法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-07-15
授权
授权
2013-11-27
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/113 申请日:20120127
实质审查的生效
2013-10-30
公开
公开
技术领域
本发明提供一种能够降低或抑制（a）支链氨基转移酶-1（BCAT1）的生物 活性或（b）编码BCAT1的基因的表达以用在治疗脑肿瘤的方法中的化合物。
背景技术
在人类恶性脑肿瘤中，恶性的人类胶质母细胞瘤占据的数量最多。迄今为 止，神经胶质瘤的治疗包括神经外科技术（切除术或立体定向手术）、放射疗法 和化学疗法。例如，治疗星形细胞肿瘤的现行标准包括外科肿瘤切除，外科肿 瘤切除后可以进行采用口服烷化剂替莫唑胺（TMZ）的化学疗法和放射疗法。 然而，胶质母细胞瘤被认为是不能治愈的，因为胶质母细胞瘤不能对电离辐射、 化学疗法和外科切除做出反应。换句话说，采用这些疗法只能非常有限地延长 患者的寿命。这意味着尽管进行了这些疗法，但癌症诊断后的平均寿命期限仅 仅为12个月至16个月。
因此，本发明所基于的技术问题是提供用于治疗脑肿瘤、优选胶质母细胞 瘤或星形细胞脑肿瘤的方法，该方法克服了现有疗法的缺点，提高了患者的存 活。
发明内容
通过提供以所述权利要求为特征的实施方式，实现了该技术问题的解决方 法。
在得出本发明的实验期间发现，迄今为止，已经作为例如抗惊厥药物而使 用的已知的BCAT1抑制剂（如加巴喷丁）表示了用于癌症治疗的新颖的治疗选 择，即普遍地用于瘤形成、尤其用于治疗脑肿瘤（如星形细胞脑肿瘤）的有效 疗法。该抑制剂可以通过靶向分子路径起作用，任何已建立的化学疗法并不靶 向该分子路径。
附图说明
图1：IDHwt星形细胞神经胶质瘤的特征在于高的BCAT1表达。
（a）BCAA分解代谢的示意图。BCAA，支链氨基酸；BCKA，支链酮酸。
（b，c）70个星形细胞神经胶质瘤（41个IDHwt和29个IDHmut）中的BCAT1 的RNA表达（b）和BCAT2的RNA表达（c）标准化至正常大脑中的表达 （虚线）。数据用平均值±标准偏差来表示（双尾Student t检验）。*，P<0.05； ***，P<0.001。（d）示出具有IDH1野生型基因和IDH2野生型基因（条带 1-5）、IDH2基因的不同突变(条带6-7)或IDH1基因的不同突变(条带8-12) 的星形细胞神经胶质瘤中和在正常大脑(条带13)中的BCAT1蛋白质表达 的免疫印迹。AII，弥漫性星形细胞瘤WHO（世界卫生组织）II级；AAIII， 间变性星形细胞瘤WHO III级；sGBIV，继发性胶质母细胞瘤WHO IV级； pGBIV，原发性胶质母细胞瘤WHO IV级；AOIII，间变性少突神经胶质瘤 WHO III级。（e-h）BCAT1在IDHwt原发性胶质母细胞瘤（e）、具有IDH1-R132H 突变的原发性胶质母细胞瘤（f）、具有IDH1-R132C突变的弥漫性星形细胞 瘤（g）和具有IDH2-R172K突变的间变性少突神经胶质瘤（h）中的免疫组 织化学染色。（i，j）分别为与在面板b和面板c中相同的肿瘤中的IDH1-R132H 的免疫组织化学染色，证明BCAT1染色和IDH1-R132H染色的互补性。比 例尺：50μm。（k）示出在81个神经胶质瘤中BCAT1蛋白质表达和IDH1基 因与IDH2基因的突变状态的显著相关性的二乘二表（p<0.0001；费歇尔精 确检验）。
图2：BCAT1示出在胶质母细胞瘤细胞系中底物相关性表达。
（a）示出在IDHwt神经胶质瘤细胞系中BCAT1蛋白质表达的免疫印迹。（b-d） 缺氧和α-酮戊二酸对BCAT1表达的影响。每个平板的底部和顶部示出RNA 和蛋白质表达。免疫印迹上面的数字表明表达相对于对照细胞的倍率。mRNA 表达值表示三份样品的平均值±标准偏差。（b）在缺氧（1%O2）条件下BCAT1 被上调。（c）通过用细胞穿膜二甲基-α-酮戊二酸补充培养基来诱导BCAT1 表达。（d）通过产生α-酮戊二酸的细胞质IDH1的两种不同的小发夹RNA （shRNA）的基因敲低导致BCAT1表达下调。
图3：三种BCAT1转录物的表达水平与两种替选的启动子的差异甲基化相 关联。
（a）示出三种转录物Tl、T4和T6的外显子结构的BCAT1的外显子1-4的 示意图。分别在左下部和右下部的放大部分中示出两个替选的启动子1和启 动子2。（b）转录物Tl、T4和T6在星形细胞神经胶质瘤和来自正常大脑组 织的RNA分子池中的RNA表达的定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）量化 （n=23）。值表示三份样品的平均值±标准偏差。（c）通过在正常大脑和星形 细胞神经胶质瘤WHO II-IV级中的亚硫酸氢盐-PCR扩增子A1-A8的分子量 阵列分析，在启动子1（左）和启动子2（右）中检测到的脱氧核糖核酸（DNA） -甲基化模式。*，IDHwt间变性星形细胞瘤。（d-f），在正常大脑（Nbr）、IDHwt肿瘤和IDHmut肿瘤中的DNA甲基化程度，在（d）中，启动子2中的所有 CpG的平均（双尾Student t检验，P<0.0001），（e）CpG4，CpG5（P=0.0003） 和（f）启动子1中的CpG6（P<0.0001）。（g）CpG6甲基化级别和BCATl Tl 表达的相关性。（h，i）HEK293T细胞中HEY1的基因敲低（h）导致BCATl 表达上调（i）。值表示平均值±标准偏差（n=3）。（j，k）示出与在启动子1 （c2）中的对照扩增子（大约BCATl上游5kb）和无关的阳性对照(BHLH15) 和阴性对照（PTPRD）相比，HEY1与DMR（扩增子c1）的优选结合的染 色质免疫沉淀（ChIP）试验。（j）Flag-HEYl构造。（k）HEY1-Flag构造。 以一式三份的方式进行qRT-PCR，结合与输入比表示为平均值±标准偏差。
图4：BCATl抑制降低了神经胶质瘤细胞释放谷氨酸，且影响膜脂脂肪酸的 浓度。
（a，b）采用对照试剂（-）或20mM加巴喷丁（+）处理20小时后时，U-87MG 细胞（a）和U-373MG细胞（b）的核磁共振（NMR）谱图。在靠近面板的 顶部示出了差谱。在抑制剂处理时，在U-87MG细胞中，缬氨酸（Val）、亮 氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）的浓度分别增长了倍数1.09、1.38、1.19，在 U-373MG细胞中，缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）的浓度 分别增长了倍数1.83、2.18%、2.32。（c）在用对照试剂（-）或用20mM加 巴喷丁的BCATl抑制（+）处理开始后的6小时和12小时时，通过神经胶质 瘤细胞的谷氨酸释放（n=3）。（d）在慢病毒转导后8天时，BCATl基因敲低 和对照的U-87MG细胞的培养基中氨基酸浓度的串联质谱分析。以相对于基 质开始浓度的差来示出值。正值和负值分别表示氨基酸释放和氨基酸吸收 （n=6）。（e）与在（d）中的细胞相同的细胞的细胞内氨基酸浓度（n=6）。（f） 示出BCATl基因敲低时HADH下调的免疫印迹。（g）在BCATl基因敲低的 U-87MG细胞中相对于对照U-87MG细胞中胆固醇和极长链脂肪酸的相对消 耗（n=3）。数据表示为平均值±标准偏差。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图5：BCATl基因敲低限制胶质母细胞瘤细胞入侵可能性。
