利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法

摘要

本发明公开了一种利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法，包括菌种复壮、菌体扩培、废弃菌包营养优化及预处理、接种，立体培养以及干燥粉碎等步骤，本发明利用食用用菌菌包发酵，可控性强，水分、温度等容易控制在一定范围内；不容易染菌，工作人员进出发酵车间，以及空气的流动都不容易染菌；质量稳定，活菌含量起伏不大；利用的废弃菌包，原料成本低廉；后期处理方便，且不会因为阴天来不及干燥而大量染菌。

说明书

技术领域

本发明属于微生物和水产养殖的交叉领域，特别是一种利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法。

背景技术

芽孢杆菌，芽孢杆菌（Bacillaceae），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌有如下优点：（1）保湿性强：形成强度极为优良的天然材料聚麸胺酸，为土壤的保护膜，防止肥份及水份流失；（2）有机质分解力强：增殖的同时，会释出高活性的分解酵素，将难分解的大分子物质分解成可利用的小分子物质；（3）产生丰富的代谢生成物：合成多种有机酸、酶、生理活性等物质，及其它多种容易被利用的养份；（4）抑菌、灭害力强：具有占据空间优势，抑制有害菌、病原菌等有害微生物的的生长繁殖；（5）除臭：可以分解产生恶臭气体的有机物质、有机硫化物、有机氮等，大大改善场所的环境。目前，芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆杆菌、乳酸杆菌等等）已被广泛的应用于环保、农业、畜牧业等多个领域。

例如，芽孢杆菌能提高动物生产性能是其产生多种消化酶的一个重要体现。研究表明，芽孢杆菌能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等，这些酶能够破坏植物饲料细胞的细胞壁，促使细胞的营养物质释放出来,并能消除饲料中的抗营养因子，减少抗营养因子对动物消化利用的障碍。如：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌可用于畜牧水产饲料添加剂、用于水环境净化；多粘类芽孢杆菌具有固定分子态氮的能力。

然而，目前为止用于水质净化的芽孢杆菌的发酵生产工艺可分为固体发酵和液体发酵两大类。而液体发酵涉及到菌体离心、冷冻干燥等步骤，生产周期长，生产工艺复杂，且所需的仪器设备价格昂贵，生产成本高。相对于液体发酵，固体发酵的生产成本相对较低。而且培养基含水量少，废水废渣少，环境污染少，容易处理；消耗低，功能设备简易培养基原料多为天然基质或废渣，广泛低廉；设备技术简易，后处理方便；产物浓度较高。但是固体发酵工艺参数难检测和控制；产品少，操作消耗劳力多，强度大。

目前所应用于生产芽孢杆菌的固体发酵主要包括粗放式的浅盘发酵培养以及固体发酵罐培养两种。其中粗放式的浅盘发酵方式较容易受外界环境干扰尤其是气温以及湿度的影响，在气温较高时很容易染菌，导致其可控性差。而全封闭式的发酵罐培养方式要求发酵罐设备本身的成本较高，且已形成的生产工艺产量很难再有大幅度提升。为了进一步降低发酵成本、提高发酵单位，我们迫切地需要一种新型的固体发酵生产工艺来取代目前已成型的发酵工艺来应用于大规模生产芽孢杆菌以满足我国目前对芽孢杆菌的极大的需求量。而且，目前为止关于芽孢杆菌的半封闭式的固体发酵培养方式还未见报道。

传统的固体发酵和标准化的液体发酵，都不能解决产品性能不稳定和成本高等问题。利用食用菌的废弃菌包，结合液体发酵和固体发酵的工艺流程，优化出一套成本低、性能稳定的新型发酵工艺，对微生物产品在环保、农业、畜牧业等领域的普及推广起到很大的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低，产出高，性能稳定的利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法。

实现本发明目的的技术解决方案为：

一种利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤一：菌体复壮：在无菌条件下，从液体石蜡保存的芽孢杆菌试管中挑取一环芽孢杆菌于灭菌后的生理盐水中，然后放于80℃的恒温水浴锅中10 min，将此菌悬液摇匀并稀释成不同浓度，吸取100 uL分别涂布在无菌平皿中，37℃倒置恒温培养24h，个体较壮的菌落即可作为目的菌落；

