提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法

摘要

本发明公开了一种提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，在酸化重金属尾矿中加入TE1缓冲液，涡旋振荡并离心处理后，加入TE2提取缓冲液和溶菌酶进行水浴处理；在液氮中冷却后在沸水浴中放置处理多次；加入SDS和蛋白酶K消化后进行离心处理；取离心后的上清液依次进行加入预冷的8mol/L KAc进行冰浴后进行离心处理、加入酚氯仿异戊醇进行离心处理、加入氯仿异戊醇进行离心处理、加入3mol/L NaAc和预冷异丙醇。进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀后自然晾干，加入TE溶解沉淀。操作简单，能够有效地避免酸化重金属尾矿的重金属、高盐分、低pH等的影响，提取的DNA条带清晰、完整性好、纯度高、杂质含量少。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酸化重金属尾矿的处理方法，尤其涉及一种提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法。

背景技术

基因组总DNA提取是PCR技术、限制性内切、分子杂交等分子生物学研究的基础，酸化重金属尾矿有其相对于土壤更特殊的环境，主要表现为高盐分、重金属种类多及含量高、高硫酸盐含量和低pH。在此条件下，酸化重金属尾矿中基因组总DNA总量相比较土壤要少，溶菌酶和其他酶的活性受到抑制。

现有技术中，普通的土壤基因组总DNA方法步骤如下：

（1）取1.0g土样，倒入灭菌的50mL离心管中，加入10mLTENPP缓冲液[TENPP缓冲液组成：20mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸），50mmol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷），1%PVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮），100mmol/L NaCl（氯化钠），pH10.0]用振荡仪振荡数分钟，使土样悬浮并充分混匀。

（2）10000r/min离心5min，弃上清，重复洗涤3-5次，至上清液基本无色。

（3）加入5mL PBS缓冲液[缓冲液组成：2.7mmol/L KCl（氯化钾），100mmol/LNaCl，2mmol/L KH₂PO₄(磷酸二氢钾)，10mmol/L Na₂HPO₄（磷酸氢二钠），pH7.4]漂洗，10000r/min离心5min，弃上清。

（4）加入13.5mL DNA提取缓冲液[100mmol/L Tris，100mmol/L EDTA，100mmol/LNa₃PO₄（磷酸钠），1.5mol/L NaCl，1%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，pH8.0]，混匀后液氮反复冻融3次，加入100μL蛋白酶K（25mg/mL）和200μL溶菌酶（50mg/mL，pH8.0），37℃水浴30min，期间颠倒混匀3次。

（5）加入2mL20%SDS（十二烷基苯磺酸钠），65℃水浴2h，期间颠倒混匀5-6次，8000r/min室温15min，取上清至新管。

（6）用等体积氯仿异戊醇（氯仿:异戊醇体积比为24:1）抽提，吸出水层，加入0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀1h或更长。

（7）11000r/min4℃离心20min，沉淀DNA，去上清，用70%乙醇漂洗，11000r/min4℃离心5min，并重复漂洗1次，置于超净工作台吹干。

（8）干燥后，用100μL ddH₂O（重蒸水）[含RNase(核糖核酸酶)20mg/mL]溶解，转入1.5mL离心管，37℃放置30min。

取3μL用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，表明上述现有技术中的土壤DNA提取方法不能有效地提取酸化重金属尾矿中的DNA。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，该方法操作简单，能够有效地避免酸化重金属尾矿的重金属、高盐分、低pH等的影响，提取的DNA条带清晰、完整性好、纯度高、杂质含量少，可用于PCR检测，PCR特异性产物明显，可满足分子生物学实验的需要。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，包括步骤：