（a，b）在对照U-87MG细胞中（a）和BCATl基因敲低U-87MG细胞中（b） α-微管蛋白的免疫荧光标记。蓝色：DAPI；比例尺：50μm。（c）示出U-87MG 细胞在9小时时段中渗透通过5x11x300μm的微通道的序列图像；比例尺： 50μm。（d）与非目标shRNA转导细胞相比，BCATl基因敲低显著地抑制了 U-87MG细胞的入侵可能性。结果表明三个独立实验的平均值±标准偏差。 P=0.0146。
图6：BCATl对于胶质母细胞瘤的发展是至关重要的。
（a-d）基于BCATl抑制的神经胶质瘤细胞的细胞增殖和细胞循环分析。采 用EdU细胞增殖试验检测细胞的增殖。在用碘化丙啶染色DNA后 进行细胞循环分析。针对活细胞显示DNA分布。图表中的值表示平均值± 标准偏差，n=3。nt，非目标shRNA。与相应对照相比，*，P<0.05；**，P<0.01； ***，P<0.001;（a）相对于仅用溶剂处理的对照细胞，用BCATl抑制剂加巴 喷丁处理20小时以浓度依赖方式抑制了神经胶质瘤细胞系的增殖。（b）加 巴喷丁处理的神经胶质瘤细胞的细胞循环分析展示了在G1-期中细胞的累 积。（c）在所有的三种神经胶质瘤细胞系中，相对于用非目标shRNA（nt） 处理的样品，BCATl的基因敲低引起了细胞增殖的显著降低，且（d）导致 了G1-阻滞标记物CDKN1B/p27KIP1的累积。细胞循环分析显示了在G1-期中 细胞比例的明显增加。（e）BCATl基因敲低导致AKT磷酸化降低。（f-i）通 过向CD-1裸鼠中颅内注射U-87MG胶质母细胞瘤细胞而诱导的肿瘤的剖面 图。对于用（f）对照非目标-shRNA或（g）BCAT1-shRNA注射的小鼠，展 示了伊红染色。（h）肿瘤体积的量化（对于每组，n=5只小鼠，P=0.0091）。 图7：BCATl转录产物。
（a）示出11个外显子和起源于两个不同的启动子的三个转录产物Tl （ENST00000261192）、T4（ENST00000539282）和T6（ENST00000538118） 的BCAT1的基因结构。放大在转录起始位点（TSS）和外显子5周围的区 域以显示引物位置。（b）采用反向引物和转录物-特定的外显子1引物，从 IDHwt胶质母细胞瘤（左）和来自23个个体的正常大脑RNA分子池（右） 扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶图像。带尺寸相配于各个拼接的mRNA的预 期尺寸。
图8：免疫印迹分析
基于细胞系U-87MG、U-373MG和Hs683中的（a）加巴喷丁处理和（b） BCATl基因敲低，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）目标RPS6K的全部且磷酸化 的蛋白质的免疫印迹分析。
图9：BCATl基因敲低
BCATl基因敲低导致胶质母细胞瘤球状原代培养物中的细胞凋亡。（a）由 两种shRNA构造的慢病毒转导诱导的增殖的降低（n=3，***P<0.0001）。 （b）示出在BCATl基因敲低后的亚G1部分的强烈增长的细胞循环分析 （n=3）。顶部的免疫印迹显示了在基因敲低细胞中G1-阻滞标记物CDKN1B 的增加。（c）证实BCATl基因敲低的球状细胞的凋亡的细胞凋亡检测蛋白 （AnnexinV）/7-氨基放线菌素D（7AAD）试验。
图10：在5mM的加巴喷丁处理23h后进行的Click-iT EdU试验
实验细节见实施例2。
图11：在shRNA-介导的基因敲低后的Click-iT EdU试验
实验细节见实施例3。
具体实施方式
因此，本发明涉及一种能够降低或抑制（a）支链氨基转移酶-1（BCAT1） 的生物活性或（b）编码BCAT1的基因的表达以用在治疗瘤形成的方法中的化 合物。
“赘生物”是因瘤形成而产生的异常组织团块。“瘤形成”是细胞的异常增 殖。细胞生长超过在该细胞周围的正常组织，且与该正常组织不协调。即使在 刺激停止后，仍保持以同样的过度方式生长。这通常导致肿块或肿瘤。赘生物 可以是良性的、变恶性肿瘤前的（原位癌）或恶性的（癌症）。根据本发明的待 治疗的赘生物是（过度）表达BCAT1的赘生物。因此，赘生物中的BCAT1的 确定意味着开始BCAT抑制疗法。待治疗的赘生物是脑肿瘤，尤其是星形细胞 脑肿瘤、神经胶质瘤或胶质母细胞瘤，特别为表达野生型IDH1基因的脑肿瘤。
支链氨基酸（BCAA）缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是不参与肝脏分解代谢且 在全身循环中可利用的必需氨基酸。BCAA新陈代谢提供了用来将氮移至全身 以合成非必需氨基酸（包括在中枢神经系统中的神经递质谷氨酸）的重要传输 系统。BCAA分解代谢途径异常通常导致神经功能障碍。BCAA分解代谢的第 一步包括通过胞液支链氨基酸氨基转移酶1（BCAT1）或线粒体BCAT2同工酶 将α-氨基转移至α-酮戊二酸盐（α-KG），产物为谷氨酸盐和相应的支链酮酸 （BCKA）（Ichihara等，J.Biochem.59，第160-169页，（1966）；Taylor等，J.Biol. Chem.241，第4396-4405页，（1966））。BCAT2的表达是普遍存在的，而BCAT1 的表达局限于少量组织，该少量组织包括大脑，在大脑中，BCAA是用于合成 神经递质谷氨酸盐的主要氮源。在转氨基作用后，BCKA进一步地分解代谢为 乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A进入三羧酸（TCA） 循环（图1a）。作为BCKA分解代谢的副产物而产生的NADH和FADH2用来 将还原当量转移至呼吸链的复合物III以生成ATP。
最早在部分胶质母细胞瘤中检测到的IDH1（异柠檬酸脱氢酶1）的突变存 在于绝大多数的世界卫生组织（WHO）II级和III级神经胶质瘤和继发性胶质母 细胞瘤中，但很少存在于原发性胶质母细胞瘤中（Balss等，Acta Neuropath.116， 第597-602页（2008））。也已检测到IDH2的突变，但是以5-10%的低频率（Balss， Balss等，Acta Neuropath.116，第597-602页（2008）；Yan等，N.Eng.J.Med.360， 第765-773页（2009））。IDH突变在神经胶质瘤发病机理中扮演重要的作用 （Parsons等，Science321，第1807-1812页（2008）），且已被显示来构成区分 两种主要的神经胶质瘤亚群的关键分类物，最初基于RNA表达和DNA甲基化 模式来识别这两种亚群。已揭示，示出IDH1突变（IDHmut）的大脑肿瘤具有好 于IDH1未突变（IDHwt）的大脑肿瘤的预后（Hartmann等，Acta Neuropathol.120， 第707-718页（2010））。
