周处理一次×4方案的MTD。在皮下(s.c.)移植肿瘤之后7天开始处理，其被指定 为第0天，此时肿瘤重量为约200-250mg/mm³。FaDu：人头颈肿瘤。HCT-8： 人结肠肿瘤。其中注意到，癌得星(Cytoxan)(环磷酰胺)的结果过度呈现其有效 性(以*标记)，因为在该最末实验组中(5只小鼠/组)，移植的肿瘤量小于其它10 组(50只小鼠)的要求，这归因于就后来移植而言不足的肿瘤量可用性。肿瘤曲 线来自五只小鼠的五个肿瘤的平均值。

图2FL118和伊立替康(irinotecan)在携带人17073原发性头颈异种移植物的 SCID小鼠内的抗肿瘤活性和毒性(体重减轻)比较。A和B：FL118和伊立替康对 17073肿瘤的抗肿瘤活性和毒性。C、D和E：响应FL118和伊立替康的个体17073 肿瘤。该处理方案是每周处理一次×4(如箭头指示)。FL118和伊立替康的剂量 是其每周一次×4方案的MTD。

图3FL118对FaDu(头颈癌)和SW620(结肠癌)的大肿瘤(1500-2000mg/mm³) 的肿瘤生长抑制效果。所述小鼠用1.5mg/kg剂量的FL118每周处理一次共四周 (如箭头指示)。两只小鼠在第37天死亡，死因不明。一种可能性归因于化疗后 快速肿瘤分解，认为其能导致被称作肿瘤溶解综合症(TLS)的危及生命的并发 症。与此相符，两只死亡小鼠在用FL118处理初始时具有最大尺寸的肿瘤。

图4FL118化合物在即用注射液中功能性稳定，且可具有长保存期。对无胸 腺裸小鼠异种移植FaDu(头颈癌)和SW620(直肠癌)。肿瘤量长至1500-2000 mg/mm³后，如箭头指示，每周一次用1.5mg/kg剂量的FL118溶液处理小鼠四周， 配制所述FL118溶液并在4°C冰箱保存多于6个月。

图5以不同剂量和方案通过i.p.途径处理的裸小鼠内的FL118剂量响应图 表。指出了途径和方案。

图6的代表性实验显示FL118对携带FaDu(头颈癌)异种移植物的个体裸小 鼠(B)内肿瘤的抗肿瘤活性或对5只小鼠(C)肿瘤的平均抗肿瘤活性。FL118以 0.75mg/kg的剂量(50%MTD)通过i.p.每周给予一次共四周。在肿瘤移植后7天开 始处理，指定其为第0天(处理时肿瘤重量为约200-250mg/mm³)。向对照小鼠给 予相同体积的载剂溶液，因为大肿瘤量而在第12天处以安乐死(A)。

图7的代表性实验显示1mg/kg剂量(MTD下的剂量)的FL118对携带FaDu 异种移植物的个体裸小鼠(B)中肿瘤的抗肿瘤活性或对10只小鼠(C)肿瘤的平均 抗肿瘤活性。其它条件与图6中所述的相同。向对照小鼠给予相同体积的载剂 溶液，因为大肿瘤量而在第12天处以安乐死(A)。

图8是显示响应载剂对照(A)或FL1181.25mg/kg(B)的个体FaDu肿瘤的代表 性实验。其它条件与图6中所述的相同。图B所示来自10只个体荷瘤小鼠的平均 肿瘤生长抑制呈现于图C。

图9是显示响应载剂对照(A)或FL1181.5mg/kg(MTD，B)的个体FaDu肿瘤 的代表性实验。其它条件与图6中所述的相同。图B显示五只个体荷瘤小鼠的肿 瘤生长抑制。图C显示来自五只个体小鼠的平均肿瘤生长抑制。

图10显示FL118和伊立替康在携带人结肠原发肿瘤11124(A)和14528(C)的 SCID小鼠内的抗肿瘤活性(A和C)和毒性(体重减轻，B)。FL118以1mg/kg通过i.p. 给予，伊立替康以100mg/kg(MTD)通过i.p.给予，如箭头指示每周给予一次共4 周。在肿瘤移植后7天的第0天开始处理(处理时肿瘤重量为约200-250mg/mm³)。

图11的代表性实验比较FL118和伊立替康以其MTD在携带A549肺肿瘤异 种移植物的裸小鼠内的抗肿瘤活性(A)和毒性(体重减轻，C)。药物以其所示MTD 通过i.p.每周给予一次共4周。在肿瘤移植后7天的第0天开始处理(处理时肿瘤重 量为约200-250mg/mm³)。

图12FL118通过p.o.(口腔/口服)途径在携带FaDu头颈肿瘤异种移植物的裸 小鼠内的抗肿瘤活性(A)和毒性(B)。2mg/kg的药物每周经口(p.o.)给予一次共4 周。在异种移植物肿瘤移植后7天的第0天开始处理(处理时肿瘤重量为约 200-250mg/mm³)。

图13FL118通过p.o.在携带人SW620结肠肿瘤异种移植物的裸小鼠内的抗 肿瘤活性(A)和毒性(体重减轻)。该实验条件和步骤与图12中所示相同。

图14FL118在携带14528人原发结肠癌异种移植物的SCID小鼠内的抗肿瘤 活性(A)和毒性(体重减轻，B)。FL118(0.6mg/kg)和载剂对照通过p.o.每天一次 给予5天。其它条件与图12中所述的相同。

图15A.FL118和FL113的立体结构的比较：FL118和FL113的分子量相同 (MW=392)。FL118和FL113的差异在于羟基基团(-OH)的立体构象。FL118中 “-OH”在S位，而FL113中“-OH”一半在S位，一半在R位。所述两种化合物 的名称反映了该化学结构差异：FL118是“10,11-亚甲二氧基-20S-喜树碱”而 FL113是“10,11-亚甲二氧基-20(RS)-喜树碱”。B和C：FL113和FL118对比伊 立替康的体内抗肿瘤功效比较：使用人原发结肠癌异种移植物的SCID小鼠模型 评价FL113和FL118对比伊立替康(对照)的相对抗肿瘤活性。在所述实验中使用 两种人结肠癌组织[源自匿名结肠癌患者的11124(B)和14528(C)]。采用伊立替 康的临床相关方案进行药物处理(每周处理一次×4，如箭头指示)。指定初始药 物处理为第0天，而所述处理在皮下肿瘤移植7天后开始，此时肿瘤重量为约 200-250mg。各处理条件中的肿瘤曲线是源自五个肿瘤的平均值。

图16是显示FL118联合顺铂对HCT-8结肠癌细胞的作用的代表性实验。细 胞在含血清的完全培养基中生长至约50%融合，然后如图所示用一系列浓度的 FL118和顺铂单独或联合处理。细胞生长和活力在处理后72小时由MTT实验测 定。柱状图中以OD值显示相对细胞生长。各短线棒是来自三次独立平行处理的 平均值±SD。

图17显示FL118联合依托泊苷对HCT-8结肠癌细胞(A)和Skov3卵巢癌细胞 (B)生长的作用的代表性实验：细胞在含血清的完全培养基中生长至50%融合。 细胞如图所示用FL118和依托泊苷单独和联合处理。细胞生长和活力在处理后 72小时用MTT实验测定。柱状图中以OD值显示相对细胞生长。各短线棒是源 自3次独立处理的平均值±SD。

图18是说明FL118联合紫杉醇对HCT-8结肠癌细胞生长的作用的代表性实 验：细胞培养在含血清的完全培养基中生长至50%融合。细胞如图所示用FL118 和紫杉醇单独和联合处理。细胞生长和活力在处理后72小时用MTT实验测定。 柱状图中以OD值显示相对细胞生长。各短线棒是源自3次独立处理的平均±SD。

图19显示FL118联合阿霉素对HCT-8结肠癌细胞(A)和A2008卵巢癌细胞 (B)生长的作用的代表性实验：细胞在含血清的完全培养基中生长。细胞在达到 50%融合时如图所示用FL118和阿霉素单独和联合处理。细胞生长和活力在处 理后72小时用MTT实验测定。柱状图中以OD值显示相对细胞生长。各短线棒 是源自3次独立处理的平均值±SD。

图20呈现FL118对卵巢癌细胞中人生存素启动子驱动的荧光素酶活性的作 用。稳定表达人生存素启动子(6309bp)-驱动的荧光素酶报告基因的A2008卵巢 癌细胞用如图所示一系列浓度的FL118处理。细胞在处理后24小时裂解，然后 用来自普洛麦格公司(Promega)的荧光素酶实验系统测量荧光素酶活性。来自代 表性实验的3个独立测试孔的数据用柱状图作图。

图21显示FL118特异性下调生存素启动子活性而非其它启动子活性的代 表性数据。A.EKVX肺癌细胞。B.LNCaP前列腺癌细胞。细胞用由来自细胞周 期蛋白依赖性激酶抑制剂p21、二氢叶酸还原酶(DHFR)、人凝血酶受体(HTR) 或胸腺嘧啶激酶(TK)的基因启动子驱动的荧光素酶报告载体转染。细胞在转然 后16小时用10nM的FL118处理。细胞在FL118处理后24小时裂解，然后检测荧 光素酶活性。来自代表性实验的3个独立测试孔的数据(平均值±SD)用柱状图作 图。

图22显示FL118对生存素启动子活性和内源相关基因表达的选择性抑制 的代表性数据。A.稳定表达生存素启动子(6309bp)-荧光素酶构建体的PC-3前 列腺癌细胞用不同浓度的FL118处理。处理后24小时检测荧光素酶活性。B.分 别用由来自p21、DHFR、HTR或TK基因的基因启动子驱动的荧光素酶构建体转 染PC-3细胞，随后进行FL118处理和荧光素酶活性实验，条件与A中所述相同。 各短线棒是源自代表性实验中3个独立测试孔的数据的平均值±SD。C和D. FL118抑制内源生存素表达但不抑制内源p21和DHFR的表达。亚融合的EKVX 和HCT-8细胞如图所示用和不用FL118处理24小时。细胞随后裂解，并通过 western印迹使用相应抗体分析生存素、p21和DHFR的表达。使用肌动蛋白表达 作为内部对照。

图23显示FL118对IAP/Bcl-2家族蛋白表达差异性调节的代表性数据。亚融 合的细胞如图所示用和不用FL118处理。细胞随后裂解，并通过western印迹使 用相应抗体分析。A.A2008卵巢癌细胞中生存素表达的FL118抑制的时程。B. FL118对PC-3前列腺癌细胞中抗凋亡和促凋亡蛋白表达的差异性调节。C. FL118对HCT-8结肠癌细胞中生存素、XIAP、cIAP2和Mcl-1的下调。注，C中“*” 标记FL118诱导的促凋亡蛋白生存素-2B潜在表达。代表性肌动蛋白表达作为内 部对照显示。

图24显示FL118介导的对生存素和其它抗凋亡蛋白的抑制与胱冬酶活化 和PARP切割、凋亡标记相关联的代表性数据：亚融合的HCT-8结肠癌细胞如图 所示用和不用FL118处理，随后细胞裂解并用相关抗体western印迹分析。肌动 蛋白是内部对照。

图25显示FL118对Akt和MAP激酶通路差异性作用的代表性数据：亚融合 的HCT-8结肠癌细胞首先用(B、C)而不用(A)紫杉醇处理2小时，然后用FL118 按所示时程处理。所述处理的细胞裂解之后，通过western印迹测定总体和磷酸 化的Akt和Erk1/2。如图所示，FL118抑制组成型和紫杉醇诱导的Akt生存信号转 导。相反，FL118显示对Erk信号转导无抑制作用，说明其对不同信号通路的高 特异性作用。注，A中p-Akt检测的暴露时间是B中p-Akt检测的约4倍。

图26显示使用MTT实验比较FL118和紫杉醇(泰素)在癌细胞生存/生长抑 制方面的潜力。将H1650肺癌细胞接种在96孔板内(2000个细胞/孔)。细胞接种 后24小时如图所示用一系列不同浓度的FL118或紫杉醇处理。细胞活力在处理 后72小时由MTT实验测定。如图所示，在消减细胞活力方面，FL118的有效性 比紫杉醇高10-100倍。

图27显示FL118和SN-38(伊立替康的活化形式)对拓扑异构酶I活性(A和B) 和细胞生长/活力(C和D)的作用的代表性实验。在方法部分描述所述实验条件。

图28用于测试如发明所述非水溶性药物制剂的10种不同化合物的化学结 构。

图29使用如图所示剂量和方案的FL118处理后的毒性(小鼠体重减轻)。 SCID小鼠(3只小鼠/组)从第0天如图所示通过i.v.途径用1.5mg/kg剂量每天处理 一次共5次；用1.5和2.5mg/kg剂量隔天处理一次共5次；用5mg/kg剂量每周处 理一次×4共4次。各剂量方案曲线是来自3只小鼠的平均体重减轻。FL118以0.5 mg/mL在DMSO(5%)、HPβCD(0.25%)和盐水(95%)中配制。对照组用不含FL118 的对照溶液(5%DMSO；0.25%HPβCD和95%盐水)每天处理一次共5次(d×5)。