A、在酸化重金属尾矿中加入TE1缓冲液，涡旋振荡并离心处理1至3次，弃上清液；

B、加入TE2提取缓冲液和溶菌酶，放入37℃恒温水浴锅中水浴处理；

C、在液氮中冷却后，在沸水浴中放置处理，如此重复多次；

D、加入SDS和蛋白酶K，放入65℃恒温水浴锅中消化，降至常温后进行离心处理；

E、取步骤D中离心后的上清液加入预冷的8mol/L KAc（醋酸钾）进行冰浴后，进行离心处理；

F、取步骤E离心后的上清液加入酚氯仿异戊醇，进行离心处理；

G、取步骤F离心后的上清液加入氯仿异戊醇，进行离心处理；

H、取步骤G离心后的上清液加入3mol/L NaAc（醋酸钠）和预冷异丙醇，室温沉淀2h；

I、进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入TE溶解沉淀。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，在酸化重金属尾矿中加入TE1缓冲液，涡旋振荡并离心处理1至3次，弃上清液；加入TE2提取缓冲液和溶菌酶，放入37℃恒温水浴锅中水浴处理；在液氮中冷却后，在沸水浴中放置处理，如此重复多次；加入SDS和蛋白酶K，放入65℃恒温水浴锅中消化，降至常温后进行离心处理；取步骤D中离心后的上清液加入预冷的8mol/LKAc进行冰浴后，进行离心处理；取步骤E离心后的上清液加入酚氯仿异戊醇，进行离心处理；取步骤F离心后的上清液加入氯仿异戊醇，进行离心处理；取步骤G离心后的上清液加入3mol/L NaAc和预冷异丙醇，室温沉淀2h；进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入TE溶解沉淀。操作简单，能够有效地避免酸化重金属尾矿的重金属、高盐分、低pH等的影响，提取的DNA条带清晰、完整性好、纯度高、杂质含量少，可用于PCR检测，PCR特异性产物明显，可满足分子生物学实验的需要。

附图说明

图1为现有技术中使用普通土壤提取方法提取酸化重金属尾矿基因组总DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳示意图；

图2为本发明实施例一中酸化重金属尾矿基因组总DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳示意图；

图3为本发明实施例三中酸化重金属尾矿基因组总DNA的16S rRNA扩增PCR产物电泳示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。

本发明的提取酸化重金属尾矿中基因组总DNA的方法，其较佳的具体实施方式包括步骤：

A、在酸化重金属尾矿中加入TE1缓冲液，涡旋振荡并离心处理1至3次，弃上清液；

B、加入TE2提取缓冲液和溶菌酶，放入37℃恒温水浴锅中水浴处理；

C、在液氮中冷却后，在沸水浴中放置处理，如此重复多次；

D、加入SDS（十二烷基苯磺酸钠）和蛋白酶K，放入65℃恒温水浴锅中消化，降至常温后进行离心处理；

E、取步骤D中离心后的上清液加入预冷的8mol/L KAc进行冰浴后，进行离心处理；

F、取步骤E离心后的上清液加入酚氯仿异戊醇，进行离心处理；

G、取步骤F离心后的上清液加入氯仿异戊醇，进行离心处理；

H、取步骤G离心后的上清液加入3mol/L NaAc和预冷异丙醇，室温沉淀2h；

I、进行离心处理后，弃去离心后的上清液，用乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入TE（TE为Tris-EDTA缓冲液，市场购买，组成成分：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA，PH=8.0）溶解沉淀。

具体包括步骤：

A、取0.5g酸化重金属尾矿，置于1.5mL离心管中，加入1mL TE1缓冲液，涡旋振荡5min，6000r/min离心5min，弃上清液，再加入1mlTE1缓冲液，涡旋振荡5min，6000r/min离心5min，弃上清液；

B、加入600μL TE2提取缓冲液和10μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，放入恒温水浴锅中37℃水浴1h，每10min颠倒混匀一次；

C、在液氮中冷却5min，迅速在沸水浴中放置5min，如此重复3次；

D、加入120μL20%SDS和10μL100mg/mL蛋白酶K，放入恒温水浴锅中65℃消化1h，期间每10min颠倒混匀一次，降至常温后，8000r/min离心10min；

E、取步骤D中离心后的上清液加入0.2倍体积的预冷的8mol/L KAc，冰浴20min，10000r/min4℃离心10min；

F、取步骤E离心后的上清液加入等体积的酚氯仿异戊醇（酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1），12000r/min离心10min；

G、取步骤F离心后的上清液加入等体积的氯仿异戊醇（氯仿:异戊醇体积比为24:1），12000r/min离心10min；

H、取步骤G离心后的上清液加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.6倍体积的预冷异丙醇，室温沉淀2h；

I、14000r/min4℃离心10min，弃去离心后的上清液，用500μL浓度为70%的乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入50μLTE溶解沉淀。

所述TE1缓冲液配方：0.1mol/L磷酸缓冲液，3mol/L EDTA，0.1mol/L Tris-HCl，pH=8.0：

所述TE2提取缓冲液配方：0.1mol/L磷酸缓冲液，3mol/L EDTA，0.1mol/L Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，1%CTAB，pH=8.0；