步骤二：菌体扩培：挑取复壮后的目的菌划线于装有无菌固体LB培养基的茄形培养瓶中，37℃恒温倒置培养24h；用无菌水冲洗茄形瓶中的菌落，将冲洗下的菌悬液接入装有液体LB培养基的三角瓶中继续扩大培养，37℃恒温振荡培养24h。然后三角瓶中的菌悬液再接入200升的液体发酵罐中37℃恒温培养。24小时后再将此菌悬液接入2000升的液体发酵罐中；

步骤三：废弃菌包营养优化及预处理：配置营养基，液体营养液的成分为每升营养液中含大豆浸出液15%，葡萄糖5%，磷酸二氢钾0.5‰，氯化钠0.8%，维生素C 0.1‰，然后用计量喷枪将配置好的补充营养源打入废弃菌包，每包喷入200mL，将补充过营养基的菌包灭菌，121℃灭菌40min；其中大豆浸出液是指取20公斤的大豆，加水100升浸泡12小时之后用蒸汽煮30分钟，然后用网筛将豆渣过滤掉，得到的液体；

步骤四：接种：通过计量喷枪将发酵罐中的种子液按菌包容积的0.2%剂量注入灭菌后的菌包中；

步骤五：立体培养：将接种后的菌包传输到无菌房中立体培养48h；

步骤六：干燥粉碎：将培养好的菌包用沸腾干燥机干燥，并用粉碎机粉碎，制成粉末。

本发明与现有技术相比，其显著优点在于：

1、利用食用用菌菌包发酵，可控性强，水分、温度等容易控制在一定范围内；

2、不容易染菌，工作人员进出发酵车间，以及空气的流动都不容易染菌；

3、质量稳定，活菌含量起伏不大；

4、利用的废弃菌包，原料成本低廉；

5、后期处理方便，且不会因为阴天来不及干燥而大量染菌。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是本发明的流程图。

图2是本发明方法的工艺流程图。

具体实施方式

目前，全国有很多的食用菌生产基地，每年有大量的废弃食用菌菌包。这些食用菌包大部分作为废弃物被填埋或有部分食用菌菌包用来二次发酵，作为有机肥料。即使作为二次发酵的有机肥，附加值也极低，一般也只有150元/吨的价格，通过利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的新型工艺，可以将其附加值提高百倍以上。

并且食用菌与芽孢杆菌的培养模式相类似，并且两者发酵所需的技术参数（如营养成分、温度、湿度、酸碱度、通氧及水分等）也相近。

食用菌丝生长和子实体发育所需的营养包括氮素营养、糖类营养、矿质营养和少量的维生素类营养。氮素营养是食用菌合成蛋白质和核酸的原料，在栽培配料中麦麸、大豆粉等原料含有大量的氮素养料。蛋白胨和酵母粉也是食用菌最好的氮源。糖类主要指碳水化合物，它是食用菌生命活动的能源和构成细胞的主要成分。食用菌可利用培养料中的淀粉、纤维素、木质素。食用菌需要的矿质元素有磷、钾、钙、镁等，所以在培养中应加入一定量的磷酸二氢钾、硫酸钙、硫酸镁等矿质养料。食用菌也需要少量的维生素类物质，由于在培养料中如麦麸、豆粉中含有的维生素量基本可以满足食用菌生长需要，因而在栽培中常不再添加维生素类物质。

大多数食用菌菌丝体在5～32℃范围内均能生长，但最适温度基本维持在为22～25℃。食用菌菌丝生长阶段，培养料的含水量要求在60%～70%。

关于食用菌的酸碱度，无论是培养基或覆土材料均以pH值为6～7时最适合。这与芽孢杆菌所需的酸碱度也类似。

综上，若以回收的食用菌菌包二次灭菌后加入一定的营养成分后作为芽孢杆菌固体发酵的载体其生产成本将大大降低，利用废弃食用菌菌包生产芽孢杆菌还可实现生活废弃物的二次利用，原先的农业垃圾如今转化为多种微生物制剂，如：水产养殖或者多种废水的水质净化、饲料添加、生物肥料、生物农药等等。 

由于食用菌与芽孢杆菌的发酵技术参数相类似，使用这种半封闭式的发酵方式相对于开放式的固体发酵培养来说发酵的参数可控性明显提高，使得芽孢杆菌染菌的几率将大大降低同时其发酵的稳定性相较于全封闭式的发酵培养方式也会大大提高。

本发明一种利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法需要以下设备和材料。

1.1材料

1.1.1实验材料

食用菌废菌包购自连云港市灌南县恒奥达生物科技有限公司；芽孢杆菌为本公司用于水产养殖水质净化的枯草芽孢杆菌和用于饲料添加的地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、乳酸杆菌等等。

