一株嗜热烟曲霉及其在生产纤维素酶中的应用

摘要

本发明公开了一株嗜热烟曲霉及其在生产纤维素酶中的应用。本发明提供的烟曲霉（Aspergillus funigatus）HS-1，保藏号为CGMCC No.7563。本发明还保护烟曲霉HS-1在制备纤维素酶中的应用。本发明还保护一种制备纤维素酶的方法，包括如下步骤：发酵烟曲霉HS-1，收集发酵产物，得到纤维素酶。本发明提供的菌株在以玉米芯为唯一碳源的培养基中可诱导产生纤维素酶,最高产酶活力1.004U/mL。该酶最适pH5.0、在pH3-8有活力，最适温度60℃，具有高温纤维素酶的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一株嗜热烟曲霉及其在生产纤维素酶中的应用。

背景技术

纤维素酶(cellulase)是一种能够将纤维素降解为葡萄糖的复合酶系，主要有三个 组分组成，即：（1）内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-D-glucanase，EG,EC3.2.1.4)，也 称CMC酶；（2）外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase,EC3.2.1.91)或纤维二糖水解酶 (cello-biohydrolases,CBH)；（3）葡萄糖苷酶(β-1,4-D-glucosidase,BG,EC 3.2.1.21)，也叫水杨甙酶。以上三种酶中，每一类都有多个同工酶。内切酶将长链纤 维素从内部切断，外切酶自纤维素链的还原端或非还原端切下二糖或寡糖，葡萄糖苷 酶将纤维二糖或寡糖水解为葡萄糖。随着纤维素酶在工业上的广泛应用（如：食品、 饲料、酿造、造纸，特别是在纺织工业和生物能源上的应用），纤维素酶已经成为最近 十几年酶工程研究的一个热点。

到目前为止，已发现了多种能够产生纤维素酶的微生物，涵盖了厌氧与好氧、原 核与真核微生物。在产生纤维素酶的微生物中，不同菌株所产纤维素酶具有不同的作 用方式与底物特异性。纤维素酶根据其酶学性质与应用环境，又被分为酸性纤维素酶、 中性纤维素酶与碱性纤维素酶。酸性纤维素酶主要用于生物能源、纺织水洗等。中性 纤维素酶主要用于纺织水洗工业。碱性纤维素酶则可用于洗涤剂中。

工业生产上常用的产纤维素酶微生物是常温、中温丝状真菌，它们能够产生完整 的纤维素酶系，可以将结晶纤维素完全降解为葡萄糖，如木霉（Trichoderma sp.）、 青霉（Penicillium sp.）、腐质霉（Humicola sp.）等等。上述菌株产生的纤维素酶 大多需要在50℃以下发挥较好的效能，而在较高的温度下容易失活。

高温酶往往是由高温菌产生的。高温菌一般是指在55℃以上能良好生长，而在 19℃不能生长的微生物。高温纤维素酶在生物能源领域具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株嗜热烟曲霉及其在生产纤维素酶中的应用。

本发明提供的烟曲霉（Aspergillus funigatus）HS-1已于2013年5月7日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC  No.7563。烟曲霉（Aspergillus funigatus）HS-1CGMCC No.7563简称烟曲霉HS-1。

本发明还保护烟曲霉HS-1在制备纤维素酶中的应用。

所述应用的方法为：发酵烟曲霉HS-1，收集发酵产物，得到纤维素酶。所述发酵 的条件如下：40-55℃、100-300r/min振荡培养5-9天。所述发酵的条件具体如下： 45℃、180r/min振荡培养5-6天。所述发酵采用的培养基为以玉米芯为唯一碳源或主 要碳源的培养基。所述发酵采用的培养基具体按照如下方法制备：将玉米芯、酵母粉、 硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混合，得到培养基，所述玉米芯在所述培 养基中的浓度为20-80g/L（如50/L），所述酵母粉在所述培养基中的浓度为1-10g/L （如5g/L），所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为1-10g/L（如2.8g/L），所述磷酸二 氢钾在所述培养基中的浓度为1-10g/L（如4g/L），所述氯化钙在所述培养基中的浓度 为0.1-2g/L（如0.9g/L），所述硫酸镁在所述培养基中的浓度为0.1-2g/L（如0.9g/L）。