发明人发现，IDHmut（具有IDH1-R132H突变）脑肿瘤和IDHwt脑肿瘤之间 的一个区别是，BCATl过度表达是IDHwt胶质母细胞瘤即最常见且最有侵袭性的 成人脑肿瘤的高度特异性特征。在IDHmut肿瘤中而不在IDHwt肿瘤和正常脑中 观测到的BCATl启动子2的特定甲基化强烈地表明，IDHmut肿瘤中的低BCATl 表达是IDHl突变相关的DNA甲基化的结果，该IDHl突变相关的DNA甲基化 被认为是由突变的IDHl酶和突变的IDH2酶产生的癌代谢物2-羟戊二酸盐通过 抑制组蛋白去甲基化酶和TET家族的5-甲基胞嘧啶羟化酶而介导的。有趣的是， 在IDHwt肿瘤而非IDHmut肿瘤中，源自于启动子1的BCATl mRNA表达的调节 呈现为由IDH-独立的表观遗传机制通过用于HEY1转录抑制子的结合位点的甲 基化而实现。两个启动子中的这些完全相反的DNA甲基化模式明确表明，BCATl 抑制并不仅仅作为通过“过客”甲基化导致的IDHl突变的副产物出现，相反， 在IDHwt肿瘤和IDHmut肿瘤中的细胞新陈代谢的差别调节需要紧密控制每个组 中的BCATl表达。
与通常使用的诊断IDH1-R132H染色相似，BCATl染色可以有助于将IDHmut神经胶质瘤与IDHwt神经胶质瘤区分开；然而，BCATl染色还提供了将IDHwt原发性胶质母细胞瘤与具有非-IDHl-R132H突变的接近10%的IDHmut星型细胞 瘤区分开的额外优点。最重要的是，本发明示出了BCATl和BCAA新陈代谢为 神经胶质瘤治疗中基于新陈代谢的新颖方法的发展提供了基础。
这意味着，抑制IDHwt胶质母细胞瘤中的BCATl具有显著地阻止肿瘤生长 以及显著地阻止肿瘤细胞分泌谷氨酸盐的潜力，肿瘤细胞分泌谷氨酸盐常常引 起周围脑组织发生神经中毒并导致在脑肿瘤患者中出现与肿瘤相关的癫痫。
另外，本发明的数据表明，大量的葡萄糖和谷氨酰胺（被认为是支持恶性 细胞生长的最重要的两种营养物质）的可用性不足以支持IDHwt胶质母细胞瘤的 持久快速的生长。
换句话说，在本发明中已经表明，BCATl的过度表达是胶质母细胞瘤、尤 其是IDHwt胶质母细胞瘤的高度特异性特征，且对于所述胶质母细胞瘤的侵袭性 的临床行为是至关重要的。因此，BCATl的表达和BCAA的分解代谢是用于神 经胶质瘤的诊断评估和预后评估的有前景的标志物，且充当新颖的治疗目标。 而且，本发明代表了新陈代谢基因沉默的第一示例，其对于通过IDH1突变相关 的异常DNA甲基化产生的神经胶质瘤病理机制极为重要。在肿瘤发展早期使 BCATl沉默将防止IDHmut神经胶质瘤利用BCAA作为代谢资源，且为IDHmut神经胶质瘤相对于与BCATl相关的IDHwt胶质母细胞瘤有较小的恶性生长行为 提供解释。
通过直接相互作用或将化合物结合至BCAT1，或通过间接相互作用（如通 过与BCAT1的生物活性有关的化合物相互作用），可以实现生物活性的降低、 沉默或抑制。通过应用改变的（如非活性的）形式的BCAT1（优选地过量），也 可以实现生物活性的降低或抑制。
使BCAT1的生物活性或编码BCAT1的基因的表达降低、沉默或抑制以获 得治疗效果的适合的化合物的示例为：
（a）质粒，载体或天然的/合成的/突变的病毒，各种改性类型的寡核苷酸，如 PTO（末端硫代磷酸酯）、LNA（锁核酸）、2'F-ANA（2'F-阿拉伯糖核酸）、蛋白 质-核苷酸复合物、RNAi（核糖核酸干扰）、siRNA（小分子干扰RNA）或 mikromiRNA（微RNA）、shRNA（短发夹RNA）、甲基甲氧基-、磷酸酰胺化物、PNA （肽核酸）、吗啉代、氨基磷酸酯、环己烯基核酸（Cyclohexen(CeNA)），接合 物（gap-mer），核糖酶，寡核苷酸适配子，CpG-寡核苷酸，DNA-酶，核糖开关， 或脂质或含有分子的脂质；
（b）包括各种接头的肽类和肽复合物；
（c）小分子；
（d）抗体及其衍生物，尤其是嵌合体，Fab-片段（抗原结合片段），Fc-片段（可 结晶的片段），或
（e）载体，脂质体，纳米颗粒，复合物，或含有以上指定结构的任何其他传送 系统，
（f）氧化剂或巯基（SH基团）改性剂。
在下文中更加详细地描述适合于本发明的目的的其他化合物和如何识别/选 择这样的化合物的方法。
优选地，在药物组合物中，如以上描述的该化合物与药学上可接受的载体 组合。“药学上可接受的”意味着包含任何载体，该载体不干扰活性成分的生物 活性的有效性，且对于给药有该载体的宿主是无毒的。适宜的药物载体的例子 在本技术中是众所周知的，包括磷酸盐缓冲液、水、乳剂（如油/水乳剂）、各种 类型的润湿剂、无菌溶液等。该载体可以通过常规的方法配制，且活性化合物 可以以有效剂量给药至对象。
“有效剂量”指的是活性成分的足以影响瘤形成的进程和严重程度从而引 起减轻或缓解该病状的量。对治疗和/或预防肿瘤有用的“有效剂量”可采用本 领域中的技术人员已知的方法来确定（例如，参见Fingl等，The Pharmocological Basis of Therapeutics，Goodman和Gilman，eds.Macmillan出版有限公司，纽约， 第1-46页（1975））。
可以通过不同的方式（如静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、肌肉内给 药、局部给药或真皮内给药）实现适合组合物的给药。当然，给药途径取决于 治疗的种类和包含在药物组合物中的化合物的种类。剂量方案将通过主治医生 和其他临床因素来确定。正如在医学领域中公知的，对于任何一位患者的剂量 取决于许多因素，包括患者的体型、人体表面积、年龄、性别、待给药的特定 化合物、给药的时间和路径、治疗的种类、一般健康状况和其他的同时给药的 药物。
基于BCAT1的氨基酸序列和编码该蛋白质的基因的核苷酸序列的知识，本 领域的技术人员可以容易地识别或生成对本发明的治疗有用的化合物。在 UniProtKB/Swiss-Prot数据库（P54687；BCAT1_HUMAN）、基因库（NCBI，参 考序列：NM_005504）和人类基因组组织基因命名委员会（HGNC）数据库（HGNC ID：976）中查到相应的序列。
在本发明的另一优选实施方式中，可用于降低或抑制编码BCAT1的基因的 表达的化合物是对于BCAT1特定的反义寡核苷酸、shRNA或siRNA。优选地， 可用于使BCAT1表达沉默的化合物是靶向人BCAT1mRNA转录物的不同区域 （BCAT1shRNAI NM_005504.3-1064slcl和BCAT1shRNAII NM_005504.3-751slcl）的独立的shRNA结构和靶向人IDH1mRNA转 录物的不同区域（IDH1shRNAI NM_005896.2-1363slcl和IDH1shRNAII NM_005896.2-292slcl）的独立的shRNA结构。