图30来自人FaDu头颈肿瘤SCID小鼠异种移植模型中三种FL118处理方案 类型的个体小鼠的肿瘤曲线：处理在皮下肿瘤移植后7天开始(指定为第0天)， 此时肿瘤重量约为200-250mg。FL118(0.5mg/mL)在DMSO(5%)、HPβCD (0.25%)和盐水(95%)中配制，在第0天通过i.v.途径按以下剂量和方案给予。A. 对照组用不含FL118的对照溶液(5%DMSO；0.25%HPβCD和95%盐水)每天处 理一次共5次(d×5方案)。B和C.1.5mg/kg和2.5mg/kg剂量的FL118按每天一次 ×5方案(5次)的抗肿瘤活性。D和E.1.5mg/kg和2.5mg/kg剂量的FL118按隔天一 次×5方案(5次)的抗肿瘤活性。F和G.3.5mg/kg和5mg/kg剂量的FL118按每周 一次×4方案(4次)的抗肿瘤活性。

图31来自人SW620结肠肿瘤SCID小鼠异种移植模型中三种FL118处理方 案类型的个体小鼠的肿瘤曲线：处理在皮下肿瘤移植后7天开始(指定为第0天)， 此时肿瘤重量约为200-250mg。FL118(0.5mg/mL)在DMSO(5%)、HPβCD (0.25%)和盐水(95%)中配制，在第0天通过i.v.途径按以下方案给予。A.对照 组用不含FL118的对照溶液(5%DMSO；0.25%HPβCD和95%盐水)每天处理一 次共5次(d×5方案)。B和C.1.5mg/kg和2.5mg/kg剂量的FL118按每天一次×5 方案(5次)的抗肿瘤活性。D和E.1.5mg/kg和2.5mg/kg剂量的FL118按隔天一次 ×5方案(5次)的抗肿瘤活性。F和G.3.5mg/kg和5mg/kg剂量的FL118按每周一 次×4方案(4次)的抗肿瘤活性。

图32来自人间皮瘤(211H和H226)肿瘤SCID小鼠异种移植模型中用5 mg/kg剂量FL118每周一次×4方案的个体小鼠肿瘤曲线：处理在皮下肿瘤移植 后7天开始(指定为第0天)，此时肿瘤重量约为200-250mg。FL118(0.5mg/mL) 在DMSO(5%)、HPβCD(0.25%)和盐水(95%)中配制，在第0天通过i.v.途径按 每周一次×4方案(4次)给予。A.来自211H间皮瘤肿瘤的对照组用不含FL118的 对照溶液(5%DMSO；0.25%HPβCD和95%盐水)每周处理一次×4共4次(周×4 方案)。B.用5mg/kg剂量的FL118对211H间皮瘤肿瘤每周处理一次×4方案(4 次)的抗肿瘤活性。C.来自H226间皮瘤肿瘤的对照组用不含FL118的对照溶液 (5%DMSO；0.25%HPβCD和95%盐水)每周处理一次×4共4次(周×4方案)。D. 用5mg/kg剂量的FL118对H226间皮瘤肿瘤每周处理一次×4方案(4次)的抗肿 瘤活性。

发明内容

本发明提供组合物、制备所述组合物的方法以及使用所述组合物治疗癌症 的方法。一般而言，所述组合物包括含有效浓度化合物的新型药物制剂。在多 种实施方式中，所述化合物是水溶性差的抗癌剂。关于这一点，我们还为大量 难溶于水的药物化合物开发了制备药物制剂的一般方法，期望所述药物制剂适 于静脉内(i.v.)和口服给药。

在本发明的内容中，水溶性较差的药物化合物包括但不必限于生物药剂学 分类系统(BCS)第2类或第4类药物的化合物。所述BCS为本领域技术人员熟知， 且基于容易获得的参考文献报道的药物水溶性，而就口服给药的药物而言其包 括人肠膜透性的相关性。(参见例如，Takagi等，(2006)Molecular Pharmaceutics 《分子药物学》,第3卷,第6号,第631-643页.)在一个实施方式中，溶解性可根 据下表所述的参数确定：

出于本发明目的，可作为本发明所述药剂提供的弱水溶性药剂是落入以下 类别的任何药物：如上表所述的极微溶和几乎不溶的化合物，尽管本发明所述 的配制方法可使落入难溶和微溶类别的药物在所配制溶液中的溶解性增加 10-100倍。这对疾病治疗中所用的具有低效能但高最大耐受剂量(MTD)的药物 例如伊立替康(MTD：100-200mg/kg)非常有利。

在本发明的一个方面，我们提供用于癌症治疗的制剂，所述制剂包含 10H-1,3-二氧戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]氮茚并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,12H)-二 酮,-乙基-7-羟基-,(S)-。该化合物在本文中称作“FL118”。其对应于NSC号 634274。或者，该组合物也可称为10,11-亚甲二氧基-20S-喜树碱。该化合物的 结构以及本发明中用于提供药物制剂的其它结构上不同的化合物示于图28。

在实现本发明的过程中，我们吃惊地发现我们能够使用多种标准下毒性过 高或无法合适配制用于临床相关应用的化合物制造药物制剂，所述多种标准传 统用于评估测试试剂在癌症治疗应用中的合适性。使用我们的新开发方法，我 们能提供所述化合物的制剂，从而可使用所述化合物制剂在临床相关动物模型 内引发意料之外且优良的抗癌作用。特别地，从本文所述的公开来看，技术人 员能认识到本发明的至少以下方面：1)FL118对人肿瘤异种移植动物模型具有 特别且令人吃惊的抗肿瘤活性(具有可控毒性)；2)FL118与癌症治疗所用的其它 化疗和化学预防剂的联合具有广泛潜力；3)本发明提供制造非水溶性药物(例 如，FL118)的制剂用于可注射或口服给药途径的制剂和方法；4)FL118的抗肿 瘤活性具有高度立体结构相关性，如下文进一步描述的具有不同立体结构的相 同化合物(FL113)显示弱得多的抗肿瘤活性；和5)FL118具有独特的作用机制 (MOA)。

根据其MOA，我们显示：a)FL118选择性抑制IAP(凋亡抑制剂)和Bcl-2家 族抗凋亡蛋白(包括生存素、XIAP、cIAP-2和Mcl-1)的表达；b)FL118诱导Bcl-2 家族促凋亡蛋白(Bax、Bim)的表达以及凋亡(胱冬酶活化和PARP切割)；和c) FL118选择性抑制Akt生存信号转导的组成型和紫杉醇诱导的活化，而其显示对 Erk1/2信号转导几乎无抑制作用。因此，我们首次显示FL118具有非同寻常且令 人吃惊的抗肿瘤活性，其能抑制并甚至根除癌症，其还可与其它化疗剂和化学 预防剂联用。FL118令人吃惊的抗肿瘤活性及可控毒性符合其独特的MOA，在 本公开中我们首次对其进行鉴定。

就本文描述的各药物制剂而言，除非另有说明，所有所述值包括所述范围 上端和下端的各值，且所有整数计至小数点第二位，且所有整数囊括其之间范 围。因此，例如，所述具有范围0.5-1mg/mL的药物浓度包括0.5mg/mL、0.6 mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL和1.0mg/mL。本文公开的各药物 制剂可包括针对其所述的成分，基本由其组成或由其组成。此外，制造和/或使 用所述制备物中涉及的溶剂和共溶剂的任何组分可包括在或可不包括在本发 明提供的药物制剂中。

在本发明的非限制性实施方式中，药物化合物(例如FL118)的药物制剂与其 它制剂组分联合提供。一般而言，除药物化合物以外，所述制剂包括第一溶剂 (本文中也称作溶剂A或Sol A)；第二溶剂(本文中也称作溶剂B或Sol B)；水溶液 以及可选的一种或多种辅助溶剂。可以调整这些组分中每一种的类型和量以适 用于以下因素如所需药物浓度、制备物的制造方法和指定的给药途径及制剂体 积。这些因素中的每一个将涉及以下考虑如指定的给药剂量方案、待处理个体 的性别、年龄和尺寸，以及待处理疾病的类型和阶段。

在具体的实施方式中，本发明的药物制剂包括药物、溶剂A、溶剂B和0-10% 辅助溶剂。溶剂A可以是形成带有所述药物的复合物的组合物。例如，可以使 用已知增加药物可溶性的各种环糊精(CD)中任意一种。在具体的非限制性实施 方式中，溶剂A可以是β环糊精(βCD)、羟基丙基-β-环糊精(HPβCD)或磺基丁基 醚-β-环糊精(SBEβCD)。溶剂B可以是极性非质子溶剂，例如二甲亚砜(DMSO)， 或者可以是醇，例如乙醇。所述辅助溶剂可以是二醇或双醇例如丙二醇(PG)， 或聚醚化合物例如聚乙二醇300或400(PEG300或PEG400)。还可包括辅助溶剂 的组合。

制造具有这些成分的示范性制剂的方法在下文中就选择制造所述制剂的 具体步骤和参数进行详细描述。一般而言，本发明提供用于制备包含弱水溶性 药物的组合物的三种方法(策略I、策略II和策略III)。

策略I：首先，配制主要溶剂溶液：通过室温下在试管中温和涡旋溶液5-15 分钟使溶剂A(βCD、HPβCD或SBEβCD)溶解于溶剂B(DMSO或乙醇)以形成主要 溶剂A/B混合溶液。选择哪一种溶剂A(βCD、HPβCD或SBEβCD)来配制所述主 要溶剂A/B混合物溶液取决于所述非水溶性化合物的化学性质。一般而言，如 果化合物具有酸性基团，则溶剂A可以是βCD或HPβCD，因为它们是中性或碱 性的；如果化合物具有一个或多个碱性基团，则溶剂A可以是SBEβCD，因为 SBEβCD具有酸性基团。选择哪一种溶剂B(即，DMSO或乙醇)取决于所述非水 溶性化合物在哪一种溶剂(DMSO或乙醇)中溶解较好。例如，测试显示，FL113 和FL118在乙醇中溶解不佳但在DMSO中溶解且具有低但合理浓度(约1 mg/mL)。所以选择DMSO作为FL113和FL118制剂的溶剂B。最终即用型制剂 溶液中的溶剂A(βCD,HPβCD或SBEβCD)(W/V)低至0.2%而高至5%，这取决于 所述化合物在该即用型配制溶液中的终浓度。因此，溶剂A(βCD、HPβCD或 SBEβCD)在溶剂B(DMSO或乙醇)中的百分比在2.5%-50%的范围内，这取决于我 们需要配制的化合物量。2)制备辅助溶剂溶液。一般而言，通过在25-37°C于 涡旋装置上温和涡旋多至过夜使水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)与辅 助溶剂(PG、PEG300或PEG400)混合。这些辅助溶剂溶液包括但不限于：配方 1使盐水(蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水)混合0%PG(辅助溶剂1,Hsol-1)、1% PG(Hsol-2)、2%PG(Hsol-3)、3%PG(Hsol-4)、4%PG(Hsol-5)、5%PG(Hsol-6)、 6%PG(Hsol-7)、7%PG(Hsol-8)、8%PG(Hsol-辅助溶剂9)、9%PG(Hsol-10)和 10%PG(Hsol-11)；配方2使盐水(蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水)混合1%PEG 400(或PEG300)(Hsol-1)、2%PEG400(或PEG300)(Hsol-2)、3%PEG400(或PEG 300)(Hsol-3)、4%PEG400(或PEG300)(Hsol-4)、5%PEG400(或PEG 300)(Hsol-5)、6%PEG400(或PEG300)(Hsol-6)、7%PEG400(或PEG 300)(Hsol-7)、8%PEG400(或PEG300)(Hsol-8)、9%PEG400(或PEG300)(Hsol-9) 和10%PEG400(或PEG300)(Hsol-10)；和配方3使盐水(蒸馏水或磷酸盐缓冲盐 水)混合1%PG/9%PEG400(Hsol-1)、2%PG/8%PEG400(Hsol-2)、3%PG/7% PEG400(Hsol-3)、4%PG/6%PEG400(Hsol-4)、5%PG/5%PEG400(Hsol-5)、 6%PG/4%PEG400(Hsol-6)、7%PG/3%PEG400(Hsol-7)、8%PG/2%PEG400 (Hsol-8)、9%PG/1%PEG400(Hsol-9)。注，可以制备较高百分比的辅助溶剂 (PG、PEG300或PEG400)，但这些辅助溶剂在即用型配制溶液中百分比越高， 所述配制溶液的潜在毒性越高。3)使用主要溶剂溶液和辅助溶剂溶液配制非水 溶性化合物。通过涡旋5-15分钟使非水溶性化合物溶于主要溶剂溶液中(所述化 合物可以完全溶解或可以不完全溶解)。然后用辅助溶剂溶液稀释所述溶于主要 溶剂溶液中的药物，这是通过在涡旋装置上的容器中室温温和涡旋所述混合物 10-20分钟完成。用FL118作为例子，为了制备终浓度为0.5mg/mL的FL118，我 们可通过涡旋5分钟使1mg FL118(例如，可以是任何量的FL118，只要保持相同 比例即可)溶于0.1mL含≥5%HPβCD(βCD或SBEβCD)主要溶液的DMSO中。然 后，通过在涡旋装置上室温温和涡旋试管10-20分钟进一步使所得 FL118/HPβCD/DMSO混合物在1.9mL(20×稀释)采用上述三种配方的基于水的 辅助溶剂溶液之一中稀释。具体地，如果所得FL118/HPβCD/DMSO混合物在1.9 mL配方1的辅助溶剂1中进一步稀释达到2mL的总体积，则最终即用型FL118 制剂溶液为FL1180.5mg/mL、HPβCD≥0.25%、DMSO约5%和PG0%；如果所 得FL118/HPβCD/DMSO混合物在1.9mL配方1的辅助溶剂11中进一步稀释达到 2mL的总体积，则最终即用型FL118制剂溶液为FL1180.5mg/mL、HPβCD ≥0.25%、DMSO约5%和PG9.5%。类似地，在该情况中，如果所得 FL118/HPβCD/DMSO混合物在1.9mL配方3的辅助溶剂1中进一步稀释达到2 mL的总体积，则最终即用型FL118制剂溶液为FL1180.5mg/mL、HPβCD ≥0.25%、DMSO约5%、PG0.95%和PEG4008.55%；如果所得 FL118/HPβCD/DMSO混合物在1.9mL配方3的辅助溶剂9中进一步稀释达到2 mL的总体积，则最终即用型FL118制剂溶液为FL1180.5mg/mL、HPβCD ≥0.25%、DMSO约5%、PG8.55%和PEG4000.95%。通过使用主要溶剂溶液和 辅助溶剂溶液实施上述配制方法，我们能够成功配制具有图28所示不同化学结 构的大范围药物浓度的单独非水溶性化合物。再次用FL118作为例子，如果希 望FL118的终浓度为0.25mg/mL，我们可通过涡旋3-10分钟使1mg FL118(再次 作为例子，但FL118可以是任何量,只要保持相同比例即可)溶于0.2mL≥2.5% HPβCD(CD或SBEβCD)的DMSO溶液。然后使所得FL118/HPβCD/DMSO混合物 在3.8mL(20×稀释)上述3种辅助溶剂溶液之一中进一步稀释达到4mL的终体 积(FL1180.25mg/mL、HPβCD≥0.125%、DMSO5%、基于水的辅助共溶剂约 95%)。如果希望采用该配制方法的可注射溶液的FL118浓度较高，例如最终可 注射溶液为1mg/mL，则可通过涡旋5-15分钟使2mg FL118溶于0.1ml ≥20%HPβCD(CD或SBEβCD)的DMSO溶液。然后使所得FL118/HPβCD/DMSO 混合物在1.9mL(20×稀释)上述3种辅助溶剂溶液之一中进一步稀释达到2mL 的终体积(FL1181mg/mL、HPβCD≥0.5%、DMSO约5%、基于水的辅助共溶 剂约95%)。所以，可以使用策略I来配制具有临床前动物模型研究或临床实验 以及患者治疗中所需浓度的用于i.v.注射的化合物(其本质上适于i.p.和p.o.途 径)。配制在最终即用型溶液中具有大范围不同浓度的药物的能力是重要的，因 为在临床前动物模型或临床实验中评估药物需要从低剂量增加至高剂量的剂 量，同时保持最优和一致的体积大小——体积过小可能产生较大系统误差和药 物给予的技术困难，而体积过大可能无法实际注射全部所述溶液以达到所需药 物剂量。此外，不同给药途径(i.v.、i.p.或p.o.)可适于不同体积。

