砖红绒盖牛肝菌试管子实体原基的诱导方法

摘要

本发明涉及一种砖红绒盖牛肝菌试管子实体原基的诱导方法，属于野生食用菌培养技术领域。砖红绒盖牛肝菌，属于一种名贵野生食用菌，是云南省夏季市场上的主要美味菌类之一，由于其为松树外生菌根菌，目前不能人工培养，全靠野外自然采摘，因此价格昂贵。要保证牛肝菌能周年供应，满足大众餐桌所需，降低价格，只有实现人工培养。而牛肝菌的人工栽培，仍存在许多盲点问题：如菌丝在培养基上生长很缓慢；与共生树种的共生机理尚不完全清楚等。本发明的技术任务是，以野外采摘的子实体小组织块为材料，在试管培养基上直接诱导分化能发育成熟的子实体原基，具有直接、简易、生产成本低等特点，这为今后该菌的大规模室内人工培养奠定了重要基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种砖红绒盖牛肝菌试管子实体原基的诱导方法，属于生物技术领域，具体地说是属于野生食用菌室内培养范畴。

背景技术

牛肝菌隶属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，牛肝菌目(Boletales)，牛肝菌科(Boletaceae)，为世界广布大属，是一类与植物共生的菌根真菌。该属真菌味道鲜美，且含有抗氧化、抗肿瘤等生理活性物质，因而具有很高的经济价值和研究前景。目前，除少数腐生种如暗褐网柄牛肝菌外，其绝大部分种仍难以进行人工栽培，市售子实体完全依赖野外采收。云南的自然资源丰富，野生牛肝菌品种多，但因近年气候变化、生态破坏等原因其自然产量已经严重下降，导致售价昂贵。

砖红绒盖牛肝菌（Xerocomus spadiceus(Fr.) Quél.），在云南俗称红见手，为松树外生菌根菌，目前不能人工培养。其夏季于林中地上单生或群生，子实体中等至大型，菌盖直径5～17cm，半球形至扁平，土红色或砖红色，菌肉黄白色，受机械损伤后变成蓝色，菌柄长6～13cm，粗3～6cm，深玫瑰红色或暗紫红色，顶端有网纹，下部被绒毛，内实。砖红绒盖牛肝菌属于一种名贵野生食用菌，其在云南分布广，是云南省夏季市场上丰富多彩的主要美味菌类之一，由于全靠人工野外采摘，且个体生长受气候、生态环境影响大（如遇长期干旱，几乎不会生长），6月份刚上市时，其每千克鲜重售价在200～300元，在7～8月份产品较多时，价格也维持在90～150元，且食用期只有每年的6～9月，其它月份无自然产品。牛肝菌的干品味道较差，营养大大损失，人们很少食用。

因此，要保证牛肝菌能周年供应，满足大众餐桌所需，降低价格，只有实现人工培养。而牛肝菌的人工栽培，也像其它珍稀食用菌一样，存在许多盲点，一方面，菌丝在培养基上生长很缓慢，另一方面，菌丝的生长发育与共生树种的共生机理尚不完全清楚，因此至今仍没有人工培养的品种。

本发明在菌丝诱导过程中，偶然发现，砖红绒盖牛肝菌能在试管中直接诱导子实体原基，改进培养条件，原基能进一步发育为完全的子实体。这为今后砖红绒盖牛肝菌大规模的室内人工培养奠定了重要基础。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种直接、简易、生产成本低，能在试管中直接诱导长出子实体原基的方法。

本发明的技术任务是，以野外采摘的子实体小组织块为材料，在试管培养基上直接诱导分化子实体原基；

所述子实体小组织块的准备及切取方法为：野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部位，用解剖刀片轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.25～0.49cm²的小块；

所述试管培养基成分为：马铃薯80.00～100g/L、酶解松针粉35～40 g/L、发酵玉米复合粉15～20 g/L、CaCl₂ 1.00g /L、KH₂PO₄0.60g/L、16.0波美的麦芽汁 80～90ml/L、琼脂12.00 g/L，控制PH值为5.40～5.60；