适合的反义寡核苷酸的产生包括为了出现反义交互作用使得会产生所期望 的效果（如抑制蛋白质的表达）而在BCAT1编码基因内确定一个或多个位点。 优选的基因内位点是（a）包含基因的开放阅读框（ORF）的转译起始密码子或 转译终止密码子的区域或（b）为“环”或“凸起”的mRNA的区域（即不是二 级结构的部分）。如果已经确定了一个或多个目标位点，选择与该目标充分互补 的（即充分好地杂交和具有充分的特异性）以产生所期望的效果的寡核苷酸。 在本发明的背景中，“杂交”是指在互补的核苷碱基之间或互补的核苷酸碱基之 间的氢键结合，该氢键结合可以是沃森-克里克（Watson-Crick）氢键结合、胡斯 坦（Hoogsteen）氢键结合或反胡斯坦氢键结合。本文中使用的“互补的”指的 是在两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸的某一位置的核苷 酸能够与DNA分子或RNA分子的相同位置处的核苷酸氢键结合，则该寡核苷 酸和该DNA或RNA被认为是在那个位置处彼此互补。当各个分子中的足够数 量的相应位置被可以彼此形成氢键的核苷酸占据时，寡核苷酸和该DNA或RNA 是彼此互补的。因此，术语“可特异性杂交的”和“互补的”用来表明足够的 互补程度或精确配对程度，使得在寡核苷酸和目标DNA或目标RNA间出现稳 定的特异性结合。在本领域中应了解，反义化合物的序列不需要与其可特异性 杂交的目标核酸的序列100%互补。当反义化合物与目标DNA分子或目标RNA 分子的结合干扰了目标DNA或目标RNA的正常功能从而导致效用损失且互补 程度足以避免在期望特异性结合的条件下（即治疗处理的情况下）反义化合物 与非目标序列的非特异性结合时，反义化合物是可特异性杂交的。
基于已知的BCAT1的DNA序列，本领域技术人员可以生成根据本发明的 反义化合物和siRNA或shRNA。
“寡核苷酸”指的是核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）或其类似 物的低聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和核苷间共价键（骨 架）组成的寡核苷酸以及具有作用类似的非天然存在的部分的寡核苷酸。由于 期望的性质，如增强的细胞摄取、对核酸目标增强的亲合性以及在核酸酶存在 下增强的稳定性，这样的改性的或被取代的寡核苷酸通常优选于天然形式。虽 然反义寡核苷酸是反义化合物的优选形式，但本发明包括其他的寡聚反义化合 物，包括但不限于如下面描述的寡核苷酸类似物。根据本发明的反义化合物包 括大约8个至大约50个核碱基（即大约8个至大约50个连接的核苷）。特别优 选的反义化合物为反义寡核苷酸，更优选包括约15个至约25个核碱基的反义 寡核苷酸。反义化合物包括核糖酶、外部引导序列（EGS）、寡核苷酸（寡核苷 酸酶）和其他与目标核酸杂交且抑制目标核酸表达的短的催化RNA或催化寡核 苷酸。
可替选地，本发明的化合物是允许转录本发明的反义寡核苷酸的载体，例 如在哺乳类宿主中。优选地，这样的载体是可用于基因治疗的载体。优选的可 用于基因治疗的载体是病毒性载体，如腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或更加优 选RNA病毒，如逆转录病毒。更优选地，逆转录病毒载体是鼠科或鸟类逆转录 病毒的衍生物。可以用在本发明中的这样的逆转录病毒载体的例子为：莫洛尼 小鼠白血病病毒（MoMuLV）、哈维小鼠肉瘤病毒（HaMuSV）、小鼠乳腺肿瘤病 毒（MuMTV）和劳斯肉瘤病毒（RSV）。最优选地，采用与鼠科载体相比提供 了更广的宿主范围的非人类灵长类逆转录病毒载体，如长臂猿白血病病毒 （GaLV）。因为重组逆转录病毒是有缺陷的，所以需要援助，以便产生传染性微 粒。例如，可以通过采用含有在LTR（长末端重复序列）内在调控序列的控制 下编码逆转录酶病毒的所有结构基因的辅助细胞系来提供这样的援助。对于本 领域的技术人员，适宜的辅助细胞系是熟知的。所述载体可以另外含有编码选 择标记的基因，以便可以识别转导细胞。而且，逆转录病毒载体可以以逆转录 病毒载体变得目标特异的方式被改性。例如，这点可以通过插入编码糖、糖脂 类或蛋白质、优选抗体的多核苷酸而实现。本领域的技术人员知道用于生成目 标特异载体的额外的方法。用于体外基因治疗或体内基因治疗的其它的适宜的 载体和方法被描述于文献中，且对于本领域的技术人员是已知的；例如参见 WO94/29469或WO97/00957。
为了获得只在目标器官中表达（如脑肿瘤），用于反义寡核苷酸的转录的 DNA序列可以与组织特异性启动子连接，且用于基因治疗。对于本领域的技术 人员，这样的启动子是熟知的（例如，见Zimmermann等，（1994）Neuron12， 11-24；Vidal等，（1990）EMBO J.9，833-840；Mayford等，（1995），Cell81， 891-904；Pinkert等，（1987）Genes&Dev.1，268-76）。
在寡核苷酸结构内，磷酸基团通常被看成形成寡核苷酸的核苷间骨架。RNA 和DNA的正常连接或骨架是3'到5'-磷酸二酯连接键。优选的可用在本发明中的 反义化合物的具体的例子包括含有改性的骨架或非天然的核苷间连接键的寡核 苷酸。具有改性的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的寡核苷酸和在骨 架中没有磷原子的寡核苷酸。对于本领域的技术人员，可以引起稳定性增强的 改性的寡核苷酸骨架是熟知的，优选地，这样的改性为硫代磷酸酯连接键。
优选的寡核苷酸类似物是已经显示具有优良的杂交性能且被看成是肽核酸 （PNA）的寡核苷酸类似物。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架被含有骨架 的氨基化合物、尤其是氨基乙基甘氨酸骨架所替代。碱基被保留，且直接地或 间接地与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子键合（见，如Nielsen等，Science254 （1991），1497-1500）。
改性的寡核苷酸也可以含有一个或多个被取代的或改性的糖部分。优选的 寡核苷酸包括在2'位置的下列中的一种：OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、 或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可 以是被取代的或未被取代的C1至C10烷基或C2至C10的烯基和炔基。特别优选 的改性的糖部分是2'-O-甲氧乙基糖部分。
本发明的寡核苷酸也可以包括碱基改性物或碱基取代物。改性的碱基包括 其他的合成的和天然的碱基，如5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羟甲基胞嘧啶、黄 嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基的衍生物、 腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基的衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和 2-巯基胞嘧啶等，优选5-甲基胞嘧啶取代物，因为这些改性物已经显示增加了核 酸双螺旋的稳定性。