本发明还保护一种制备纤维素酶的方法，包括如下步骤：发酵烟曲霉HS-1，收集 发酵产物，得到纤维素酶。所述发酵的条件如下：40-55℃、100-300r/min振荡培养 5-9天。所述发酵的条件具体如下：45℃、180r/min振荡培养5-6天。所述发酵采用 的培养基为以玉米芯为唯一碳源或主要碳源的培养基。所述发酵采用的培养基具体按 照如下方法制备：将玉米芯、酵母粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混 合，得到培养基，所述玉米芯在所述培养基中的浓度为20-80g/L（如50/L），所述酵 母粉在所述培养基中的浓度为1-10g/L（如5g/L），所述硫酸铵在所述培养基中的浓度 为1-10g/L（如2.8g/L），所述磷酸二氢钾在所述培养基中的浓度为1-10g/L（如4g/L）， 所述氯化钙在所述培养基中的浓度为0.1-2g/L（如0.9g/L），所述硫酸镁在所述培养 基中的浓度为0.1-2g/L（如0.9g/L）。在所述收集发酵产物后还包括如下步骤：离心 所述发酵产物，收集上清液，即为含有所述纤维素酶的溶液。所述离心的参数具体如 下：5000g离心20min。

以上任一所述方法制备得到的纤维素酶也属于本发明的保护范围。本发明提供的 纤维素酶在50-70℃具有较高酶活力、在60℃具有最高酶活力，在pH4.0-4.5具有较 高酶活力，在pH5具有最高酶活力。

本发明还保护一种用于发酵烟曲霉HS-1制备纤维素酶的发酵培养基，按照如下方 法制备：将玉米芯、酵母粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁和水混合，得到 培养基，所述玉米芯在所述培养基中的浓度为20-80g/L（如50/L），所述酵母粉在所 述培养基中的浓度为1-10g/L（如5g/L），所述硫酸铵在所述培养基中的浓度为1-10g/L （如2.8g/L），所述磷酸二氢钾在所述培养基中的浓度为1-10g/L（如4g/L），所述氯 化钙在所述培养基中的浓度为0.1-2g/L（如0.9g/L），所述硫酸镁在所述培养基中的 浓度为0.1-2g/L（如0.9g/L）。

本发明通过对高温环境中采集的土样进行有目的的筛选研究，对采自美国黄石公 园腐殖土土样进行富集培养，发现了一株可以利用玉米芯产生纤维素酶的高温菌，鉴 定其为烟曲霉。本发明提供的菌株在以玉米芯为唯一碳源的培养基中可诱导产生纤维 素酶,最高产酶活力1.004U/mL。应用所述菌株生产的纤维素酶的最适为pH5.0、在 pH3-8有活力，最适温度为60℃，具有高温纤维素酶的特点。

附图说明

图1为烟曲霉HS-1所产纤维素酶的温度-酶活图。

图2为烟曲霉HS-1所产纤维素酶的pH-酶活图。

图3为烟曲霉HS-1所产纤维素酶的热稳定性。

图4为602-X降解纤维素后产生的透明圈。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

实施例1、嗜热烟曲霉HS-1的获得和鉴定

一、菌株HS-1的获得

土样：采自云南腾冲腐殖土。

平皿筛选培养基：纤维素粉10g/L、葡萄糖20g/L、土豆汁1L、琼脂20g/L；pH 自然；115℃灭菌15分钟；在直径9cm的平皿中加入该培养基15ml。

将土样配制成10-2-10-5浓度的悬液，取0.1ml涂皿，放入45℃培养箱培养2-3天 （照片见图4，右图为对照，左图可以看到很清晰的透明圈）后得到一株产酸性高温 纤维素酶的菌株，将其命名为菌株HS-1。