酸化重金属尾矿中的基因组总DNA的提取与普通土壤的提取的差别在于，酸化重金属尾矿的重金属种类多、含量高，高盐分，呈酸性，酸化重金属尾矿中的基因组总DNA含量比普通土壤低。酸化重金属尾矿中的重金属以及酸性环境会抑制溶菌酶的活性，要获得高浓度的基因组总DNA，首先需要去除重金属、调节电导率和pH，避免其对溶菌酶活性的影响。EDTA能有效地螯合重金属，在提取尾矿重金属之前使用具有高浓度EDTA的缓冲液可以去除尾矿中大量的重金属。使用本发明的缓冲液可以有效稳定样品的pH和电导率。同时为保证基因组总DNA的纯度，蛋白酶K、SDS和酚氯仿异戊醇（酚:氯仿:异戊醇体积比为25﹕24﹕1）可以去除大量的蛋白质，CTAB、KAc也可以有效地去除多糖类物质。本发明操作简单，获得的DNA条带清晰，完整性好，纯度高，杂质含量少。

具体实施例：

实施例一，提取酸化重金属尾矿基因组总DNA，包括步骤：

（1）取0.5g左右酸化重金属尾矿，置于1.5mL离心管中，加入1mL TE1缓冲液，涡旋振荡5min，6000r/min离心5min，弃上清液，再加入1mlTE1缓冲液，涡旋振荡5min，6000r/min离心5min，弃上清。

（2）加入600μL TE2提取缓冲液和10μL溶菌酶（100mg/mL）放入恒温水浴锅中37℃水浴1h，每10min颠倒混匀一次。

（3）在液氮中冷却5min，迅速在沸水浴中放入5min，如此重复3次。

（4）加入120μL20%SDS和10μL100mg/mL蛋白酶K，放入恒温水浴锅中65℃消化1h，期间每10min颠倒混匀一次。降至常温，8000r/min离心10min。

（5）取上述离心后的上清液加入0.2倍体积的预冷的8mol/L KAc，冰浴20min，10000r/min4℃离心10min。

（6）取上述离心后的上清液加入等体积的酚氯仿异戊醇（酚:氯仿:异戊醇体积比为25﹕24﹕1），12000r/min离心10min。

（7）取上述离心后的上清液加入等体积的氯仿异戊醇（氯仿:异戊醇体积比为24：1），12000r/min离心10min。

（8）取上述离心后的上清液加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.6倍体积的预冷异丙醇，室温沉淀2h。

（9）14000r/min4℃离心10min，弃去上述离心后的上清液，用500μL70%乙醇洗涤沉淀3次，自然晾干，加入50μLTE溶解沉淀。

取3μL用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，表明用本发明方法得到的DNA亮度高，比较丰富，比较清晰，样品间的重复性较好。

与现有技术中传统的土壤DNA提取方法相比，本方法提取的DNA有更好的稳定性，提取出来的DNA浓度较高。

实施例二，测定样品中基因组总DNA的浓度和纯度：

利用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，分别测提取的DNA溶液在260nm、280nm时的吸光值，本发明方法提取DNA的吸光值如表1所示，传统的土壤DNA提取方法获得的DNA的吸光值如表2所示，计算得到DNA样品的浓度和纯度。

表1本发明方法提取的酸化重金属尾矿基因组总DNA的纯度和浓度

表2现有技术中传统的土壤DNA提取方法提取的酸化重金属尾矿基因组总DNA的纯度和浓度

结论：与现有技术中传统的土壤DNA提取方法相比较，本发明方法提取的DNA纯度更高，浓度较大，效果很理想。

实施例三，酸化重金属尾矿基因组总DNA的16S rRNA的PCR产物检测：

使用细菌通用引物27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和1492R:5’-GGTTAC CTT GTT ACG ACT T-3’；PCR反应体系总体积50μL，25μL Mix（10×Buffer，dNTP，Mg²⁺，TaqDNA聚合酶），DNA模板2μL，引物各2μL，灭菌双蒸水19μL。PCR反应体系：94℃变性60s，50℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。取5μL产物于0.8%琼脂糖凝胶中电泳检测。

结果：如图3所示，样品均实现有效扩增，扩增产物条带清晰，片段约1500bp左右，特异性片段长度一致，说明本方法提取的酸化重金属尾矿中的基因组总DNA能够满足后续PCR实验等。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。