 1.1.2实验试剂

液体营养液（大豆分离蛋白水解液15%，葡萄糖5%，磷酸二氢钾  0.5‰，氯化钠0.8%，维生素C 0.1‰）； 

1.1.3实验设备

SW-CJ-2D型双人单面净化工作台；

风淋室；

立式压力蒸汽灭菌器；

DGX-9140鼓风干燥箱；

HZ-9211KB台式空气恒温振荡器；

JM-A6002电子天平；

SC-10水份快速测定仪；

HZ-9311K落地恒温振荡器；

LRH-250生化培养箱；

气浴恒温振荡器；

XSP-12CA光学显微镜；

卧式冷藏冷冻转换柜；

恒温水浴锅；

VH-500高效混合机；

CH-200槽型混合机；

GFG-220型高效沸腾干燥机；

灭菌锅；

LSCD2-04-A2蒸汽锅炉；

200升 2000升两联全自动发酵罐；

空气压缩机；

无菌空气呼吸器：120m3/min。

1.1.4 实验仪器

涂布棒、移液枪1000uL、移液枪100uL、平皿、试管20*200、三角瓶100mL、三角瓶250mL、茄形培养瓶250mL、三角瓶3L、三角瓶5L、烧杯、电炉、枪头、EP管1.2mL、WH-861旋涡混合器。

1.1.5培养基 

LB培养基（液体），pH 7.4-7.6；

蛋白胨10g/L；酵母提取物(Yeast extract) 10g/L；氯化钠(NaCl) 5g/L

LB培养基（固体），pH 7.4-7.6；

蛋白胨10g/L；酵母提取物(Yeast extract) 5g/L；氯化钠(NaCl) 10g/L；琼脂 15 g/L  。

本发明一种利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法；包括如下步骤：

步骤一：菌体复壮：在无菌条件下，从液体石蜡保存的芽孢杆菌试管中挑取一环芽孢杆菌于灭菌后的生理盐水中，然后放于80℃的恒温水浴锅中10 min，将此菌悬液摇匀并稀释成不同浓度，吸取100 uL分别涂布在无菌平皿中，37℃倒置恒温培养24h，个体较壮的菌落即可作为目的菌落；

步骤二：菌体扩培：挑取复壮后的目的菌划线于装有无菌固体LB培养基（蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L）的茄形培养瓶中，37℃恒温倒置培养24h；用无菌水冲洗茄形瓶中的菌落，将冲洗下的菌悬液接入装有液体LB培养基的三角瓶中继续扩大培养，37℃恒温振荡培养24h。然后三角瓶中的菌悬液再接入200升的液体发酵罐中37℃恒温培养。24小时后再将此菌悬液接入2000升的液体发酵罐中；

步骤三：废弃菌包营养优化及预处理：配置营养基，液体营养液的成分为每升营养液中含大豆浸出液15%，葡萄糖5%，磷酸二氢钾0.5‰，氯化钠0.8%，维生素C 0.1‰，然后用计量喷枪将配置好的补充营养源打入废弃菌包，每包喷入200mL，将补充过营养基的菌包灭菌，121℃灭菌40min；其中大豆浸出液是指取20公斤的大豆，加水100升浸泡12小时之后用蒸汽煮30分钟，然后用网筛将豆渣过滤掉，得到的液体；

步骤四：接种：通过计量喷枪将发酵罐中的种子液按菌包容积的0.2%剂量注入灭菌后的菌包中；

步骤五：立体培养：将接种后的菌包传输到无菌房中立体培养48h；

步骤六：干燥粉碎：将培养好的菌包用沸腾干燥机干燥，并用粉碎机粉碎，制成粉末；

检测活菌含量：取10g该产品于1L灭菌后的生理盐水中，37℃恒温振荡培养30 min，然后将此菌悬液梯度稀释成不同的倍数，用移液器分别吸取100 uL涂布在无菌的平皿中，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，用相同的办法可以多次取样检测活菌含量。

根据以上的检测方法检测到的活菌含量，活菌含量在260亿/g，杂菌含量3000万/g，

本发明的培养方法与现有技术的培养方法的对比结果如下：

结果分析

结果分析原有培养基菌包培养基培养基3000元/吨200元/吨水分含量60%35%活菌含量150亿/克260亿/克杂菌含量5亿/克0.3亿/克