一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法

摘要

本发明目的是提供一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法，本发明所制备出的TIL细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高等特点。本发明的主要特点是：利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对TIL进行培养，这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态，从而利于细胞接受各种因子的刺激，并且这两种蛋白本身就有对TIL细胞增殖的促进作用；而抗OX-40单克隆抗体的使用可以刺激TIL细胞中CD3+CD8+T细胞亚群的共刺激信号，促进细胞的活化，提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达，增强其杀伤能力。到目前为止，仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗OX-40单克隆抗体联合应用于TIL细胞制备的研究报道，本发明首次提供出一种在TIL细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种肿瘤侵润淋巴细胞（Tumor  Infiltrating lymphocyte,TIL）的培养，即利用各种细胞因子的组合来刺激胸腹水来 源的淋巴细胞，使其可以高效扩增。

背景技术

肿瘤侵润淋巴细胞（Tumor Infiltrating lymphocyte,TIL）是指侵润到肿瘤组织 周围的淋巴细胞，细胞表型以CD3⁺CD8⁺T和CD3⁺CD4⁺T细胞为主，另外还有少量的 NKT细胞和NK细胞。由于TIL细胞多数与肿瘤细胞发生过接触，所以理论上可以 对肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用。但是，由于肿瘤微环境中，存在很强的免 疫抑制因子，所以实际上TIL细胞的功能是受到极大的抑制，无法发挥对肿瘤细 胞的有效杀伤作用。

上个世纪八十年代，Rosenberg教授首次分离肿瘤组织中的TIL细胞，并通过 白细胞介素2的刺激接来解除其免疫抑制状态，体外扩增后，用于回输治疗黑 色素瘤患者，并取得了一定的效果。

TIL细胞的来源主要有两个：1、手术切除的肿瘤组织或淋巴结；2、癌性胸腹 水。从手术样品中分离TIL细胞需要经过机械剪切，多种蛋白酶的酶解等多个步 骤，方法比较繁琐，而且最终能够分离并成功培养的比例不高，这很大程度上 限制了手术样品来源TIL的临床应用。癌性胸腹水来源的TIL细胞，分离的方法相 对简单，也容易在体外培养，所以在临床得到了较为广泛的应用。但是，由于 使用传统方法，TIL在体外的扩增有限，通常20天左右的时间，细胞数量仅扩增 20-50倍左右，且TIL细胞中CD3⁺CD8⁺T细胞的杀伤能力不高，极大的影响了TIL细 胞临床应用的效果。

科研工作者不断探索培养TIL的新方法，比如在培养中期添加抗CD3单克隆 抗体、使用炎性因子等。因此，尽早建立一种高效扩增TIL细胞的方法，已成为 国内外学着研究工作的目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法，即使 用肿瘤患者的胸腹水，分离得到TIL细胞，在体外通过多种因子的刺激作用，使 TIL细胞得到大量扩增，并提高其杀伤活性。

申请人在长期的研究中发现，层粘连蛋白和纤维连接蛋白可以极大的提高TIL 细胞的增殖速度；而抗OX-40单克隆抗体的添加可以有效的刺激TIL细胞的活化， 上调CD3⁺CD8⁺T细胞中行使杀伤功能的穿孔素和颗粒酶的表达，提高其对肿瘤细 胞的杀伤活性。申请人将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗OX-40单克隆抗体三种 因子共用引入到TIL细胞的培养中，从而促成了本发明。

本发明的TIL细胞的培养方法，包括如下的步骤：

1)将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后，加入到细胞培养瓶中包被；

2)将从胸腹水分离得到的TIL细胞用培养液重悬后，接种到包被后的培养瓶 中；添加IL-2刺激；

3)培养4天后，将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养，并添加抗 OX-40单克隆抗体；

4)持续扩大培养至第20天时，完成高效TIL细胞的培养。

本发明步骤2）所述的培养液，其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾 300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、 碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126 mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、 谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、 丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。

其中氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份 谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、 20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色 氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。

维生素的配比如下：2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫 胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。

微量元素的配比如下：85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、 6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。

为了获得更好的培养效果，在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子 （Chlorella Growth Factor，CGF）。

本发明所制备出的TIL细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高等特点。 本发明的主要特点是：利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对TIL进行 培养，这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态，从而利于细胞接受各 种因子的刺激，并且这两种蛋白本身就有对TIL细胞增殖的促进作用；而抗OX-40 单克隆抗体的使用可以刺激TIL细胞中CD3⁺CD8⁺T细胞亚群的共刺激信号，促进细 胞的活化，提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达，增强其杀伤能力。到目前为止， 仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗OX-40单克隆抗体联合应用于TIL细胞 制备的研究报道，本发明首次提供出一种在TIL细胞制备中通过添加以上三种因 子提高细胞数量和杀伤活性的方法。

具体实施方法

本发明所用的材料描述如下：

抗OX-40单克隆抗体：鼠抗人OX-40单克隆抗体，购于安迪生物科技（上海） 有限公司

HTB-135细胞：人胃癌细胞系，购于中科院细胞库

NCI-H596细胞：人肺癌细胞系，购于中科院细胞库

HepG2细胞：人肝癌细胞系，购于中科院细胞库

本发明的癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法，包括如下的步骤：

1)培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克，于20毫升的 磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底面 积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置3-5小时。