本发明的寡核苷酸的另一个改性涉及使一个或多个部分或缀合物与寡核苷 酸化学连接，该一个或多个部分或缀合物增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细 胞吸收。这样的部分包括脂质部分，如胆固醇部分、胆酸、硫醚、巯基胆固醇、 脂肪链（如，十二烷二醇残基或十一烷基残基）、磷脂、聚胺或聚乙二醇链、或 金刚烷乙酸、软脂基部分、或十八胺部分或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。
本发明也包括反义化合物，该反义化合物为嵌合化合物。在本发明的环境 中，“嵌合”反义化合物或“嵌合体”为含有两个或更多个化学上不同的区域的 反义化合物，尤其为寡核苷酸，每个区域由至少一个单体单元组成，就寡核苷 酸化合物来说，单体单元即为核苷酸。这些寡核苷酸典型地包括至少一个区域， 其中，寡核苷酸被改性，以便赋予寡核苷酸对核酸酶降解增强的阻抗力、增强 的细胞吸收、和/或对于目标核酸增强的结合亲和力。寡核苷酸的另外的区域可 以作为用于能够分裂RNA：DNA或RNA：DNA混合物的酶的底物。例如，核 糖核酸酶H RNase H是分裂RNA：DNA双螺旋的RNA链的细胞核酸内切酶。 因此，核糖核酸酶H的激活导致RNA目标的分裂，从而大大地增强了基因表达 的寡核苷酸抑制的效率。因此，和与同样目标区域杂交的硫代磷酸脱氧寡核苷 酸相比，当使用嵌合寡核苷酸时，利用较短的寡核苷酸可以通常获得相当的结 果。本发明的嵌合反义化合物可以形成为两个或更多个寡核苷酸、改性的寡核 苷酸、寡核苷和/或如以上描述的寡核苷酸类似物的复合结构。在本技术中，该 化合物也已经被称作为杂合物或接合物。
在本发明的另一优选的实施方式中，用在治疗瘤形成的方法中的化合物为 降低或抑制BCAT1的生物活性的化合物。
在本技术中描述的这样的化合物可用于与本发明的适应症不同的医学适应 症，优选地包括如1-（氨甲基）环己烷乙酸（加巴喷丁）的化合物或在以下文 献中描述的化合物：Goto等，The Journal of Biological Chemistry280（44）（2005）， 37246-56；Hu等，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters16（2006），2337-40； Caballero等，Molecular Diversity13（2009），493-500；美国专利No.6，632， 831、美国专利No.6，809，119、和EP-B11157000。
能够降低或抑制BCAT1的生物活性的化合物的其它例子为针对BCAT1或 其基本上具有相同结合特异性的片段的（中和性）抗体。术语“抗体”优选地 涉及基本上由具有不同表位特异性的混合的单克隆抗体组成的抗体以及独特的 单克隆抗体制剂。单克隆抗体通过本领域的技术人员熟知的方法由含有例如 BCAT1片段的抗原制成（例如见，Kohler等，Nature256（1975），495）。本文 中使用的术语“抗体”（Ab）或“单克隆抗体”（Mab）意味着包括完整的分子 以及能够与蛋白质特定结合的抗体片段（如，Fab片段和F(ab')2片段）。Fab片 段和F(ab')2片段缺少完整抗体的Fc片段，更加快速地从循环中清除，且可以具 有比完整抗体少的非特异性组织结合（Wahl等，J.Nucl.Med.24：316-325 （1983））。因此，优选这些片段以及FAB或其他免疫球蛋白表达文库的产物。 此外，可用于本发明的目的的抗体包括嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体。
可替选地，用于本发明目的的优选化合物为，可以根据上述方法/载体引入 的BCAT1的非活性形式或编码BCAT1的非活性形式的核酸序列。根据突变形 成的熟知的方法，可以生成这样的非活性形式。通过取代这样的化合物的功能 活跃的配对物，尤其当过量应用时，这样的化合物对于人体可以具有治疗效果。 通过测定支链L-氨基酸至支链α-酮酸（可逆的）的转氨基作用，例如通过确定 谷氨酸的生成，可以进行BCAT1的潜在的非活性形式的分析。适宜的测定描述 于文献中以及如在美国专利No.6,809,119（Hu等，（2006））的实施例39中和 EP-B11157000中。
在本发明的优选的实施方式中，上面详细描述的化合物用在治疗星形细胞 脑肿瘤或胶质母细胞瘤的方法中。
本发明还涉及一种用于识别降低或抑制BCAT1的生物活性和/或BCAT1的 表达的化合物的方法，包括以下步骤：
（a）利用包含BCAT1或BCAT1基因的测试系统培养候选化合物；和
（b）测定BCAT1的生物活性；
其中，优选地与不存在所述测试化合物的测试系统比较，BCAT1的生物活 性的抑制或丧失表示具有所需性质的候选化合物的存在。
采用如上面描述的试验，通过测定支链L-氨基酸至支链α-酮酸（可逆的） 的转氨基作用，可以实施步骤（b）。
这样的候选分子的例子包括抗体、寡核苷酸、蛋白质、或小分子。这样的 分子可以采用已知的技术合理地设计。
优选地，用于筛选的所述测试系统包括具有相似的化学和/或物理性质的物 质，最优选地，所述物质是几乎相同的。可根据本发明的用途制备和识别的化 合物可以是表达文库，如cDNA（互补DNA）表达文库、肽类、蛋白质、核酸、 抗体、小的有机化合物、配体、激素、类肽物、PNA等。
WO98/25146还描述了用于筛选具有所需性质、尤其具有抵抗、结合至或对 抗多肽或其细胞受体的能力的化合物的复合物文库的方法。在这样的文库中的 复合物包括受验化合物、在所述化合物合成中至少一个步骤处进行记录的标签、 和易受报道分子改性的系链（tether）。系链的改性用于表示复合物含有具有所需 性质的化合物。可以解码所述标签以显示这样的化合物合成中的至少一个步骤。 用于识别与BCAT1或编码该分子的核酸分子相互作用的化合物的其他方法为， 例如，利用噬菌体展示系统的体外筛选，以及滤膜结合试验或“实时”交互测量。
可以设计、合成和评价例如可以作为BCAT1的底物或配体的小的有机化合 物的类似物，这点对于本领域的技术人员也是熟知的。例如，已经描述了， hapalosin的D-葡萄糖类似物具有与在拮抗抗多药辅助相关的蛋白质在细胞毒性 中相似的功效的hapalosin的D-葡萄糖类似物，见Dinh，J.Med.Chem.41（1998）， 981-987。
根据本发明的所有这些方法可以用来识别降低或抑制BCAT1的生物活性或 BCAT1的表达的化合物。
编码BCAT1的基因也可以作为抑制剂筛选的目标。抑制剂可以包括如与编 码BCAT1的基因的mRNA结合从而使mRNA的天然构象不稳定且妨碍转录和/ 或转译的蛋白质。而且，在文献中描述了用于识别核酸分子（如模拟确定的或 不明确的靶向RNA分子的结构的RNA片段）的方法，在细胞内部化合物与该 靶向RNA分子结合，致使阻滞细胞生长或致使细胞死亡；例如见，WO98/18947 和在此引用的参考文献。这些核酸分子可以用于识别药物上感兴趣的未知的化 合物，且可以用于识别用来治疗疾病的未知的靶向RNA。这些方法和组合物可 以用于识别对降低BCAT1的表达水平有用的化合物。