二、菌株HS-1的鉴定

1、形态特征鉴定

菌株在PDA培养基上生长迅速，开始为白色绒毛状，2天后转为绿色，背面为黄 色或紫色。分生孢子呈绿色球形，顶囊呈烧瓶状，小梗单层。

2、分子鉴定

利用天根植物基因组试剂盒提取菌株HS-1的基因组DNA，作为PCR扩增模板，采 用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3') 组成的引物对进行ITS序列的扩增。反应条件：94℃2min，94℃30s，59℃30s，72℃ 90s，72℃7min。扩增产物的测序结果见序列表中的序列1。对测定的序列进行BLAST 软件比较分析，并用MEGA3.1软件进行同源性分析，菌株HS-1与Aspergillus  fumigatus相似性达99%。

根据形态特征鉴定和分子鉴定的结果，菌株HS-1属于烟曲霉（Aspergillus funigatus）。

烟曲霉（Aspergillus funigatus）HS-1已于2013年5月7日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7563。烟曲 霉（Aspergillus funigatus）HS-1CGMCC No.7563简称烟曲霉HS-1。

实施例2、烟曲霉HS-1在生产纤维素酶中的应用

一、种子培养

将烟曲霉HS-1接种到PDA斜面上，45℃培养5d。

二、发酵

将种子斜面挖块接入发酵培养基，45℃、180r/min旋转摇床培养5天，然后5000g 离心20min，收集上清液。

发酵培养基：取玉米芯50g、酵母粉5g、硫酸铵2.8g、磷酸二氢钾4g、氯化钙 0.9g、硫酸镁0.9g，溶于水并用水定容至1L；pH4.5。

三、酶活力的测定

酶活力的测定（反应温度为50℃，反应pH为4.8）：以50mg滤纸（新华1号）为 底物，加入1ml pH4.8、0.05mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，50℃水浴3min；然后加入 步骤二得到的上清液的稀释液(用pH4.8、0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行稀 释)0.5ml，50℃水浴60min（即反应温度为50℃）；然后加入3ml DNS溶液以终止反应， 混匀，在沸水浴10min显色；冷却后，加入10ml水，摇匀，采用721分光光度计检测 540nm处的吸光值，对照标准曲线（用葡萄糖作为标准品制作标准曲线）计算还原糖 的量，进一步上清液的酶活力。

酶活力单位的定义：在上述条件下，每小时水解滤纸产生1mg还原糖的酶量为一 个酶活力单位(U/mL)。

步骤二得到的上清液的酶活力为1.044U/mL。

实施例3、纤维素酶的酶学性质

1、最适反应温度

将实施例2的步骤二得到上清液浓缩后得到浓缩液，参照实施例2的步骤三的酶 活力测定方法检测浓缩液的酶活，差异仅在于分别采用如下反应温度：30℃、40℃、 50℃、60℃和70℃。

结果如图1所示。由烟曲霉HS-1产生的纤维素酶在60℃时具有最高酶活。

2、最适反应pH

将实施例2的步骤二得到上清液浓缩后得到浓缩液，参照实施例2的步骤三的酶 活力测定方法检测浓缩液的酶活，差异仅在于分别采用如下缓冲液替换“pH4.8、0.05mM 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液”：pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0的0.05M磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液。

结果如图2所示。由烟曲霉HS-1产生的纤维素酶的最适pH为5.0，在此pH值下 具有最高酶活。

3、酶的热稳定性

将实施例2的步骤二得到上清液分别于40℃、50℃、60℃或70℃放置一定时间（1h、 2h、3h、4h或5h），然后按照实施例2的步骤三的酶活力测定方法检测，以未放置的 上清液的酶活作为100%，计算在不同温度孵育不同时间后的上清液的相对酶活。

结果如图3所示。由烟曲霉HS-1产生的纤维素酶的在40-50℃热稳定性较强。