策略II：在该方法中，在非水溶性化合物溶于所述主要溶剂A(βCD、HPβCD 或SBEβCD)/溶剂B(DMSO或乙醇)混合物之后，向所述化合物/溶剂A/溶剂B混合 物添加一种或两种辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)，通过在25-37°C于涡旋 装置上温和涡旋试管中的该溶液至多过夜。然后使用水状液(蒸馏水、盐水或磷 酸盐缓冲盐水)稀释所得药物溶液至所需浓度，与此同时，用水状液稀释药物之 后，最终即用型药物制剂溶液中辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)的百分比保 持在总共1%-10%的范围内。以FL118为例，如果用2%PG配制终浓度为0.25 mg/mL的FL118，则通过涡旋5-15分钟使1mg FL118(一个例子，但可以是任何 量，只要使用相同比例即可)溶于0.2mL≥2.5%HPβCD(βCD或SBEβCD)的 DMSO溶液。然后向所得FL118/HPβCD/DMSO混合物中添加0.08mL PG，在 25-37°C于涡旋装置上的试管中温和涡旋该溶液至多过夜以混合所述溶液。所得 药物溶液用3.72mL水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)进一步稀释，通过 在25-37°C温和涡旋涡旋装置上的试管至多过夜以达到4mL的终体积(FL118 0.25mg/mL、HPβCD≥0.125%、DMSO约5%、PG2%)。如果使用该方法配制 较高浓度的FL118可注射溶液，例如用2%PG和2%PEG400配制最终1mg/mL 的可注射溶液，通过涡旋5-15分钟使2mg FL118(再次作为例子，但可提供任何 量的该药物，只要使用相同比例即可)溶于0.1mL≥10%HPβCD(CD或SBEβCD) 的DMSO溶液。然后向所得FL118/HPβCD/DMSO混合物添加0.04mL PG和0.04 mL PEG400，通过在25-37°C于涡旋装置上涡旋试管内的溶液至多过夜来混合。 所得药物溶液用1.72mL水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)进一步稀释， 通过在25-37°C温和涡旋装置上的试管至多过夜以达到2mL的终体积(FL1181 mg/mL、HPβCD≥0.5%、DMSO约5%、PG2%、PEG4002%)。通过使用该方 法，我们能够配制用于i.v.给予(也适于i.p.和p.o.)的所需药物制剂溶液。

策略III：该方法中，在溶剂A(βCD、HPβCD或SBEβCD)溶于溶剂B(DMSO 或乙醇)之后，使所得溶剂A/B混合物与一种或两种辅助溶剂(PG、PEG300或 PEG400)进一步混合以配制主要主溶剂混合物。然后，通过在25-37°C于涡旋装 置上温和涡旋试管中的溶液至少过夜使非水溶性化合物溶于该主要主溶剂混 合物。使所述非水溶性化合物溶于所述主要主溶剂混合物中，然后在水状液(蒸 馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)中稀释以达到所需药物浓度，稀释是通过在 25-37°C于涡旋装置上温和涡旋试管中的溶液至多过夜完成。如上文策略II所 述，在用水状液稀释所述主要主溶剂溶液之后，辅助溶剂(PG、PEG300或PEG 400)在最终即用型药物制剂溶液中的百分比保持在总共1%-10%范围内。使用策 略II中就FL118制剂所述的相同例子来说明，如果待用2%PG配制终浓度为0.25 mg/mL的FL118，首先在0.2mL≥2.5%HPβCD(CD或SBEβCD)的DMSO溶液中 混合0.08mL PG，混合是通过在25-37°C于实验室涡旋装置上温和涡旋合适尺寸 试管(例如0.5mL试管)中的所述溶液至多过夜完成。然后通过在25-37°C于涡旋 装置上温和涡旋试管中的溶液最少16小时使1mg FL118溶解于所得主要主溶剂 (HPβCD/DMSO/PG)中。所得FL118溶液用3.72mL水状液(蒸馏水、盐水或磷酸 盐缓冲盐水)进一步稀释，通过在25-37°C于涡旋装置上温和涡旋大试管内的溶 液至多过夜以达到4mL的终体积(FL1180.25mg/mL、HPβCD≥0.125%、DMSO 约5%、PG2%)。类似地，如果希望采用该方法配制高浓度FL118作为可注射溶 液应用，例如用2%PG和2%PEG400配制1mg/mL最终可注射溶液，则首先在 0.1ml≥10%HPβCD(CD或BEβCD)的DMSO溶液中混合0.04mL PG和0.04mL  PEG400，混合是通过在25-37°C于涡旋装置上温和涡旋试管中的溶液最少16小 时完成。然后通过在25-37°C于涡旋装置上温和涡旋试管中的溶液至多过夜使2 mg FL118溶解于所得主要主溶剂(HPβCD/DMSO/PG/PEG400)中。所得FL118 溶液用1.82mL水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)进一步稀释，通过在 25-37°C于涡旋装置上温和涡旋试管中的溶液至多过夜以达到2mL的终体积 (FL1181mg/mL、HPβCD≥0.5%、DMSO约5%、PG2%、PEG4002%)。通过 使用该方法，我们也能够制备用于i.v.给予(也适于i.p.和p.o.)的所需药物制剂溶 液。我们发现，就较弱非水溶性化合物而言，策略II和策略III能更有效地使所 述非水溶性化合物以可接受的浓度溶解，且具有就i.v.给予而言更好的溶液稳定 性。此外，用上述三种方法配制非水溶性化合物时，优选最终即用型药物制剂 溶液中DMSO或乙醇的百分比保持在5%-10%的范围内。这可以通过联用溶剂 B(DMSO或乙醇)中不同百分比的溶剂A与合适的稀释以配制最终即用型药物制 剂溶液来实现。或者，这可以通过在用水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水) 稀释所述主要主混合物之前向所述主要主混合物添加额外的溶剂B(DMSO或乙 醇)来实现。当然，应从所述用于药物稀释的水状液体积中减去添加至所述主要 主混合物的额外溶剂A(DMSO或乙醇)含量。还优选溶剂A的摩尔浓度与最终即 用型配制溶液中化合物的摩尔浓度之比应为1.1-10(溶剂A的摩尔浓度):1(化合 物摩尔浓度)，这取决于所述化合物分子量、形状以及其它化学性质。一般而言， 非线性结构的大分子量非水溶性化合物需要较高溶剂A:化合物比例(即，需要更 多溶剂A)。就具体非水溶性化合物而言，考虑到本公开的益处，这需要通过对 本领域技术员常规的测试来确定。一般而言，优选使用低含量的辅助溶剂，只 要能有效用于i.v.注射的非水溶性化合物可以充分稳定状态溶解即可。用于非水 溶性化合物制剂的上述三种配制策略的比较总结于表5。

表5用于配制就i.v.注射而言非水溶性化合物的三种配制策略的比较

总之，一般而言，如果所述制剂在上述三种配制策略的任何一种中包含辅 助溶剂(PG、PEG300或PEG400)，则所配制溶液的药物溶液稳定性增加。然而， 配制的即用型药物溶液中辅助溶剂越多，所配制即用型溶液的潜在毒性越高。 因此，在上述配制策略的实施过程中，优选测试不含辅助溶剂(PG、PEG300 或PEG400)时的稳定性。此外，含所述药物或候选药物的即用型溶液无需是真 溶液，只要所配制的溶液在振荡后于适当时段中显示无沉淀，所配制的溶液即 合适用于i.v.注射。

如果需要额外的稳定性，可以采用添加辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)， 特别是通过策略II和策略III中所述的方法添加PG、PEG300或PEG400能就非水 溶性药物尤其是难于溶解的药物获得更好的溶解性。以FL118为例，最终配制 的FL118i.v.注射溶液中[FL118、溶剂A(HPβCD)、溶剂B(DMSO)和水状液(蒸 馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)]缺乏辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)使所配 制的FL118溶液稳定性减少，然而，所配制不含辅助溶剂(PG、PEG300或PEG 400)的即用型FL118溶液仍适于i.v.注射。重要的是，该FL118制剂不减少FL118 的抗肿瘤活性，同时保持其无毒性质。换言之，如果采用策略I、II和III配制的 非水溶性药物或候选药物在不含辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)的最终即用 型溶液中保持就用i.v.注射方式给药而言适当的稳定性，则可排除使用所述辅助 溶剂(PG、PEG300或PEG400)。

应强调，上文所述的药物制剂不必包含完全溶解的药物，只要该非水溶性 药物不处于固态即可。相反，各化合物分子溶解于最终溶剂混合物中。以上文 所述三种策略配制的非水溶性化合物混合物可以是有或没有淡色的半透明或 不透明的清澈状态。我们发现，大多数情况中，所配制的非水溶性药物或候选 药物在通过涡旋温和重悬之后是有色或无色牛乳状或清浊溶液。上述三种策略 配制的非水溶性化合物溶液适合于临床实践以通过i.v.、i.p.或口服单一给予或 联合其它治疗药物(例如顺铂、依托泊苷、紫杉醇或阿霉素)给予来治疗患病的 患者或动物。通过所述三种不同策略(策略I、策略II和策略III)配制的FL118溶液 的比较总结于表6。0.025mg/mL、0.5mg/mL或0.75mg/mL浓度的FL118(表6) 适于i.v.给药以达到从1mg/kg增加到7.5mg/kg的剂量，且具有适当体积大小以 i.v.给予本发明所用的小鼠模型系统。我们发现，在该FL118制剂的情况中，尽 管配制的FL118溶液在一种或两种辅助溶剂(PG和/或PEG400)存在下更加稳 定，显示加或不加一种或两种辅助溶剂(PG和/或PEG400)之间的FL118抗肿瘤 活性没有明显差异。然而，i.p.注射所述制剂溶液(安慰剂、载剂或不含FL118 的对照溶液)以测试所述制剂溶液毒性显示，如果需要较大体积，则含有一种或 两种辅助溶剂(PG和/或PEG400)的制剂溶液趋于有毒，这取决于所述辅助溶剂 的百分比。

表6i.v.注射所用FL118制剂的制剂配方的比较实例

就应用而言，可使所述组合物在水溶液(在本文中也称作水状液)中稀释。 在不同的实施方式中，所述水状液可以是蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水。在 优选的实施方式中，所述最终即用型制剂溶液中，水状液的百分比在至少85%- 至多95%间变化；DMSO或乙醇的百分比在至少1%-最多10%之间变化； CD(βCD、HPβCD或SBEβCD)的百分比在至少0.125%-至多5%之间变化；PG、 PEG300或PEG的总百分比在至少0%-至多10%之间变化。