2)细胞接种：收集400-1000毫升的癌性胸腹水，1500转/分钟，离心10分钟。 用30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml 淋巴细胞分离液的离心管。2000转/分钟，离心15分钟。取中间白色的PBMC 细胞层，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数后，接 种到去包被液的培养瓶中。添加60000单位的IL-2。

3)转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中继 续培养，添加无血清培养基至400毫升，添加200000单位的IL-2和4微克的抗 OX-40单克隆抗体。

4)扩大培养：每隔两天根据细胞的数量和状态，添加适量的无血清培养基， 并按500单位/毫升的浓度添加IL-2，持续扩大培养。

收获细胞：在培养的第20天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计算TIL 细胞的增殖倍数。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行杀伤实验。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

实验例1

1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克，于20毫升 的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底 面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置4小时。

2）细胞接种：收集600毫升的癌性腹水，1500转/分钟，离心10分钟。用 30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml淋巴 细胞分离液的离心管。2000转/分钟，离心15分钟。取中间白色的PBMC细胞层， 生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数，计算细胞数为 2.6×10⁷个。将细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加60000单位的IL-2。 其中无血清培养基的组份如下：氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁 120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、 氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450 mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、 双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、 葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml、25mg/L的小球藻生长因子。

其中氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份 谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、 20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色 氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。

维生素的配比如下：2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫 胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。

微量元素的配比如下：85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、 6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。

上述的培养基是长期优化获得的，在同样的培养时间内，本发明的培养液 对细胞的增殖效果要明显好于现有的细胞培养液，细胞增殖速度可以提高约 12%。

3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中 继续培养，添加无血清培养基至400毫升，添加200000单位的IL-2和4微克的 抗OX-40单克隆抗体。

4）扩大培养：每隔两天根据细胞的数量和状态，添加适量的无血清培养基， 并按500单位/毫升的浓度添加IL-2，持续扩大培养。

收获细胞：在培养的第20天，取1毫升的细胞悬液计数，计算细胞数为5.4×10⁹个，增殖倍数为208倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行杀伤实 验。高效TIL细胞在效靶比为10:1的条件下，对HTB-135、NCI-H596和HepG2细 胞系的杀伤分别达到22.8%、19.4%、13.4%。

按照上述步骤，重复试验7次，高效TIL细胞增殖倍数的平均值为172倍。 在效靶比为10:1的条件下，高效TIL细胞对对HTB-135、NCI-H596和HepG2细 胞系杀伤的平均值为26.2%、20.7%和15.8%.

实验例2

1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克，于20毫升 的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底 面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置5小时。

2）细胞接种：收集400毫升的癌性胸水，1500转/分钟，离心10分钟。用 30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml淋巴 细胞分离液的离心管。2000转/分钟，离心15分钟。取中间白色的PBMC细胞层， 生理盐水洗涤2次，用80毫升的无血清培养基重悬，取样计数，计算细胞数为 3.2×10⁷个。将细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加80000单位的IL-2。

3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中 继续培养，添加无血清培养基至400毫升，添加160000单位的IL-2和4微克的 抗OX-40单克隆抗体。

扩大培养：每隔两天根据细胞的数量和状态，添加适量的无血清培养基，并 按400单位/毫升的浓度添加IL-2，持续扩大培养。

4）收获细胞：在培养的第20天，取1毫升的细胞悬液计数，计算细胞数为 5.7×10⁹个，增殖倍数为178倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行 杀伤实验。高效TIL细胞在效靶比为10:1的条件下，对HTB-135、NCI-H596和HepG2 细胞系的杀伤分别达到16.3%、27.6%、15.5%。

实验例3

1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克，于20毫升 的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底 面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置3小时。

2）细胞接种：收集900毫升的癌性腹水，1500转/分钟，离心10分钟。用 30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml淋巴 细胞分离液的离心管。2000转/分钟，离心15分钟。取中间白色的PBMC细胞层， 生理盐水洗涤2次，用80毫升的无血清培养基重悬，取样计数，计算细胞数为 3.6×10⁷个。将细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加80000单位的IL-2。

3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中 继续培养，添加无血清培养基至450毫升，添加180000单位的IL-2和4微克的 抗OX-40单克隆抗体。

扩大培养：每隔两天根据细胞的数量和状态，添加适量的无血清培养基，并 按400单位/毫升的浓度添加IL-2，持续扩大培养。

5）收获细胞：在培养的第20天，取1毫升的细胞悬液计数，计算细胞数为 5.5×10⁹个，增殖倍数为153倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行 杀伤实验。高效TIL细胞在效靶比为10:1的条件下，对HTB-135、NCI-H596和HepG2 细胞系的杀伤分别达到14.6%、12.9%、20.1%。

本发明所制备的高效TIL细胞在培养第20天时，增殖倍数超过150倍，是 比常规TIL培养方法增殖倍数的300%以上，并且高效TIL细胞在较低的效靶比条 件下，即可对常见的胃癌、肺癌和肝癌细胞系产生较高的杀伤。