所述培养基中酶解松针粉的制备方法如下：在牛肝菌生长地收集松针，烘干，粉碎；按1：4～1：6的重量体积比加入水，混成糊状，用超声波处理65～75min，再加入8～10倍水，调节PH值为4.0～4.6，于50～53℃水浴中，按6.0～7.0%的重量体积比加入纤维素酶，酶解120～140 min后，将水浴温度升至92～95℃，至水分基本蒸干时移入73～75℃烘箱中，干燥30～32hr；所述发酵玉米复合粉的制备方法如下：将玉米面、小麦面、黄豆粉按2：1：1比例混合，按1：1～1：1.5的混合物重量体积比加入水，拌匀，在蒸锅中蒸20～30分钟，取出，待温度冷至30～35℃时，按说明书掺入适量的酒曲粉，拌匀后放入干净的瓷罐或泡菜罐中，密封好，放在28～30℃的培养箱中，发酵4～6天，将发酵物在55～60℃烘箱中烘干，粉碎，过80目分样筛；

所述子实体原基的诱导方法为：将切取的小组织块，轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面，在温度为22～23℃下暗培养8～10天，待菌块周围有极少白色菌丝萌发，培养基渐变成浅褐色时，每天将试管放置于400～600Lx的弱光下10hr，5～7天后，每天将试管放置于1600～2000Lx的较强光照下10hr，10～15天，即从原组织块上长出1～2个菌柄高0.8～1.2cm，直径0.30～0.5cm的小子实体原基。

本发明的有益效果是：在试管培养条件下，利用子实体小组织块，直接诱导分化子实体原基，其特点如下：

（1）简单直接：不经过菌丝体阶段，直接从原子实体小组织块，脱分化出子实体原基，原基继而可以长成幼小的全子实体；

（2）易实现：本发明的特点在于，小组织块一萌发出菌丝 ，即开始放入人工气候箱控光，操作容易； 

（3）生产成本低：本发明的试管培养基成分取自天然的松针及食用玉米等，不会增加培养成本；人工气候箱是实验室常规设备，不需额外增设大型设备支出。

具体实施方式

以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实例一：

野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部位，用解剖刀片轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.25cm²的小块；

将切取的小组织块，轻轻嵌入18×180mm的试管斜面诱导培养基表面，所述的培养基成分为：马铃薯80.00g/L、酶解松针粉35 g/L、发酵玉米复合粉15 g/L、 CaCl₂ 1.00g /L、KH₂PO₄0.60g/L、16.0波美的麦芽汁 80ml/L、琼脂12.00 g/L，控制PH值为5.40；所述酶解松针粉的制备方法如下：在牛肝菌生长地收集松针，烘干，粉碎；按1：4的重量体积比加入水，混成糊状，用超声波处理65min，再加入8倍水，调节PH值为4.0，于50℃水浴中，按6.0%的重量体积比加入纤维素酶，酶解120min后，将水浴温度升至92℃，至水分基本蒸干时移入73℃烘箱中，干燥30hr；所述发酵玉米复合粉的制备方法如下：将玉米面、小麦面、黄豆粉按2：1：1比例混合，按1：1的混合物重量体积比加入水，拌匀，在蒸锅中蒸20分钟，取出，待温度冷至30℃时，按说明书掺入适量的酒曲粉，拌匀后放入干净的瓷罐或泡菜罐中，密封好，放在28℃的培养箱中，发酵4天，将发酵物在55℃烘箱中烘干，粉碎，过80目分样筛；

将接种小组织块的试管放置在温度为22～23℃下暗培养8天，待菌块周围有极少白色菌丝萌发，培养基渐变成浅褐色时，每天将试管放置于400Lx的弱光下10hr，5天后，每天将试管放置于1600Lx的较强光照下10hr，10天，即从原组织块上长出1个菌柄高0.8cm，直径0.30cm的小子实体原基。

实例二：

野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部位，用解剖刀片轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.35cm²的小块；

将切取的小组织块，轻轻嵌入18×180mm的试管斜面诱导培养基表面，所述的培养基成分为：马铃薯90.00g/L、酶解松针粉38 g/L、发酵玉米复合粉17g/L、 CaCl₂ 1.00g /L、KH₂PO₄0.60g/L、16.0波美的麦芽汁85ml/L、琼脂12.00 g/L，控制PH值为5.60；所述酶解松针粉的制备方法如下：在牛肝菌生长地收集松针，烘干，粉碎；按1：5的重量体积比加入水，混成糊状，用超声波处理70min，再加入9倍水，调节PH值为4.2，于52℃水浴中，按6.5%的重量体积比加入纤维素酶，酶解130 min后，将水浴温度升至93℃，至水分基本蒸干时移入74℃烘箱中，干燥31hr；所述发酵玉米复合粉的制备方法如下：将玉米面、小麦面、黄豆粉按2：1：1比例混合，按1：1.5的混合物重量体积比加入水，拌匀，在蒸锅中蒸25分钟，取出，待温度冷至32℃时，按说明书掺入适量的酒曲粉，拌匀后放入干净的瓷罐或泡菜罐中，密封好，放在29℃的培养箱中，发酵5天，将发酵物在58℃烘箱中烘干，粉碎，过80目分样筛；