本文所述的所有药物组合物可与其它治疗(例如其它抗癌剂、化疗、饮食改 变和外科手术)联用。

一般而言，当FL118是本发明所提供药物制剂中的药物化合物时，优选 FL118的有效、最终和即用型浓度为0.25-5mg/mL。在某些实施方式中，FL118 在含有0.5-1.0mg/mL FL118、95%水溶液、0.25-0.5%环糊精和5%极性非质子溶 剂(DMSO)的药物制剂中提供，其适于使用人肿瘤小鼠模型的临床前体内测试。 在一个实施方式中，本发明的药物制剂包括0.5-1mg/mL FL118、95%盐水、 0.25-0.5%HPβCD和5%DMSO。

在不同的实施方式中，本发明的药物制剂可以多种任何已知的药物容器提 供，例如螺旋加盖的无菌小瓶、安瓿、已预装注射器等。制剂可以用于口服、 i.v.或i.p.给予的即用型液体制剂提供，或以主溶剂(CD溶于DMSO或乙醇的一种 类型)内浓缩溶液形式提供，所述浓缩溶液适于在给药前用含有0-10%一种或两 种辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)的水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水) 稀释至所需浓度。就所述药物的口服给药而言，所述浓缩的药物溶液可以采用 片剂或囊片或胶囊形式。此外，我们还测定使用本发明制备的制剂在冷藏过程 中显示高药物功效稳定性。因此，在不同实施方式中，本发明提供本发明的药 物制剂储存于冷温度下，例如从1℃到小于8℃。无菌条件下制剂溶液中的组合 物可在冷藏温度保存至多1年。

可将本发明的药物制剂给予需要治疗一种或多种病症的任何人或非人动 物，所述药物制剂旨在提供预防或治疗益处。期望本发明有利于治疗广泛癌症 类型中的任何一种。因此，所述个体可被诊断或怀疑患有任何多种癌症，所述 癌症的非限制性例子包括实体瘤和血癌(白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)。癌症的具 体例子包括但不限于：纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤， 脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，腹膜假粘液瘤，淋巴管内皮肉瘤， 滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳 腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状上皮细胞癌，基底细胞癌，腺癌，头颈癌，汗 腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细 胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎性癌，肾母细胞瘤，子宫 颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细 胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听 神经瘤，少突胶质瘤，脑脊膜瘤，黑素瘤，成神经细胞瘤，视网膜成神经细胞 瘤，白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤和胸腺瘤。

图28所列的使用本文所述配制方法(策略I、策略II和策略III)配制的化合物 中，FL118是抗肿瘤化合物，其不同制剂(表6)已在有或没有人肿瘤的临床前小 鼠模型中就药物毒性测试(小鼠体重减轻)和评价药物抗肿瘤活性(肿瘤生长抑 制性、肿瘤消退和肿瘤根除)有大量研究。根据临床前小鼠模型，一般而言，通 过三种配制方法(策略I、策略II和策略III，表6)配制的FL118的口服给予达到的 MTD剂量可高于通过i.v.和i.p.途径达到的MTD剂量。通常，口服给予FL118达 到的MTD比通过i.v.或i.p.给予FL118达到的MTD高25%-35%，而i.v.和i.p.可达到 的MTD非常相近。

按照合适的FL118给予方案，例如从实施例8中提供的数据，可见通过策略 I、II和III配制的FL118(表6)在小鼠模型中的最大耐受剂量(MTD)是每天一次×5 方案(d×5)中的约1.5mg/kg、隔天一次×5方案(q2×5)中的约1.5mg/kg，以及每 周一次×4方案(wk×4)中的5mg/kg。不希望受任何具体理论的限制，基于我们 对FL118的研究，无需且不推荐一天给予FL118多于一次，因为其不显著增加药 物抗肿瘤活性但显著增加药物毒性。另一方面，每周多于一次显示进一步增加 FL118MTD。

根据FL118用于癌症治疗的临床应用，除三种基本方案(d×5、q2×5和wk ×4)以外，可使用基于所述三种确定基础方案(d×5、q2×5和wk×4)的其它修 改方案。这些包括但不必限于1)d×5，隔周给予三周FL118作为一个周期，然 后间隔约一个月，根据结果的持续改善进行第二个后续周期。可至多进行三个 周期；2)间隔一周实行q2×5三次作为一个周期；然后间隔约一个月；如果所述 处理产生良好结果，可进行另一个周期。可至多实施三个周期；3)每三天一次 FL118给予，共5次(q3×5)，就三次而言间隔一周到10天，作为一个周期，周期 之间大约间隔一个月；如果该处理显示良好结果，则可实施另一个周期。可至 多实施三个周期；和4)三次周×4，每次周×4之间间隔约一个月，作为一个周 期，可实施2-3个周期，这取决于有利结果。此外，上述四种方案可在周期中联 用以达到最佳抗肿瘤结果同时对癌症患者毒性最低。

就FL118的有效剂量而言，其按本文所述合适配制时是非常有效的抗癌药 物。尽管不同方案具有不同MTD，小鼠模型中不同方案内FL118的MTD都低于 10mg/kg。在每日一次方案中，FL118的MTD约为1.5mg/kg。每天一次方案的 FL118的次MTD(例如1.25mg/kg、1.0mg/kg或0.75mg/kg)仍显示良好抗肿瘤活 性。但是，小鼠模型中根除的人肿瘤百分比减少。这与图6、7、8、10、14和 15中用周×4方案所示数据中的情况非常相似。就这些实验而言，FL118制剂溶 液使用初始制剂(0.05mg/mL，吐温(Tween80)20%，DMSO5%，盐水75%)生 成，且通过i.p.途径给予。然而，重要的是应注意，以初始FL118制剂溶液(0.05 mg/mL，吐温8020%，DMSO5%，盐水75%)用d×5和q2×3或q2×5方案的FL118 无法达到有意义的抗肿瘤活性，因为这些方案中FL118的MTD过低(d×5，约0.2 mg/kg；q2×3或q2×5，约0.5mg/kg)。相反，通过我们新型配制方法(策略I、 策略II和策略III，表6)配制的FL118，d×5和q2×5方案中FL118的MTD从初始 制剂(0.05mg/mL，吐温8020%，DMSO5%，盐水75%)中的0.2-0.5mg/kg变化 至1.5-2.5mg/kg，这显示强抗肿瘤活性，甚至根除肿瘤而无复发(图30-32)。如 本文所示数据测定，就每天一次方案或更长方案而言，显示抗肿瘤活性的FL118 最小剂量应不少于0.5mg/kg。

表7显示不同参数/规模中FL118MTD剂量的比较关系。

表7.小鼠模型*中1.5mg/kg(MTD)的FL118每日一次×5方案的例子。

对象 体重(kg) 体表面积(sq.m) 剂量kg./天(mg) 剂量/sq.m/天(mg) 小鼠 0.018 0.0075 1.5 3.6 婴儿 8 0.4 0.15 3.1 年长幼儿 20 0.8 0.12 3.1 成人 70 1.85 0.07 2.7

*修改自Donald Pinkel：Cancer Research18:853-856,1958.

以下实施例意在说明而非限制本发明。

实施例1

化合物库和药物发现

药物发现所用的化合物库：本发明中所用的小分子量化合物文库来自多个 来源，包括合作的化合物、自开发化合物、专有化合物和由NCI治疗发展部(DTP) 收集的化合物。

药物发现的加工：最初使用美国专利号7,569,221所述的遗传改性癌细胞模 型筛选了多于4000种结构上多样性的小化学分子化合物。该筛选产生约250种 显示以药物浓度1μM(该浓度下24小时内无显著细胞死亡)的化合物处理24小时 内有效下调荧光素酶活性的命中候选化合物。使用一系列不同浓度(0.001 nM-1000nM)对所述250种命中候选化合物连续进行额外两轮筛选，产生排名前 20的命中化合物，所述化合物在24小时化合物处理内显示100nM-1nM浓度范 围的荧光素酶活性抑制。我们还分析了207种与所述20种命中化合物化学结构 类似的化合物。FL118是这207种类似物中得分最高的化合物，且显示独特MOA 和不寻常的抗肿瘤活性。

所述化合物FL118是10H-1,3-二氧戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]氮茚并 [1,2-b]喹啉-8,11(7H,12H)-二酮,7-乙基-7-羟基-,(S)-(化学定义)，其相应NSC编 号是NSC634724。

实施例2

材料和方法

动物:6-12周龄雌性无胸腺裸小鼠(裸/裸，体重20-25g)购自马萨诸塞州威尔 明顿的查尔斯河实验室国际公司(Charles River Laboratories International,Inc.) 或印第安纳州印第安纳波利斯的HSD公司(Harlan Sprague Dawley Inc.)。6-12周 龄雌性SCID小鼠购自罗斯维尔动物研究室(DLAR)。用可自由采食的水和食物 以5只小鼠/笼饲养小鼠。所有动物实验按我们IACUC批准的动物协议进行。

药物和对照溶液(载剂)：首先使FL118以1mg/mL浓度溶于DMSO，并在新鲜吐 温-80/盐水溶液中进一步稀释。最终工作溶液由FL118(0.05mg/mL)、75%盐水(V/V)、 20%吐温-80(V/V)和5%DMSO(V/V)组成。对照溶液(安慰剂或载剂)是不含FL118的 75%盐水、20%吐温-80和5%DMSO。本发明中用于比较的其它FDA批准的抗癌药 物使用来自相应产品的临床制剂。

肿瘤：通过注射s.c1×10⁶培养的癌细胞初始建立人肿瘤异种移植物。然后将所 述异种移植物传代数代，传代由通过套管针从所述传代肿瘤移植40-50mg非坏死肿瘤 组织进行。人原发肿瘤最初获自罗斯维尔公园癌症研究所(Roswell Park Cancer  Institute)的癌症患者并在SCID小鼠内建立。本研究中使用的人肿瘤异种移植物包括人 头颈鳞状细胞癌FaDu、人原发头颈肿瘤17073、人回盲肠腺癌HCT-8、人结肠癌SW620 和人原发结肠癌11124和14528。在肿瘤移植后7天肿瘤达到200-250mg时开始处理， 将此时的处理指定为第0天。测试用于建立肿瘤的所有癌细胞是否无支原体感染。可 移植的肿瘤具有与培养细胞相近的组织学概况。

药物给药剂量和方案：所有药物通过腹膜内注射(i.p.)或经口服(p.o.)以不同剂 量(0.2-2mg/kg)给予。使用以下方案：1)i.p.每天×2：每天一次连续2天；2)i.p.每 天×3：每天一次连续3天；3)每天×5：每天一次连续5天(i.p.或p.o.)；4)i.p.×3(第 0、2、4天)：第0、2和4天，共三次；5)i.p.2天/周×3/4：一周两次，连续3或4周； 6)每周×4：每周一次，连续4周(i.p.或p.o.)；7)i.p.双周×4：每两周一次，持续 8周；8)2天/周×4：一周给两次，共4周；以及9)i.p.×1：在第0天一次药物i.p.注 射。

肿瘤测量：用Vernier卡尺测量肿瘤的两轴(L，最长轴；W，最短轴)(mm)。 肿瘤重量(mg)使用公式“肿瘤重量＝1/2(L×W²)”估计。初始两周和/或FL118 处理段中每天(除周末)进行肿瘤测量，然后在治疗后两周每周测量三次，之后 每周测量两次。

最大耐受剂量(MTD)和毒性评价：MTD定义为引起无药物相关致死率的小鼠 内体重减轻≤20%原始体重，具有可恢复毒性的最高药物剂量。处理后或在药物 处理过程中(若处理超过两周)的最初两周每天测定药物诱导的毒性(例如体重减轻、 腹泻及致死)动力学，之后隔天评价药物毒性。

抗肿瘤活性：抗肿瘤活性通过最大肿瘤生长抑制(MTGI)评估，所述最大肿 瘤生长抑制是同一时期处理组(MTWTG)和未处理对照组(MTWCG)之间的平均 肿瘤重量差异。计算公式是“MTGI＝(MTWTG–MTWCG)÷MTWCG×100%”。肿 瘤成倍时间(TDT)定义为肿瘤从所述处理开始时(第0天)至达到其初始重量两倍时的 平均时间。肿瘤应答表示为：1)肿瘤重量在第0天减少至少50%初始肿瘤大小时 的部分肿瘤应答(PR)，和2)完全肿瘤应答(CR)，其定义为通过在初始肿瘤移植 位点颤动无法检测肿瘤。所述治愈定义为动物达到CR并在最后一次药物给予之后 保持无肿瘤至少30天。

FL118在人肿瘤异种移植物动物模型中显示非同寻常和令人吃惊的抗肿瘤 活性且具有可控毒性。

FL118的抗肿瘤活性高于当前FDA批准的用于临床癌症治疗的治疗药物： 为研究FL118的潜在抗癌功效，我们比较FL118和那些FDA批准的治疗药物的抗 肿瘤活性，所述FDA批准的治疗药物包括伊立替康和拓扑替康(拓扑异构酶I抑 制剂)、顺铂和奥沙利铂(DNA铂酸盐剂)、多西他赛(微管聚合促进剂)、吉西他 滨和5-FU(DNA合成抑制剂)、阿霉素(拓扑异构酶II抑制剂)和癌得星(环磷酰 胺，烷基属剂)。所得结果指示，所有测试化合物中，FL118显示令人吃惊的抗 肿瘤活性，其就头颈癌和结肠癌的MTD(图1)而言显著高于所有测试的治疗药 物。