根据本发明的方法可以测试和识别的化合物可以是表达文库，如cDNA表 达文库、肽类、蛋白质、核酸、抗体、小的有机化合物、配体、激素、类肽物、 PNA等（Milner，Nature Medicine1（1995），879-880；Hupp，Cell83（1995）， 237-245；Gibbs，Cell79（1994），193-198和在上面引用的参考文献）。而且， 通过如嵌入诱变，利用如把本技术中已知的基因靶向载体，可以识别编码BCAT1 的假定调节剂和/或在BCAT1的上游或下游施加其影响的基因。所述化合物也可 以是已知抑制剂的功能性衍生物或类似物。例如，这样的有用的化合物可以是 与BCAT1或编码BCAT1的基因的调控序列结合的反式作用因子。可以采用本 技术中的标准方法识别反式作用因子。为了确定是否蛋白质与蛋白质本身或调 控序列结合，可以进行标准非变性凝胶-转移分析。为了识别与蛋白质或调控序 列结合的反式作用因子，蛋白质或调控序列可以用来作为在标准蛋白质提纯方 法中的亲合力试剂或作为筛选表达文库的探针。例如，在Scofield（Science274 （1996），2063-2065）中描述的，利用所谓的酵母“双杂交系统”，也可以实现 对编码与BCAT1相互作用的多肽的核酸分子的识别。在这个系统中，BCAT1 与结合DNA的GAL4转录因子域连接。利用cDNAs的文库对表达这个融合多 肽，包含由适当启动子驱动的lacZ报道基因，且被GAL4转录因子识别的酵母 菌株进行转化，该cDNAs的文库将表达融合到活化域的植物蛋白质或其肽类。 因此，如果由cDNAs中的一个编码的肽能够与包含BCAT1肽的融合肽相互作 用，该复合物能够指导报道基因的表达。用这种方式，BCAT1和编码BCAT1 的基因可以被用来识别与BCAT1相互作用的肽和蛋白质。这个系统和类似的系 统于是可以进一步被用于抑制剂的识别，这一点对于本领域的技术人员是显然 的。
下面的实施例更加详细地解释了本发明，但不被理解为是对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1
一般方法
（a）RNA分离和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
根据制造商的使用说明，采用AllPrep DNA/RNA/蛋白质小试剂盒（Qiagen） 提取全部RNA。来自Ambion的人类大脑参照全部RNA作为正常 大脑RNA分子池（n=23个供体）。根据制造商的使用说明，采用随机引物和 superscript II（反转录酶）（Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国），对全部RNA（500ng） 进行反转录。以一式三份的方式，利用Applied Biosystems Prism7900HT快速实 时PCR系统（Applied Biosystems，福斯特市，CA，美国），采用Absolute SYBR Green ROX Mix（ABgene，埃普索姆，英国），分析每个互补DNA样品。特定 mRNA的相对量标准化为ARF、B2M和TBP。在下面的表1A中给出了引物序 列。
表1A
（b）蛋白质印迹分析
所有涉及使用人类组织的实验是在杜塞尔多夫大学中进行的，且符合医学 伦理审查委员会的指导。采用ULTRA-TURRAX（IKA，施陶芬，德国）将新鲜 冷冻的人类肿瘤组织样品和非肿瘤大脑组织样品溶解在异硫氰酸胍溶液（4M） 中，然后进行CsCl-超速离心。基本上按（45）所述，采用Amicon超-0.5离心 过滤装置（Millipore，Schwalbach，德国；3kDa截留）对所获得的蛋白质组分 进行透析过滤。利用AllPrep DNA/RNA/蛋白质小试剂盒（Qiagen）提取细胞系 的全部蛋白质。通过10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 分离10μg蛋白质，然后10μg蛋白质转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）。 该膜被封闭在封闭液（含5%牛血清蛋白（BSA）的TBS，0.1%的Tween20）中， 利用一抗在4℃下培养过夜。在蛋白质的化学发光检测之前，室温下将辣根过氧 化物酶（HRP）结合的二抗培养1小时（ECL试剂盒；GE Healthcare，Little Chalfont，英国）。
使用下列抗体：抗α-微管蛋白单克隆小鼠抗体（1:2000，#T9026， Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO63178，美国），抗BCAT1单克隆小鼠抗体（1:2000， ECA39，克隆号51（Clone51），#611270，BD Biosciences，圣何塞，CA，美国）， 抗IDH1单克隆大鼠抗血清（1:1，由A.von Deimling提供，DKFZ，海德堡，德 国；商购于Dianova，汉堡，德国），抗HADHSC单克隆小鼠抗体（1:500， #H00003033-M01，Abnova），抗CDKN1B单克隆兔抗体（1:1000，p27Kipl，#3686， Cell Signaling Technology），抗Akt单克隆兔抗体（1:1000，#9272，Cell Signaling Technology），抗含磷-Akt单克隆兔抗体（Ser473）（1:1000，#193H12，Cell Signaling Technology），抗p70S6激酶多克隆兔抗体（1:1000，#9202，Cell Signaling Technology），抗含磷-p70S6激酶多克隆兔抗体（Thr389）（1:1000，#9205，Cell Signaling Technology），HRP结合的抗大鼠免疫球蛋白G（IgG）（1:10000，由 A.von Deimling提供，DKFZ，海德堡，德国），HRP结合的马抗小鼠IgG（1:5000， #7076，Cell Signaling Technology），HRP结合的羊抗兔IgG(1:2000，#7074，Cell Signaling Technology）。
（c）免疫组织化学染色
利用二甲苯对肿瘤切片脱蜡，在浓度降低的乙醇中再水化。通过在蒸锅中， 在10mM柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）中加热40分钟进行抗原修复。通过在3% 的双氧水中培养肿瘤切片，灭活内源性过氧化物酶。利用在Dako REALTM抗体 稀释液（Dako，格洛斯楚普，丹麦）中以1:500稀释的第一抗BCAT1（ECA39） 单克隆小鼠抗体（克隆号为51）（BD Biosciences，圣何塞，CA）或以1：20稀 释的小鼠抗人类IDH1R132H抗体（Dianova，汉堡，德国），培养切片过夜。采 用EnvisionTM检测系统（过氧化物酶/二氨基联苯胺+（DAB+），兔/小鼠）(Dako， 格洛斯楚普，丹麦），根据标准方案进行染色，用来检测结合抗体，随后采用苏 木精进行复染色。
（d）DNA甲基化分析