将接种小组织块的试管放置在温度为22～23℃下暗培养9天，待菌块周围有极少白色菌丝萌发，培养基渐变成浅褐色时，每天将试管放置于500Lx的弱光下10hr，6天后，每天将试管放置于1800Lx的较强光照下10hr，13天，即从原组织块上长出2个菌柄高1.0cm，直径0.40cm的小子实体原基。

实例三：

野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部位，用解剖刀片轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.49cm²的小块；

将切取的小组织块，轻轻嵌入18×180mm的试管斜面诱导培养基表面，所述的培养基成分为：马铃薯100g/L、酶解松针粉40 g/L、发酵玉米复合粉20 g/L、 CaCl₂ 1.00g /L、KH₂PO₄0.60g/L、16.0波美的麦芽汁 90ml/L、琼脂12.00 g/L，控制PH值为5.40；所述酶解松针粉的制备方法如下：在牛肝菌生长地收集松针，烘干，粉碎；按1：6的重量体积比加入水，混成糊状，用超声波处理75min，再加入10倍水，调节PH值为4.6，于53℃水浴中，按7.0%的重量体积比加入纤维素酶，酶解140 min后，将水浴温度升至95℃，至水分基本蒸干时移入75℃烘箱中，干燥32hr；所述发酵玉米复合粉的制备方法如下：将玉米面、小麦面、黄豆粉按2：1：1比例混合，按1：1.3的混合物重量体积比加入水，拌匀，在蒸锅中蒸30分钟，取出，待温度冷至35℃时，按说明书掺入适量的酒曲粉，拌匀后放入干净的瓷罐或泡菜罐中，密封好，放在30℃的培养箱中，发酵6天，将发酵物在60℃烘箱中烘干，粉碎，过80目分样筛；

将接种小组织块的试管放置在温度为22～23℃下暗培养10天，待菌块周围有极少白色菌丝萌发，培养基渐变成浅褐色时，每天将试管放置于600Lx的弱光下10hr，7天后，每天将试管放置于1900Lx的较强光照下10hr，15天，即从原组织块上长出2个菌柄高1.2cm，直径0.5cm的小子实体原基。

实例四：

野外采摘生长健壮、无虫害、未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄部位，用解剖刀片轻轻去除菌盖中部表皮，从菌盖中部取十字，将子实体一分为四，取菌柄与菌盖交接处的内部无菌组织块，切成0.45cm²的小块；

将切取的小组织块，轻轻嵌入18×180mm的试管斜面诱导培养基表面，所述的培养基成分为：马铃薯95.00g/L、酶解松针粉37g/L、发酵玉米复合粉16g/L、 CaCl₂ 1.00g /L、KH₂PO₄0.60g/L、16.0波美的麦芽汁 83ml/L、琼脂12.00 g/L，控制PH值为5.60；所述酶解松针粉的制备方法如下：在牛肝菌生长地收集松针，烘干，粉碎；按1：6的重量体积比加入水，混成糊状，用超声波处理68min，再加入8.5倍水，调节PH值为4.4，于51℃水浴中，按6.8%的重量体积比加入纤维素酶，酶解135 min后，将水浴温度升至93℃，至水分基本蒸干时移入73℃烘箱中，干燥31hr；所述发酵玉米复合粉的制备方法如下：将玉米面、小麦面、黄豆粉按2：1：1比例混合，按1：1.5的混合物重量体积比加入水，拌匀，在蒸锅中蒸28分钟，取出，待温度冷至33℃时，按说明书掺入适量的酒曲粉，拌匀后放入干净的瓷罐或泡菜罐中，密封好，放在29℃的培养箱中，发酵5天，将发酵物在58℃烘箱中烘干，粉碎，过80目分样筛；

将接种小组织块的试管放置在温度为22～23℃下暗培养9天，待菌块周围有极少白色菌丝萌发，培养基渐变成浅褐色时，每天将试管放置于550Lx的弱光下10hr，6天后，每天将试管放置于2000Lx的较强光照下10hr，13天，即从原组织块上长出2个菌柄高1.1cm，直径0.40cm的小子实体原基。