FL118而非伊立替康有效根除人原发头颈异种移植肿瘤：根据图1所示的数 据，伊立替康是针对所述实验肿瘤的第二最有效化合物。FL118和伊立替康在 结构上都与喜树碱化合物家族相关联，且属于喜树碱类似物。因此，我们还采 用伊立替康的临床相关方案(每周一次×4)比较了FL118和伊立替康(以它们的 MTD)在人原发头颈肿瘤异种移植SCID小鼠模型中的抗肿瘤活性。所得结果显 示，伊立替康处理组中5只小鼠中的2只(40%)显示对伊立替康处理完全响应。 然而，无肿瘤阶段很短且伴随快速复发。相反，在FL118处理组中，5只小鼠中 的5只(100%)显示对FL118处理的完全响应，且在我们实验阶段中所有5只小鼠 内未检测到复发的肿瘤(图2D和2E)。重要的是，伊立替康导致累积的体重减轻 (反映对正常组织的长期毒性)，而FL118仅导致暂时体重减轻且在处理后快速恢 复(图2B)。

FL118有效根除动物模型内的大型且晚期人肿瘤异种移植物：一般而言， 大型且晚期肿瘤对化疗响应不佳。相反，经IACUC(实验动物照料和使用委员会 (Institutional Animal Care and Use Committee))允许的携带最大人异种移植肿瘤 的小鼠对FaDu头颈肿瘤和SW620结肠肿瘤的FL118处理显示非同寻常且令人吃 惊的响应，所述肿瘤在许多情况中甚至可被治愈(图3)。

FL118功能稳定且显示令人吃惊的长保存期。以一种制剂(含0.05mg/mL的 75%盐水+20%吐温80+5%DMSO)为例，为测试FL118在最终注射溶液中的功 能功效稳定性，制备即用型FL118注射溶液(0.05mg/mL FL118、75%盐水、20% 吐温80、5%DMSO)并在+4°C冰箱中放置多于6个月。然后使用该溶液对人肿瘤 小鼠模型进行肿瘤治疗。如图4所示，实验条件下所用的FL118显示与新鲜配制 的FL118注射溶液一样有效，数据如图3所示。

总之，图1-4中显示的数据证明本发明的FL118化合物具有非同寻常且令人 吃惊的抗肿瘤活性。

实施例3

FL118不同给药剂量、途径和方案的功效和毒性

FL118对于采用不同药物剂量、方案和途径处理的动物的毒性：我们发现， FL118的毒性可以通过不同方案来控制，且证明以给定FL118制剂(0.05mg/mL FL118，75%盐水，20%吐温80，5%DMSO)间隔给予FL118(例如每周或每两 周(但非每天)方案)显著减少了FL118对动物的毒性。FL118的间隔施加可降低 FL118对动物的毒性，同时，该方法增加其对抑制肿瘤生长和根除肿瘤量以治 愈的功效(图1-4)。表1总结采用不同剂量和不同方案通过i.p.和p.o.途径给予的 FL118在裸小鼠中的毒性概况。图5中的图表显示i.p.途径中不同剂量和方案的 FL118的毒性概况。FL118通过i.p.和p.o.途径的最大耐受剂量(MTD)示于表2。

表1：FL-118在裸小鼠中引起的毒性

药物 剂量(mg/kg) 方案 小鼠编号¹体重减轻 致死率 FL-118 0.75 i.p.每天×2 5 13.7±11.0 20 FL-118 0.50 i.p.每天×3 5 30.7±4.2 100 FL-118 0.75 i.p.每天×3 5 31.4±2.3 100 FL-118 0.20 i.p.每天×5 10 13.0±3.7 0 FL-118 0.30 i.p.每天×5 5 29.0±5.6 80 FL-118 0.40 i.p.每天×5 5 35.1±4.2 100 FL-118 0.50 i.p.×3(第0、2、4天) 15 8.7±4.9 0 FL-118 0.60 i.p.×3(第0、2、4天) 5 27.6±13.4 80 FL-118 0.75 i.p.×3(第0、2、4天) 5 30.3±8.2 80 FL-118 0.75 i.p.2天/周×3 5 27.9±7.6 60 FL-118 0.50 i.p.2天/周×3 5 13.3±4.3 0 FL-118 0.50 i.p.每周×4 5 9.8±5.7 0 FL-118 0.75 i.p.每周×4 10 9.1±3.8 0 FL-118 1.00 i.p.每周×4 15 12.2±4.8 0 FL-118 1.25 i.p.每周×4 10 12.1±6.8 0 FL-118 1.50 i.p.每周×4 15 15.1±3.7 0 FL-118 1.75 i.p.每周×4 5 29.0±6.7 80 FL-118 0.75 p.o.每天×5 5 30.5±7.5 80 FL-118 2.00 p.o.每周×4 5 10.6±5.8 0

¹各实验组使用5只小鼠。

表2：FL-118的最大耐受剂量(MTD)

方案 途径 小鼠 MTD(mg/kg/剂量) 每天×5(5剂量) i.p. 裸&SCID 0.2 每天×3(3剂量) i.p. 裸 <0.5 第0、2和4天(3剂量) i.p. 裸 0.5 2天/周×4(8剂量) i.p. 裸 0.5 每周×4(4剂量) i.p. 裸&SCID 1.5 每天×5(5剂量) p.o. SCID 0.6 每周×4(4剂量) p.o. 裸 ≥2.0

人头颈癌动物模型的结果：FL118就治疗人头颈癌而言显示非同寻常且令 人吃惊的功效。例如，采用每周×4通过i.p.给药的方案，FL118以0.75mg/kg(半 MTD)治愈了40%(5只小鼠中的两只)FaDu头颈癌细胞系建立的肿瘤(图6)；采用 每周×4通过i.p.注射的相同方案，FL118以1mg/kg的剂量(低于MTD的剂量)治 愈了60%(10只小鼠中的6只)的FaDu肿瘤(图7B)，以及，采用每周×4通过i.p.注 射的相同方案，FL118以1.25mg/kg的剂量(接近但仍低于MTD的剂量)治愈了 70%(10只小鼠中的7只)的FaDu肿瘤(图8B)。使用FL118以1.5mg/kg的剂量采用 每周×4的方案处理无胸腺裸小鼠模型上的FaDu源性头颈肿瘤显示，5只小鼠中 的4只得到治愈无复发，而一只显示暂时治愈有复发(图9)。表3总结了这些实验。

表3：FL-118在携带人FaDu头颈肿瘤异种移植物的裸小鼠内的抗肿瘤活性

MTRI：最大肿瘤生长抑制；TDT：肿瘤成倍时间；PR：部分肿瘤响应；CR： 完全肿瘤响应。在肿瘤移植后7天，肿瘤重量达到约200mg(尺寸以mm³计)时开始处 理。向对照小鼠给予载剂溶液(75%盐水，20%吐温-80和5%DMSO)。各实验组使 用五只小鼠。

人结肠癌动物模型的结果：FL118还显示对人结肠癌的显著功效。表4总结 了FL118不同剂量处理携带人HCT-8和SW620结肠肿瘤异种移植物的裸小鼠所 得的结果。

表4：FL-118在携带人HCT-8和SW620结肠肿瘤异种移植物的裸小鼠中的抗肿瘤活性

我们还测定了FL118在SCID小鼠中对两种人结肠原发肿瘤的抗肿瘤活性。 比较1mg/kg的FL118和MTD的伊立替康采用就伊立替康而言每周×4最佳方案 的抗肿瘤活性和毒性，所得结果示于图10，其显示FL118优于伊立替康。

FL118和伊立替康在人肺癌动物模型中的抗肿瘤活性和毒性：用FL118和伊 立替康采用每周×4通过i.p.给予的方案以其MTD处理A549肺癌细胞系建立的 肿瘤。如图所示，FL118的抗肿瘤活性显著高于伊立替康(图11)，而其毒性相当。

FL118的口服给予(p.o.)显示显著抗肿瘤活性：为开发新抗癌药物如FL118， 药物的口服给予提供具有吸引力的益处。这是因为p.o.途径相比i.v.途径对癌症 患者而言更加方便，可实现通过缩短住院时间大幅节省医疗费用，前提是实现 相当的抗肿瘤活性和毒性。因此，我们测定了用临床上有利p.o.途径的FL118的 抗肿瘤功效和毒性。使用人癌细胞系源性和原发头颈和结肠癌动物模型的研究 证明，FL118通过p.o.途径显示显著的抗肿瘤活性。这些数据示于图12-14。图 12和13所示的FL118处理组的体重变化与载剂处理组体重变化的比较提示采用 该方案通过p.o.的FL118的MDT高于2mg/kg。

FL118的抗癌活性与其独特立体结构高度相关：FL113[10H,12H-1,3-二氧 戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]氮茚并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,10H)-二酮,7-乙基-7- 羟基-,(+-)(化学定义)；NSC606174(NSC编号)]与FL118[10H-1,3-二氧戊环并 [4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]氮茚并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,12H)-二酮,7-乙基-7-羟基-, (S)-(化学定义)；NSC634724(NSC编号)]分子量(MW392)相同。但是，FL118 的立体结构明显与FL113不同(图15A)。由于FL118和FL113之间的立体结构差 异，FL118在人肿瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性比FL113好很多，尽管在大多数情 况中FL113的抗肿瘤活性优于伊立替康。一个代表性的例子如图15所示。

实施例4

FL118与化疗剂联合对癌细胞的作用

材料和方法

所用癌细胞系：HCT-8结肠癌细胞、A2008和Skov3卵巢癌细胞维持在5% CO₂、37°C湿化培养箱中补充有10%胎牛血清(弗吉尼亚州赫恩顿的密迪亚泰克 塞尔格罗公司(Mediatech Cellgro))和青霉素(100单位/mL)/链霉素(0.1 μg/mL)(纽约州格兰德岛的英杰公司(Invitrogen))的DMEM内。每3-4天再次培养 细胞。

MTT细胞生长/活力实验：用或不用FL118和紫杉醇处理的细胞生长和活力 通过MTT实验测定。使用四唑盐3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT)作为发色底物来检测细胞活力。无活力细胞随着细胞氧化还原活性的改 变而无法还原MTT染料。用或不用硼替佐米处理后72小时，添加MTT(至终浓 度0.5mg/mL)。96孔板中的细胞在5%CO₂培养箱中于37°C培养孵育4小时，然 后用裂解缓冲液(20%SDS,50%N,N-二甲基甲酰胺，pH4.7，100μL/孔)彻底裂 解。使用Ultra微孔板检测仪(伯腾仪器公司(Bio-Tek Instruments))检测570nm 处相应孔中的吸光度。

FL118可与其它化疗剂有效联用

下文中进一步描述的FL118的新药物作用机制提示我们研究其与其它常规 化疗剂和化学预防剂联用的癌症治疗潜力。在此方面，我们测试了联合FL118 的一系列化疗和化学预防化合物。示例药物组合的结果如下所示。

用FL118与顺铂联合处理HCT-8结肠癌细胞产生显著好于各单独化合物的 结果：用一系列FL118浓度单独或与不同浓度的顺铂联合处理在正常细胞生长 培养基中生长的HCT-8结肠癌细胞。处理后72小时测定细胞生长/存活。令人吃 惊地，所述组合在广泛药物浓度范围内都导致对癌细胞生长的显著抑制(图16)。

用FL118与依托泊苷、紫杉醇或阿霉素联合处理癌细胞显示阳性结果：由 于FL118的独特MOA，期望可以联用许多经典化疗药物与FL118治疗癌症。最 经典的化疗化合物相比FL118具有不同的药物作用机理。因此，两种化合物的 不同MOA显示协同(加成或协作)作用，尽管存在可能的例外。在此方面，FL118 联合顺铂(图16)、依托泊苷(图17)、紫杉醇(图18)或阿霉素(图19)显示有希望的 结果。此外，我们还观察到FL118联合某些确定药物浓度的5-FU、健择(Gemzar)、 白藜芦醇和5-氮杂-二脱氧胞苷显示阳性作用(未显示)。注，已知最后两种化合 物(白藜芦醇和5-氮杂-二脱氧胞苷)下调生存素，这因而可能在机制上与FL118 MOA有部分重叠。

实施例5

作用机制(MOA)——FL118用作IAP和Bcl-2家族抗凋亡蛋白选择性抑制剂

材料和方法

荧光素酶活性实验：全部实验中，细胞接种在48孔板内(2.5×10⁴/孔)并以 约60-70%融合度在含有10%胎牛血清(FBS)的完全细胞培养基中生长。细胞用 pLuc-6309生物素启动子-荧光素酶构建体稳定转染或未转染细胞或用相关荧光 素酶报告载体按以下所示数据瞬间转染：简言之，在装有内含0.4μL Lipofectamine^TM2000的30μL无血清DMEM的1.5mL管中混合含245ng靶向荧 光素酶报告构建体+5ng内部对照载体pRK-tk的30μL无血清DMEM。在室温孵 育20-25分钟后，向48孔板的各孔添加该DNA/Lipofectamine2000混合物(60 μL)，所述各孔已含有300μL相应的完全生长培养基。孵育16小时后，用含有 DMSA或FL118的新鲜完全生长培养基替代所述DNA/Lipofectamine2000混合 物。用FL118处理细胞至多24小时，然后进行荧光素酶实验。使用双荧光素酶 报告实验系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(普洛麦格公司(Promega)) 进行荧光素酶实验。48孔板中的转染细胞用PBS清洗然后在摇床上用60μL1× 被动裂解缓冲液4°C裂解至多1小时。每孔使用20μL细胞裂解物，通过后续添 加20μL荧光素酶实验试剂和20μL Stop-Glo试剂在发光计上检测萤火虫(Firefly) 和海肾(Renilla)荧光素酶活性。将数据标准化至海肾(Renilla)荧光素酶活性(内 部对照)作为任意单位并作柱状图。