通过分子量阵列（MassARRAY）技术分析DNA甲基化。简单地说，根据 制造商的使用说明，采用EZ甲基化试剂盒（Zymo Research），用亚硫酸氢钠化 学改性500ng基因组DNA。利用在BCAT1转录产物1（Tl，ENST00000261192） 的TSS附近从-990bp至+612bp产生4个扩增子（A1-A4）和从-198bp至+63bp 产生BCAT1转录产物4（T4，ENST00000539282）和转录产物6（T6， ENST00000538118）的启动子的三个扩增子（A5-A7）的引物，对亚硫酸氢盐处 理的DNA进行PCR扩增。扩增子通过T7聚合酶被转录，随后进行T特异性 RNA酶A裂解。消化片段通过质谱定量。在表1B中给出了引物序列。DNA甲 基化标准品（0%、20%、40%、60%、80%和100%的甲基化的基因组DNA）被 用来证实扩增子的无偏扩增。
表1B
（e）细胞培养
人类神经胶质瘤细胞系U-87MG（HTB-14）、LN-229（CRL-2611）、Hs683 （HTB-138）和U-373MG（HTB-17）培养于补充有10%胎牛血清和1%盘尼西 林/链霉素混合物的Dulbecco最低必须培养基（DMEM）中。通过短串联重复序 列（STR）分析，验证细胞系。根据海德堡大学医学系机构审查委员会认可的研 究提案，自经受了外科切除的原发性胶质母细胞瘤患者确立大脑肿瘤干细胞 NCH421k。在先前的研究中，大脑肿瘤干细胞NCH421k具有基因型和表型的特 点（Campos，B.等，Differentiation therapy exerts antitumor effects on stem-like glioma cells，Clin Cancer Res16，2715-2728（2010））。NCH421k细胞于含有浓 度均为20ng/mL的20%BIT无血清补充物、基本的纤维母细胞生长因子和表皮 生长因子（均来自于Provitro，柏林，德国）的DMEM/F-12培养基中的裸露的 组织培养盘上生长成浮动团聚体（神经球）。HEK293T细胞和HEK293细胞于 含有不含抗生素的10%胎牛血清的DMEM中保持为单层培养。所有细胞系在 37℃下，于具有5%CO2的湿润的培养箱中培养。对于低氧实验，在氮气补充的 C16低氧培养箱（Labotect，哥根廷，德国）中，在1%O2下，培养细胞。
（f）染色质免疫沉淀（ChIP）
对过度表达带有flag标签的HEY1的HEK293细胞进行ChIP，因为目前可 用的抗HEY1抗体对于ChIP试验不是特异的。采用标记有FLAG的与Gateway 兼容的载体pDest26（C-末端标签）和pDestll（N-末端标签）制备用于HEY1 表达的结构。根据稍微修改的制造商的使用说明，采用-LTl（Mirus Bio LLC，麦迪逊，WI53711，美国），将1μg的对照载体或1μg的HEY1表达载体 分别转染15cm板中的2.5x10^6个HEK293细胞。在转染后48小时时，收集两 个板的细胞。根据制造商的方案（Covaris公司）采用具有Covaris S2的非离子 剪切缓冲剂制备染色质。利用抗FLAG抗体（Cell signaling#2368）进行ChIP。 ChIP后修复的DNA用于qRT-PCR，同时输入染色质和模拟的免疫沉淀（抗IgG 抗体，Diagenode，Kch-803-015）作为对照。以一式三份的方式，采用列于表2 中的引物，利用SYBR Green检测进行qRT-PCR。记录结合信号与输入信号比。
表2
（g）siRNA的瞬时转染
对制造商的使用说明（Dharmacon）稍微修改后，采用DhamaFect1，利用 来自Ambion（HEY1：s23868-70）或Dharmacon（对照非靶向：D-001810-10） 的siRNA双螺旋，转染HEK293T细胞。简单地说，每个siRNA分子池于IX siRNA 缓冲剂（Dharmacon）中稀释，与RPMI混合，然后分布到96孔板的6个孔中。 在siRNA/DharmaFECT混合物的上面播种1.2x10^4个HEK293细胞或9x10^3个 HEK293T细胞（最终体积为150μL/孔，最终siRNA为20nM）。37℃培养48小 时后，从孔中分离RNA以进一步分析。
（h）病毒产生与转导
通过HEK293T细胞与psPAX2（Addgene12260，Didier Trono，包装载体）、 pMD2.G(Addgene12259，Didier Trono，包膜质粒)和pLKO.1shRNA结构 （Sigma-Aldrich）共转染产生慢病毒载体。利用（Mirus Bio LLC） 进行转染，且在转染和组合后48小时时和72小时时收集病毒。
在8μg/mL聚凝胺（Chemicon，比勒利卡，MA，美国）存在下，以感染复 数（M.O.I.）为2来利用病毒感染神经胶质瘤细胞。24小时后去除含有病毒的 上清液，在转导之后的第三天、第五天和第七天分离出细胞。使用两个以人类 BCAT1（BCAT1shRNAI NM_00550.3-1064slcl和BCAT1shRNAII NM_005504.3-751slcl）和人类IDH1（IDH1shRNAI NM_005896.2-1363slcl和 IDH1shRNAII NM_005896.2-292slcl）mRNA转录物的不同区域为目标的独立的 shRNA结构。非靶向shRNA（Mission SHC002）用作对照。通过定量 实时PCR和免疫印迹评估BCAT1基因敲低和IDH1基因敲低的量化。
（i）利用二甲基-α-酮戊二酸盐和加巴喷丁处理
在24孔板的总体积为500μL的细胞培养基中进行5x10^4个细胞/孔的播种。 在播种细胞后16小时时去除培养基，然后用500μL含有5mM或10mM二甲基 -α-酮戊二酸盐（二甲基2-氧化戊二酸盐；Sigma-Aldrich）或5mM、10mM或20mM 加巴喷丁（1-（氨甲基）-环己烷；Sigma-Aldrich）的培养基替换。相应体积的 200mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（pH值为7.4）被加入到相应的对 照孔中。
（j）细胞循环分析和细胞凋亡检测
在加巴喷丁处理之后20小时时和慢病毒转导后6天时进行细胞循环分析。 Nicoletti缓冲液（0.1%柠檬酸钠，pH7.4，0.05%曲拉通X-100，50μgmL-1碘化 丙啶）被加入到含有死细胞和活细胞的孔中。在4℃下于暗处保持4小时后，采 用FACS Canto II（BD Biosciences，圣何塞，CA，美国）通过流式细胞术分析 DNA含量。FACS Diva软件用来量化每个细胞循环期（亚-G1（死细胞）期、 G1期、S期和G2/M期）中的细胞分布。为了调查研究在慢病毒基因敲低后凋 亡活性，利用annexinV-PE（藻红蛋白）和7-AAD（7-氨基放线菌素D，BD Biosciences）在黑暗中培养NCH421k细胞15分钟，随后立即实施流式细胞技术。
（k）增殖分析
为了评定在加巴喷丁处理后或在慢病毒基因敲低后神经胶质瘤细胞的增 殖，遵循制造商的使用说明，采用EdU（5-乙炔基-2'脱氧尿苷）细胞 增殖试验（Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国）。用10μM核苷类似物EdU（5-乙炔 基-2'脱氧尿苷）培养细胞16小时。采用FACS Canto II（BD Biosciences）对与 EdU合并的细胞进行量化。