MTT细胞生长/活力实验：如上所述进行。

Western印迹分析：如下所述进行磷酸化或未磷酸化蛋白表达的Western印 迹分析。用或没用药物处理的细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗并在含有1% Nonidet P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)、10μg/mL苯甲基 磺酰氟和20μM亮肽素的PBS中于冰上裂解30分钟。然后，在4°C以15,000g离 心细胞裂解物20分钟。来自各样品的50μg总蛋白在与等体积2×SDS上样缓冲 液混合后，于95°C加热5分钟。样品在12-15%SDS聚丙烯酰胺胶上电泳 (SDS-PAGE)分离，然后电转至纯硝酸纤维素膜(加州赫尔克里斯的伯乐公司 (Bio-Rad))。然后所述膜在含5%脱脂牛奶的TBS-T缓冲液(20mM Tris/HCl(pH 7.5)、0.137M NaCl和0.05%吐温20)中室温封闭2-3小时；然后用在含5%BSA 的TBS-T中适当稀释(500×-5000×)的相关一抗在4°C孵育过夜。用TBS-T清洗 后，该膜在含有相应二抗(1:5000)的含5%脱脂牛奶的TBS-T缓冲液中室温振荡 孵育45-60分钟。用Western(马萨诸塞州沃森姆的帕金埃尔默公 司(Perkin Elmer))检测感兴趣的蛋白，并通过放射自显影曝光不同时间(5-60秒) 来观察。检测肌动蛋白作为内部对照来标准化各泳道中上样的总蛋白。

拓扑异构酶I(Top1)测定：Fl118对Top1活性的作用使用来自TopoGEN公司 (佛罗里达州奥兰治港)的拓扑异构酶I测定试剂盒按照生产商提供的说明书测 定。FL118对Top1活性的作用通过FL118阻滞Top1将超螺旋质粒DNA加工成松 弛型质粒DNA的能力来测定。各反应包括一个单位的Top1、0.625μg超螺旋质 粒DNA底物、10mM Tris-HCl(pH7.9)、1mM EDTA、150mM NaCl、0.1%牛 血清白蛋白(BSA)、100μM亚精胺和5%甘油。该反应提供有或没有FL118或 SN-38(伊立替康的活化形式，可在体内而非体外加工的已知Top1抑制剂)。孵育 在37°C进行30分钟，然后通过添加5μL终止缓冲液/凝胶上样染料终止该反应。 各反应中的质粒DNA通过电泳在1×TAE缓冲液中的1%琼脂糖胶内分离，然后 在含有0.5μg/mL溴化乙锭的1×TAE缓冲液中染色15分钟。

在紫外光下拍摄电子图像。

FL118具有独特的作用机制(MOA)

FL118选择性抑制生存素启动子活性：FL118有效抑制A2008卵巢癌细胞内 人生存素启动子驱动的荧光素酶活性(图20)但显示对EKVX肺癌细胞(图21A)或 LNCaP前列腺癌细胞(图21B)中细胞周期依赖性激酶抑制剂p21(p21)、二氢叶酸 还原酶(DHFR)、人凝血酶受体(HTR)和胸腺嘧啶激酶(TK)的基因启动子驱动的 荧光素酶活性没有抑制作用。PC-3前列腺癌细胞也获得相似结果(图22A和B)。 重要的是，与这些结果一致，尽管FL118选择性抑制内源生存素表达，显示其 对p21和DHFR的内源表达无抑制作用(图22C和D)。这些数据指示FL118对生存 素基因转录的高特异性抑制。

FL118抑制IAP和Bcl-2家族中多种抗凋亡蛋白的表达：我们测试是否FL118 的良好生存素表达抑制剂活性不仅抑制生存素表达，还会抑制IAP/Bcl-2家族中 的其它抗凋亡蛋白表达。与此一致，使用市售可得的抗体在western印迹中显示 FL118抑制生存素、XIAP、cIAP2和Mcl-1的表达，但显示其对Bcl-2和Bcl-XL影 响极微(图23)。相反，FL118增加促凋亡蛋白(Bax、Bim)的表达，可能包括由星 号标记的生存素-2B(图23)，指示其高选择性。

FL118诱导凋亡：与我们对FL118差异性调节IAP和Bcl-2家族中促生存和促 凋亡蛋白表达的证明(图23)一致，FL118对IAP/Bcl-2家族中这些蛋白表达的调节 与作为凋亡标志的胱冬酶活化和PARP切割(图24)相关联。

FL118抑制癌细胞生存Akt信号转导，但显示其对Erk1/2信号转导无抑制作 用：FL118的另一个独特特性是抑制组成型和紫杉醇诱导的Akt活化，但显示对 Erk信号转导没有抑制作用(图25)，指示其高选择性和独特MOA。除前述数据以 外，FL118对癌细胞活力的消除比紫杉醇有效10-100倍(图26)，这与本文提供的 来自人肿瘤异种移植动物模型的数据一致。此外，喜树碱(CPT)相关化合物的 一个已知MOA是其抑制拓扑异构酶I(Top1)活性的能力。我们比较了FL118和 SN-38(伊立替康的活化形式，已知的Top1抑制剂)抑制Top1活性的能力；结果 指示高达1μM浓度的FL118仅显示对Top1活性的弱抑制作用(SN-38抑制作用的 约一半，图27A和B)。相反，低nM水平的FL118有效抑制癌细胞生长(图27C和 D)并诱导凋亡(图24)。因此，高浓度FL118对Top1活性的弱抑制可能对FL118介 导的癌细胞生长抑制和凋亡诱导仅起很小作用。此外，FL118在动物模型中所 用剂量[0.75(50%MTD)-1.5(MTD)mg/kg]比伊立替康所用剂量(100-200mg/kg) 低约100倍。因此，这与以下观点一致：尤其考虑到来自SN-38对照化合物的结 果，高浓度的FL118对Top1活性的较小作用对MOA和FL118抗肿瘤活性几乎无 贡献(如果有)。

实施例6

非水溶性药物或候选药物的新型制剂，其制备方法及其用于治疗疾病的方 法

以下说明对就临床相关体内应用而言开发用作药物制品(包括FL118)的制 剂的大量但不成功的努力提供总结。

从化合物库中选择10种化合物用于测试非水溶性化合物制剂(图28)。尽管 这些化合物有直链或非直链尺寸特性的结构多样性，但它们共有非水溶性或水 溶性极低的性质。

我们对这些化合物的药物制剂的最初目标是寻找i.p.可接受制剂，从而能够 在动物模型中测试这些和其它化合物的抗肿瘤活性。我们的测试显示，全部这 些候选药物都能以1-3mg/mL的范围溶于DMSO(二甲亚砜)。因此，我们的初始 方法是使用水状液(例如，水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)稀释我们测定的在确定 范围内于DMSO中良好溶解的单一候选药物。然而，这些方法并未成功，因为 所述候选药物在用水状液(例如，水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)稀释过程中从所 述溶液析出。该测试之后，我们试图使用水状液(例如，盐水)和乳化剂(例如， 吐温80/聚山梨醇酯80)来稀释溶于DMSO的候选药物。我们测定增加吐温80百 分比改善了所述药物的溶解性。为了将吐温80限于临床应用可接受的百分比， 最终制剂溶液使用DMSO(5%)、吐温80(20%)和盐水(75%)制备。以FL118为例 说明该方法，因为FL118可以约1mg/mL溶于DMSO(该浓度约为FL118在DMSO 中的饱和浓度)，当使含有5mg FL118(例子)的5mL DMSO在95mL预先混合的 水状液(20mL吐温80+75mL盐水)中稀释时，用于i.p.给予的最终FL118溶液 含有FL118(0.05mg/mL)、DMSO(5%)、吐温80(20%)和盐水(75%)，其为用于i.p. 注射的FL118制剂，数据示于图1-15和表1-4。就该制剂而言，20g小鼠中用i.p. 途径的至多0.6mL不含药物的配制溶液(安慰剂、载剂或对照溶液)显示对裸小 鼠或SCID小鼠几乎无毒。平行地，20g小鼠中用口服途径的至多0.8mL该制剂 溶液显示对小鼠几乎无毒。然而，该制剂(盐水75%+吐温8020%+DMSO5%) 不是合适的制剂，因为非水溶性药物制剂有两个固有问题。首先，该制剂溶液 中的药物浓度过低且无法达到可接受的更高浓度，因而对该效力较差的化合物 (例如，伊立替康MTD是100-200mg/kg)而言，该制剂无法用于动物模型内的药 物评价。第二，所述制剂中吐温80的百分比过高，对于临床上合适的递送途径 (例如i.v.途径)而言，吐温80不是一种有利的制剂溶剂而且需要排除对吐温80 或其它相似试剂的需求。

基于前文且考虑在临床实践中很少采用i.p.注射药物(除了某些例外，例如 卵巢癌)，寻找通过i.v.途径(其本质上也适合i.p.和口服途径)给予动物模型中评 价药物的非水溶性化合物的制剂，递送较少或没有吐温80，对使用临床上合适 的途径(i.v.和经口服)测试动物模型内的候选药物并因而促进临床实验中的其 它药物测试和用于治疗患者是重要的。为了鉴定通过i.v.途径给予FL118的毒性 较小的合适制剂，我们分析了联合DMSO和具有图28中所述不同化学结构的非 水溶性候选药物的多种额外溶剂。这些溶剂包括DMSO、乙醇、丙二醇(PG)、 聚乙二醇300或400(PEG300或400)、甘油和环糊精(CD)的类型——βCD、羟丙 基-β-环糊精(HPβCD)或磺基丁基醚-β-环糊精(SBEβCD)。使用DMSO或乙醇作 为主要溶剂(不考虑二甲基甲酰胺或DMF，因为DMF是FDA不推荐用于人的溶 剂)测试所述非水溶性候选药物以评价所述候选药物是否能够以可接受的浓度 甚至在低水平(例如，<0.5mg/mL)部分溶解。如果两种主要溶剂都使非水溶性 候选药物(图28)部分溶解，则选择使所述候选药物溶解较好的溶剂。例如，FL113 和FL118都在乙醇中溶解较差且能溶于DMSO，尽管以相对低浓度(约1mg/mL) 溶解。所以选择DMSO替代乙醇用于FL113和FL118初始制剂作为其主要溶剂。 通过混合水状液(例如蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)和辅助共溶剂(PG、PEG 400或CD的一种类型)独立制备基于水的单独共溶剂混合物。具体地，在辅助共 溶剂混合物的简单组合中：配方1)含5%PG的盐水(溶液1)，含10%PG的盐水 (溶液2)，含15%PG的盐水(溶液3)，含20%PG的盐水(溶液4)，含25%PG的盐 水(溶液5)；配方2)含5%PEG400的盐水(溶液1)，含10%PEG400的盐水(溶液 2)，含15%PEG400的盐水(溶液3)，含20%PEG400的盐水(溶液4)，含25%PEG 400的盐水(溶液5)，含30%PEG400的盐水(溶液6)；配方3)含5%甘油的盐水(溶 液1)，含10%甘油的盐水(溶液2)；配方4)含2.5%HPβCD的盐水(溶液1)，含5% HPβCD的盐水(溶液2)，含10%HPβCD的盐水(溶液3)，含15%HPβCD的盐水(溶 液4)，含20%HPβCD的盐水(溶液5)，含25%HPβCD的盐水(溶液6)，含30% HPβCD的盐水(溶液7)，含35%HPβCD的盐水(溶液8)，含40%HPβCD的盐水(溶 液9)。在复杂组合中：配方5)含2.5%PG/2.5%PEG400的盐水(溶液1)，含2.5% PG/5%PEG400的盐水(溶液2)，含5%PG/2.5%PEG400的盐水(溶液3)，含5% PG/10%PEG400的盐水(溶液4)，含10%PG/5%PEG400的盐水(溶液5)，含10% PG/10%PEG400的盐水(溶液6)，含15%PG/15%PEG400的盐水(溶液7)；配方6)含5%PG/5%HPβCD的盐水(溶液1)，含5%PG/10%HPβCD的盐水(溶液2)，含 10%PG/10%HPβCD的盐水(溶液3)，含10%PG/15%HPβCD的盐水(溶液4)，含 10%PG/20%HPβCD的盐水(溶液5)，含10%PG/25%HPβCD的盐水(溶液6)；配方7)含5%PEG400/5%HPβCD的盐水(溶液1)，含5%PEG400/10%HPβCD的盐 水(溶液2)，含5%PEG400/15%HPβCD的盐水(溶液3)，含5%PEG400/20% HPβCD的盐水(溶液4)，含10%PEG400/20%HPβCD的盐水(溶液5)，含10%PEG 400/25%HPβCD的盐水(溶液6)；配方8)含2.5%PG/2.5%PEG400/5%HPβCD的 盐水(溶液1)，含2.5%PG/2.5%PEG400/10%HPβCD的盐水(溶液2)，含2.5% PG/2.5%PEG400/15%HPβCD的盐水(溶液3)，含2.5%PG/2.5%PEG400/20% HPβCD的盐水(溶液4)，含5%PG/5%PEG400/10%HPβCD的盐水(溶液5)，含5% PG/5%PEG400/20%HPβCD的盐水(溶液6)，含5%PG/5%PEG400/25%HPβCD 的盐水(溶液7)。进行所述测试来测定部分溶解于主要溶剂(DMSO或乙醇)中的 非水溶性候选药物用基于水的辅助共溶剂混合物(即，实施方式的配方1-8)稀释 时，在主要溶剂(DMSO或乙醇)中部分溶解的候选药物是否显著增加其溶解性。 以FL118为例，5mg FL118(例如)部分溶解于1mL DMSO中(仅能溶解约20%的 FL118)。然后，使1mL混合了5mg FL118的DMSO分别在19mL实施方式1-8所 述基于水的辅助共溶剂混合物中稀释，以制备含0.25mg/mL FL118、5%DMSO 和内含辅助共溶剂的水状液95%溶液。例如，就配方1-溶液1(实施方式1)而言， 以该方法配制的即用型溶液含0.25mg/mL FL118、5%DMSO、4.76%PG和 90.25%盐水。就配方1-溶液2(实施方式2)而言，配制的即用型溶液含0.25mg/mL FL118、5%DMSO、9%PG和86%盐水。就配方5-溶液1(实施方式3)而言，配制 的即用型溶液含0.25mg/mL FL118、5%DMSO、2.44%PEG400和90.12%盐水。 就配方6-溶液1(实施方式4)而言，配制的即用型溶液包含0.25mg/mL FL118、5% DMSO、4.75%PG、4.75%HPβCD和约90.5%盐水(这里盐水的百分比不精确为 90.5%，因为1g HPβCD并不精确占据1mL体积；1g HPβCD大约占据0.5mL体 积)。就配方8-溶液1(实施方式5)而言，配制的即用型溶液含0.25mg/mL FL118、 5%DMSO、2.44%PG、2.44%PEG400、4.75%HPβCD和约90.47%盐水。

从上述五种代表性实施方式来看，就配制的即用型溶液而言，FL118和 DMSO都一致保持在0.25mg/mL(FL118)和5%(DMSO)。从这些配制实验来看， 我们发现pH是非水溶性药物在所述主要溶剂(特别例子是用于FL118的DMSO) 固相中溶解进入共溶剂相的关键。具体地，在FL118溶剂混合物情况中，使固 相FL118溶解于所述溶剂相内需要用HCL调整pH<1。然后，用NaOH重新调整 pH至3-7，这不会导致FL118从所述溶剂相析出。一般而言，优选含有较高百分 比辅助共溶剂的基于水的溶剂混合物，因为这能帮助更多药物溶解以达到更高 浓度。以FL118为例，这些制剂中的一些能达到配制溶液中更高的FL118浓度(就 至多0.5mg/mL在共溶剂混合物中配制所述药物)。与此相反，采用吐温80的制 剂(盐水75%+吐温8020%+DMSO5%)仅能达到0.05mg/mL的FL118。

如前文实施例部分所述，FL118在动物模型中的评价显示较差结果。尤其 是按上述方法配制的FL118以1.5mg/kg按FL118的每周×4方案给予不仅产横弱 抗肿瘤活性，而且显著增加FL118对动物的毒性。因此，本实施例中所述的大 量测试并未获得可用于非水溶性药物或候选药物在人癌症动物模型中有意义 评价的制剂，因此不具临床应用性。

实施例7

非水溶性药物或候选药物的新型制剂，其制备方法及其用于治疗疾病的方 法

鉴于实施例6中所述的大量测试的失败，我们开发了三种策略以制备用于 i.v.注射的非水溶性化合物，其也适合用于i.p.和p.o.给予。以下描述配制非水溶 性化合物的所述三种策略。

配制用于i.v.注射的非水溶性化合物的第一种方法(策略I)

配方组分：该策略中的制剂包括非水溶性化合物、溶剂A、溶剂B、用或未 用氯化钠和/或磷酸钠缓冲的蒸馏水，存在或不存在低浓度的其它辅助共溶剂， 所述共溶剂与上述失败的制剂实验中所用的成分非常相近。溶剂A选自βCD、 HPβCD或SBEβCD。溶剂B选自DMSO或乙醇。辅助溶剂选自丙二醇(PG)、聚乙 二醇300(PEG300)或聚乙二醇400(PEG400)。水状液是蒸馏水、盐水或磷酸盐 缓冲盐水。

配制方法和溶剂类型及浓度的选择：1)配制主要溶剂溶液。通过室温温和 涡旋试管中的溶液5-15分钟使溶剂A(βCD、HPβCD或SBEβCD)溶解于溶剂 B(DMSO或乙醇)以形成主要溶剂A/B混合溶液。选择哪一种溶剂A(βCD、HPβCD 或SBEβCD)来配制所述主要溶剂A/B混合物溶液取决于所述非水溶性化合物的 化学性质。一般而言，如果化合物具有酸性基团，则溶剂A可以是βCD或HPβCD， 因为它们是中性或碱性的；如果化合物具有一个或多个碱性基团，则溶剂A可 以是SBEβCD，因为SBEβCD具有酸性基团。选择哪一种溶剂B(即，DMSO或乙 醇)取决于所述非水溶性化合物在哪一种溶剂(DMSO或乙醇)中溶解较好。例如， 测试显示，FL113和FL118在乙醇中溶解不佳而在DMSO中溶解具有低但适度的 浓度(约1mg/mL)。因此选择DMSO作为FL113和FL118制剂的溶剂B。最终即用 型制剂溶液中的溶剂A(βCD、HPβCD或SBEβCD)(W/V)低达0.2%且高达5%，这 取决于即用型配制溶液中所述化合物的终浓度。因此，溶剂A(βCD、HPβCD或 SBEβCD)在溶剂B(DMSO或乙醇)中的百分比在2.5%-50%的范围内，这取决于我 们需要配制的化合物量。2)制备辅助溶剂溶液。一般而言，通过在25-37°C于 涡旋装置上温和涡旋至多过夜使水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)与辅 助溶剂(PG、PEG300或PEG400)混合。这些辅助溶剂溶液包括但不限于：配方 1使盐水(蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水)混合0%PG(辅助溶剂1，Hsol-1)、1% PG(Hsol-2)、2%PG(Hsol-3)、3%PG(Hsol-4)、4%PG(Hsol-5)、5%PG(Hsol-6)、 6%PG(Hsol-7)、7%PG(Hsol-8)、8%PG(Hsol-9)、9%PG(Hsol-10)和10%PG(11)； 配方2使盐水(蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水)混合1%PEG400(或PEG 300)(Hsol-1)、2%PEG400(或PEG300)(Hsol-2)、3%PEG400(或PEG300) (Hsol-3)、4%PEG400(或PEG300)(Hsol-4)、5%PEG400(或PEG300)(Hsol-5)、 6%PEG400(或PEG300)(Hsol-6)、7%PEG400(或PEG300)(Hsol-7)、8%PEG 400(或PEG300)(Hsol-8)、9%PEG400(或PEG300)(Hsol-9)和10%PEG400(或 PEG300)(Hsol-10)；和配方3使盐水(蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水)混合1%PG/9% PEG400(Hsol-1)、2%PG/8%PEG400(Hsol-2)、3%PG/7%PEG400(Hsol-3)、 4%PG/6%PEG400(Hsol-4)、5%PG/5%PEG400(Hsol-5)、6%PG/4%PEG400 (Hsol-6)、7%PG/3%PEG400(Hsol-7)、8%PG/2%PEG400(Hsol-8)、9%PG/1% PEG400(Hsol-9)。注，可以制备较高百分比的辅助溶剂(PG、PEG300或PEG 400)，但这些辅助溶剂在即用型配制溶液中百分比越高，所述配制溶液的潜在 毒性越高。3)使用主要溶剂溶液和辅助溶剂溶液配制非水溶性化合物。通过涡 旋5-15分钟使非水溶性化合物溶于主要溶剂溶液中(所述化合物可以完全溶解 或可以不完全溶解)。然后用辅助溶剂溶液稀释所述溶于主要溶剂溶液中的药 物，这是通过在室温下于涡旋装置上的容器中温和涡旋所述混合物10-20分钟完 成。以FL118为例，为了使FL118的终浓度为0.5mg/mL，我们可通过涡旋5分钟 使1mg FL118(作为例子，可以是任何量的FL118，只要保持相同比例即可)溶于 0.1mLDMSO中≥5%HPβCD(βCD或SBEβCD)主要溶液中。然后，通过在室温下 于涡旋装置上温和涡旋试管10-20分钟进一步使所得FL118/HPβCD/DMSO混合 物在1.9mL(20×稀释)采用上述三种配方的基于水的辅助溶剂溶液之一中稀 释。具体地，如果所得FL118/HPβCD/DMSO混合物在1.9mL配方1的辅助溶剂 1中进一步稀释达到2mL的总体积，则最终即用型FL118制剂溶液为FL1180.5 mg/mL、HPβCD0.25%、DMSO约5%和PG0%；如果所得FL118/HPβCD/DMSO 混合物在1.9mL配方1的辅助溶剂11中进一步稀释达到2mL的总体积，则最终 即用型FL118制剂溶液为FL1180.5mg/mL、HPβCD0.25%、DMSO约5%和PG 9.5%。类似地，在该情况中，如果所得FL118/HPβCD/DMSO混合物在1.9mL配 方3的辅助溶剂1中进一步稀释达到2mL的总体积，则最终即用型FL118制剂溶 液为FL1180.5mg/mL、HPβCD≥0.25%、DMSO约5%、PG0.95%和PEG400 8.55%；如果所得FL118/HPβCD/DMSO混合物在1.9mL配方3的辅助溶剂9中进 一步稀释达到2mL的总体积，则最终即用型FL118制剂溶液为FL1180.5 mg/mL、HPβCD≥0.25%、DMSO约5%、PG8.55%和PEG4000.95%。通过使 用主要溶剂溶液和辅助溶剂溶液实施上述配制方法，我们能够成功配制具有图 28所示不同化学结构的大范围药物浓度的单独非水溶性化合物制剂。再次用 FL118作为例子，如果希望FL118的终浓度为0.25mg/mL，我们可通过涡旋3-10 分钟使1mg FL118(再次作为例子，但FL118可以是任何量,只要保持相同比例即 可)溶于0.2mL≥2.5%HPβCD(CD或SBEβCD)的DMSO溶液。然后使所得 FL118/HPβCD/DMSO混合物以3.8mL(20×稀释)在上述3种辅助溶剂溶液之一中 进一步稀释达到4mL的终体积(FL1180.25mg/mL、HPβCD≥0.125%、DMSO 5%、基于水的辅助共溶剂约95%)。如果希望采用该配制方法的可注射溶液的 FL118浓度较高，例如最终可注射溶液为1mg/mL，则可通过涡旋5-15分钟使2 mg FL118溶于0.1ml≥20%HPβCD(CD或SBEβCD)的DMSO溶液。然后使所得 FL118/HPβCD/DMSO混合物以1.9mL(20×稀释)在上述3种辅助溶剂溶液之一中 进一步稀释达到2mL的终体积(FL1181mg/mL、HPβCD≥0.5%、DMSO约5%、 基于水的辅助共溶剂约95%)。总之，可以使用策略I来配制具有临床前动物模 型研究或患者治疗的临床实验中所需浓度的用于i.v.注射的化合物(其本质上适 于i.p.和p.o.途径)。配制药物使其在最终即用型溶液中具有大范围不同浓度的能 力是重要的，因为在临床前动物模型或在临床实验中评估药物需要剂量从低剂 量增加至高剂量，同时保持最优和持续的体积大小——体积过小可能产生较大 系统误差和药物给予的技术困难，而体积过大可能无法实际注射全部所述溶液 以达到所需药物剂量。此外，不同给药途径(i.v.、i.p.或p.o.)可适用于不同的体 积。

配制用于i.v.注射的非水溶性化合物的第二种方法(策略II)

在所述第二种方法中，在非水溶性化合物溶于所述主要溶剂A(βCD、 HPβCD或SBEβCD)/溶剂B(DMSO或乙醇)混合物之后，向所述化合物/溶剂A/溶 剂B混合物添加一种或两种辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)，通过在25-37°C 于涡旋装置上温和涡旋试管中的该溶液至多过夜。然后使用水状液(蒸馏水、盐 水或磷酸盐缓冲盐水)稀释所得药物溶液至所需浓度，与此同时，用水状液稀释 药物之后最终即用型药物制剂溶液中的辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)百分 比保持在总共1%-10%的范围内。以FL118为例，如果用2%PG配制终浓度为0.25 mg/mL的FL118，则通过涡旋5-15分钟使1mg FL118(一个例子，但可以是任何 量，只要使用相同比例即可)溶于0.2mL≥2.5%HPβCD(βCD或SBEβCD)的 DMSO溶液。然后向所得FL118/HPβCD/DMSO混合物中添加0.08mL PG，通过 在25-37°C于涡旋装置上的试管中温和涡旋该溶液至多过夜以混合所述溶液。所 得药物溶液用3.72mL水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)进一步稀释，通 过在25-37°C温和涡旋涡旋装置上的试管至多过夜以达到4mL的终体积(FL118 0.25mg/mL、HPβCD≥0.125%、DMSO约5%、PG2%)。如果使用该方法配制 较高浓度的FL118可注射溶液，例如制备有2%PG和2%PEG400的1mg/mL最终 可注射溶液，通过涡旋5-15分钟使2mg FL118(再次作为例子，但可提供任何量 的该药物，只要使用相同比例即可)溶于0.1mL≥10%HPβCD(CD或SBEβCD)的 DMSO溶液。然后向所得FL118/HPβCD/DMSO混合物添加0.04mL PG和0.04mL PEG400，通过在25-37°C于涡旋装置上涡旋试管内的溶液至多过夜来混合。所 得药物溶液用1.72mL水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)进一步稀释，通 过在25-37°C温和涡旋装置上的试管至多过夜以达到2mL的终体积(FL1181 mg/mL、HPβCD≥0.5%、DMSO约5%、PG2%、PEG4002%)。通过使用该方 法，我们能够配制用于i.v.给予(也适于i.p.和p.o.)的所需药物制剂溶液。

配制用于i.v.注射的非水溶性化合物的第三种方法(策略III)

在所述第三种方法中，溶剂A(βCD、HPβCD或SBEβCD)溶于溶剂B(DMSO 或乙醇)之后，使所得溶剂A/B混合物与一种或两种辅助溶剂(PG、PEG300或 PEG400)进一步混合以配制主要主溶剂混合物。然后，通过在25-37°C于涡旋装 置上温和涡旋试管中的溶液至少过夜使非水溶性化合物溶于该主要主溶剂混 合物。使所述非水溶性化合物溶于所述主要主溶剂混合物中，然后在水状液(蒸 馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)中稀释以达到所需药物浓度，稀释通过在25-37°C 于涡旋装置上温和涡旋试管中的溶液至多过夜完成。如上文策略II所述，在用 水状液稀释所述主要主溶剂溶液之后，辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)在最 终即用型药物制剂溶液中的百分比保持在总共1%-10%范围内。使用策略II就 FL118制剂所述的相同例子来说明，如果待用2%PG配制终浓度0.25mg/mL的 FL118，首先在0.2mL≥2.5%HPβCD(CD或SBEβCD)的DMSO溶液中混合0.08 mL PG，混合通过在25-37°C于实验室涡旋装置上温和涡旋合适尺寸试管(例如 0.5mL试管)中的所述溶液至多过夜完成。然后通过在25-37°C于涡旋装置上温 和涡旋试管中的溶液最少16小时使1mg FL118溶解于所得主要主溶剂 (HPβCD/DMSO/PG)中。所得FL118溶液用3.72mL水状液(蒸馏水、盐水或磷酸 盐缓冲盐水)进一步稀释，通过在25-37°C于涡旋装置上温和涡旋大试管内的溶 液至多过夜以达到4mL的终体积(FL1180.25mg/mL、HPβCD≥0.125%、DMSO 约5%、PG2%)。类似地，如果希望采用该方法配制高浓度FL118作为可注射溶 液使用，例如制备有2%PG和2%PEG400的1mg/mL最终可注射溶液，则首先 在0.1ml≥10%HPβCD(CD或SBEβCD)的DMSO溶液中混合0.04mL PG和0.04 mL PEG400，混合通过在25-37°C于涡旋装置上温和涡旋试管中的溶液最少16 小时完成。然后通过在25-37°C于涡旋装置上温和涡旋试管中的溶液至多过夜使 2mg FL118溶解于所得主要主溶剂(HPβCD/DMSO/PG/PEG400)中。所得FL118 溶液用1.82mL水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水)进一步稀释，通过在 25-37°C于涡旋装置上温和涡旋试管中的溶液至多过夜以达到2mL的终体积 (FL1181mg/mL、HPβCD≥0.5%、DMSO约5%、PG2%、PEG4002%)。通过 使用该方法，我们也能够制备用于i.v.给予(也适于i.p.和p.o.)的所需药物制剂溶 液。我们发现，就较弱非水溶性化合物而言，策略II和策略III能更有效地使所 述非水溶性化合物以可接受的浓度溶解，且具有就i.v.给予而言较好的溶液稳定 性。此外，用上述三种方法配制非水溶性化合物时，优选最终即用型药物制剂 溶液中DMSO或乙醇的百分比保持在5%-10%的范围内。这可以通过联用溶剂 B(DMSO或乙醇)中不同百分比的溶剂A与合适的稀释以制备最终即用型药物制 剂溶液来实现。或者，这可以通过在用水状液(蒸馏水、盐水或磷酸盐缓冲盐水) 稀释所述主要主混合物之前向所述主要主混合物添加额外的溶剂B(DMSO或乙 醇)来实现。当然，应从所述用于药物稀释的水状液体积中减去添加至所述主要 主混合物中的额外溶剂A(DMSO或乙醇)的量。还优选溶剂A的摩尔浓度与最终 即用型配制溶液中化合物的摩尔浓度之比应为1.1-10(溶剂A的摩尔浓度):1(化 合物摩尔浓度)，这取决于所述化合物分子量、形状以及其它化学性质。一般而 言，大分子量的非线性结构的非水溶性化合物需要较高溶剂A:化合物比例(即， 需要更多溶剂A)。就具体非水溶性化合物而言，考虑到本公开的益处，这需要 通过对本领域技术员常规的测试来确定。一般而言，优选使用低量的辅助溶剂， 只要能有效用于i.v.注射的非水溶性化合物可以充分稳定状态溶解。用于非水溶 性化合物制剂的上述三种配制策略的比较总结于表5。总之，一般而言，如果 所述制剂在上述三种配制策略的任何一种中包含辅助溶剂(PG、PEG300或PEG 400)，则所配制溶液的药物溶液稳定性增加。然而，配制的即用型药物溶液中 辅助溶剂越多，所配制的即用型溶液的潜在毒性越高。因此，在上述配制策略 的实施过程中，优选测试不含辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)时的稳定性。 此外，含所述药物或候选药物的即用型溶液无需是真溶液，只要所配制的溶液 在振荡后于适当时段中显示无沉淀，所配制的溶液就i.v.注射而言合格。如果需 要额外的稳定性，可以采用添加辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)，特别是通 过策略II和策略III中所述的方法添加PG、PEG300或PEG400能就非水溶性药物 尤其是难溶于水的药物获得更好的溶解性。以FL118为例，最终配制的FL118i.v. 注射溶液[FL118、溶剂A(HPβCD)、溶剂B(DMSO)和水状液(蒸馏水、盐水或 磷酸盐缓冲盐水)]中缺乏辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)使所配制的FL118 溶液稳定性减少，然而，配制的不含辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)的即用 型FL118溶液仍适于i.v.注射。重要的是，该FL118制剂不减少FL118的抗肿瘤活 性，同时保持其无毒性质。换言之，如果采用策略I、II和III配制的非水溶性药 物或候选药物在不含辅助溶剂(PG、PEG300或PEG400)的最终即用型溶液中保 持合理稳定性用于通过i.v.注射方式给药，则可排除使用所述辅助溶剂(PG、PEG 300或PEG400)。

应强调，上述药物制剂不必包含完全溶解的药物，只要该非水溶性药物不 处于固态即可。相反，各化合物分子溶解于最终溶剂混合物。以上文所述三种 策略配制的非水溶性化合物混合物可以是有或没有淡色的半透明或不透明的 清澈状态。我们发现，大多数情况中，所配制的非水溶性药物或候选药物在通 过涡旋温和重悬之后是有色或无色乳状或清浊溶液。以上述三种策略配制的非 水溶性化合物溶液适合于临床实践以通过i.v.、i.p.或口服单独或组合给予来治 疗患病的患者或动物。通过所述三种不同策略(策略I、策略II和策略III)配制的 FL118溶液的比较总结于上述表6。0.025mg/mL、0.5mg/mL或0.75mg/mL浓度 的FL118(表6)适于i.v.给药以达到从1mg/kg增加到7.5mg/kg的剂量，且具有就 本发明所用小鼠模型系统的i.v.给药而言适当的体积大小。我们发现，在该FL118 制剂的情况中，尽管配制的FL118溶液在一种或两种辅助溶剂(PG和/或PEG400) 存在下更加稳定，显示有或没有一种或两种辅助溶剂(PG和/或PEG400)之间 FL118的抗肿瘤活性没有明显差异。然而，i.p.注射所述制剂溶液(安慰剂、载剂 或不含FL118的对照溶液)以测试所述制剂溶液毒性，显示如果需要较大体积， 则含有一种或两种辅助溶剂(PG和/或PEG400)的制剂溶液趋于有毒，这取决于 所述辅助溶剂的百分比。

实施例8

按上述策略制备的新型FL118制剂显著改善FL118的最大耐受剂量(MTD) 且未明显减少FL118的抗肿瘤活性

如表2中所示，通过i.p.给予按前述制剂配方(FL1180.05mg/mL；DMSO 5%；吐温8020%和盐水75%)配制的FL118，每天×5方案(5剂量)中的MTD是 0.2mg/kg；第0、2和4天方案(3剂量)中的MTD是0.5mg/kg；和每周×4(4剂量) 中的MTD是1.5mg/kg。另注：每天×5方案和第0、2和4天方案(3剂量)中的FL118 在含吐温80的制剂中未能达到产生有意义抗肿瘤活性的药物浓度。相反，在示 例性新制剂(FL1180.5mg/mL；DMSO5%；HPβCD0.25%和盐水95%)中i.v.给 予FL118显著增加了MTD。具体而言，在图29中所示的新型制剂中，就FL118 而言每天×5方案(d×5，5剂量)的毒性(小鼠体重减轻)数据指示该方案中的 MTD约为1.5mg/kg(即，从旧制剂的0.2mg/kg增加至该新型制剂的1.5mg/kg)； 就隔天第0、2、4、6和8天方案(q2×5，5剂量)而言，其MTD约为1.5mg/kg；而 就每周×4(wk×4，4剂量)方案而言，其MTD约为5mg/kg。重要的是，使用最 严格给药途径(i.v.)在所述三种临床上合适的给药方案(d×5，q2×5和wk×4)中 采用示例性制剂(FL1180.5mg/mL；DMSO5%；HPβCD0.25%和盐水95%)中的 新FL118MTD剂量，FL118有效地抑制了肿瘤生长，还甚至看来产生治愈结果 (图30A)，而未经FL118处理的对照小鼠的肿瘤在两周内生长至IACUC(实验动物 照料和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee))允许的最大尺 寸(图30B、C、D、E、F、G)。这些令人兴奋的结果不仅在头颈癌(FaDu)(图30) 中出现，而且在结肠癌(SW620)(图31)和特定肺癌间皮瘤癌(211H，H226)(图32) 中出现。注，i.v.给予以表6所示策略II或策略III配制的选定FL118溶液(含FL118 0.75mg/mL；DMSO5%；HPβCD0.375%；PG5%；PEG4005%和盐水85%)获 得与图30-32所示采用不含辅助溶剂(PG和PEG400)的FL118相似的抗肿瘤效 果。

本发明超越现有方法的益处和改良

鉴于上文，本领域技术人员能了解，先前并未认识到FL118是高度有效的 抗肿瘤化合物，也未掌握其治疗癌症的MOA。因此，本发明第一次发现1)在用 于i.p.注射的制剂(0.05mg/mL FL118、75%盐水、20%吐温80、5%DMSO)中， 就间隔方案(例如每周或每两周但非频繁给予，例如每天)应用而言FL118具有特 别且预料之外的优良抗肿瘤功效，而所述间隔方案能最大化FL118的抗肿瘤活 性潜力且最小化其对正常组织的毒性；2)用于可注射和口服给予的制剂(0.25-1 mg/mL FL118、95%盐水、0.125-0.5%HPβCD、5%DMSO)中，就间隔方案(例 如每天一次共五次，隔天一次共五次，每周一次共四次)应用观察到FL118具有 特别且预料之外的优良抗肿瘤功效，从而最大化FL118的抗肿瘤活性潜力并最 小化其对正常组织的毒性；3)由于其独特MOA，FL118适用于与许多其它常规 化疗剂和化学预防剂联合治疗以进一步增强其抗肿瘤潜力；4)与使用高剂量 AITC或硒化合物来增强化疗药物功效相反(尽管显示一些效果)，我们提供的数 据显示通过在化疗过程中消耗不含AITC和硒的食物产生AITC或硒缺乏能令人 吃惊地增强化疗药物(包括FL118)的抗肿瘤潜力，这能避免治疗药物与AITC或 其相关化合物和/或硒联合的潜在复杂性；5)我们首先考虑用于可注射和口服 给予的FL118制剂。我们发现了可通过三种方法(策略I、策略II、策略III)制备的 增加其功效的多种新配方，并通过这样实行而发现了配制非水溶性药物和候选 药物的方法；以及6)我们公开了FL118的MOA，其引起选择性抑制多种 IAP/Bcl-2家族抗凋亡蛋白表达和癌细胞生存Akt信号转导，同时增加选择性 Bcl-2家族促凋亡蛋白的表达。据信所有这些体外或体内效果是前所未知的。

虽然参照特定实施方式(其中一些是优选的实施方式)对本发明进行了具体 展示和描述，但本领域技术人员应理解，可在不背离本发明精神和范围的情况 下对形式和细节做出各种改变。