（l）谷氨酸盐量化
根据制造商的使用说明，采用谷氨酰胺/谷氨酸盐测定试剂盒 （GLN-1;Sigma-Aldrich）测定加巴喷丁处理的细胞的上清液中的谷氨酸盐浓度。 反应体积按比例缩小到100μL总体积，且以一式三份的方式，在微孔板 （96孔的透明平底的紫外透射的微孔板（96Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate））中，采用Tecan Infinite M200板读取器 （Tecan，奥地利）测量吸光度。数据被标准化至每孔的细胞数目。
（m）免疫荧光染色
慢病毒转导之后5天时，细胞被涂到盖玻片上。细胞固定在4%甲醛中，用 1x磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两次，然后在含有0.2%曲拉通的PBS中透性化。 用1x PBS清洗后，细胞于10%羊血清中室温下培养30分钟。在利用含DAPI （4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）的Vectashield封片剂（Vector Laboratories，伯林盖 姆，CA，美国）封片后，利用一抗（小鼠抗α-微管蛋白抗体，1：200，#T9026， Sigma-Aldrich）培养样品1小时，然后利用二抗（FITC（异硫氰酸荧光素）结 合的羊抗小鼠抗体，1：100，ab6785，Abeam）室温培养样品1小时。对于荧光 成像，利用40x物镜，在Zeiss Axioplan显微镜上拍摄图像。
（n）3D微通道迁移试验
由Ralf Kemkemer博士（马克斯-普朗克智能系统研究所，德国）友好提供 了基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微通道芯片。使用前，尺寸为5μm x11μm x300μm（宽x高x长）的微制造的通道结构通过用50μg/mL纤连蛋白溶液培养 而被生物功能化。芯片固定在聚四氟乙烯支架上，2x10^5个细胞非常靠近于通 道而播种在芯片上。在细胞附着在芯片上后，进行25小时的活细胞成像。在实 验期间，在通道内不应用化学梯度或化学流。利用配备有空气润湿的和加热的 室的自动倒置显微镜（Zeiss细胞观察仪；Carl Zeiss）每10分钟捕获多个位置 的相衬延时图片。用Zeiss AxioVision和ImageJ软件记录和处理图像。按照先前 的报道，对细胞行为分析和归类（Bai，A.H.等，MicroRNA-182promotes leptomeningeal spread of non-sonic hedgehog-medulloblastoma，Acta Neuropathol （2011）；Rolli，C.G.，Seufferlein，T.，Kemkemer，R.&Spatz，J.P.，Impact of tumor cell cytoskeleton organization on invasiveness and migration:a microchannel-based approach，PLoS One5，e8726（2010））。
（o）动物实验
根据国家健康研究中心指导方针-实验动物护理和使用指南，动物研究工作 由政府机构（Regierungspraesidium卡尔斯鲁厄，德国）批准且由制度动物保护 官员监督。
（p）原位脑肿瘤模型
总数为2x10^5个具有BCAT1shRNAI基因敲低或非靶向shRNA的U-87MG 细胞分别被定向性地植入到六个7至9周大的无胸腺小鼠的脑中（CD1nu/nu； 查理斯河实验室，威明顿，MA，美国）。植入后四周时，牺牲动物，移除大脑 且进行冰冻切片。用苏木精和伊红对大脑切片染色，用ImageJ计算肿瘤体积。
（q）高氯酸细胞提取与NMR（核磁共振）光谱
通过胰蛋白酶化作用获取细胞，用冰冷的PBS清洗一次，然后在-80℃下冷 冻细胞团块。典型地，根据已公布的方案50，对1x108个所获的细胞进行高氯酸 提取，随后用KOH中和。简单地说，2mL冰冻的1N高氯酸被加入到所获细胞 的冷冻团块中。采用聚四氟乙烯研杵和玻璃匀浆器使团块破裂。将1mL冰冻的 水加入到裂解物中，涡旋90s，然后在4℃下，以10000xg离心10分钟。再提取 团块，然后组合上清液。提取物用KOH中和，pH调节到6.5-7.0。沉淀的高氯 酸钾KClO4在25000xg下且持续20分钟，制成颗粒，然后将上清液冻干。
将冻干的提取残留物溶解在0.5mL的含有30mM磷酸钠和0.1mM叠氮化钠 的D2O缓冲液（99.9%D）中（pH7.02）。对于定量分析，用含有11mM三甲基 硅烷基-2,2,3,3-四氘丙酸（TSP，钠盐）的上述D2O缓冲剂溶液填充参比毛细管 （1.5mm外直径（OD），0.99mm内直径（ID））。随后，用Bunsen燃烧器的火 焰密封毛细管。通过将所称重量的葡萄糖和柠檬酸置于D2O缓冲剂中，使得葡 萄糖和柠檬酸的计算浓度分别为10.49mM和4.95mM，来制备校准溶液。在 600MHz（Avance AV-600，Bruker BioSpin GmbH）下，在待用于提取物的同样 的条件下（20℃，预饱和剩余HDO信号，重复时间TR=7s，30°翻转角），采 用标准5-mm NMR管和三共振反向探头，获取校准溶液+毛细管的1H-NMR光 谱。对于柠檬酸根和葡萄糖的信号积分被设定成相对应于以上给出的浓度的值， 发现TSP甲基信号的积分等于4.60±0.10mM质子。用所插入的校准的参比毛细 管测量细胞提取物（1小时内512个瞬态），对支链氨基酸、各种代谢物和TSP 参比的1H-NMR信号进行积分。TSP积分被定义为4.60mM，以便代谢物信号积 分对于所用的0.5mL体积直接给出以mM（μmol/mL）的代谢物浓度。然后利用 在提取前测定的细胞数，将这些数据转换为毫微微摩尔（femtomol）/细胞。
（r）细胞匀浆的制备
将细胞团块稀释于100μL水中，然后通过超声均匀化（超声装置，3-5x20 循环，输出80%，Branson声波降解器450，迪岑巴赫，德国）。采用牛血清白蛋 白作为标准物，根据Lowry（Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L.&Randall， R.J.Protein measurement with the Folin phenol reagent.J Biol Chem193，265-275 （1951）），以及修改Helenius和Simons（Helenius，A.&Simons，K.The binding of detergents to lipophilic and hydrophilic proteins.J Biol Chem247，3656-3661 （1972）），确定蛋白质。匀浆中最终蛋白质的浓度应该在2mg/mL至4mg/mL 范围内。这些稀释液被用于全部分析。
（s）统计分析
利用双侧费歇尔精确检验测试IDH1/IDH2突变状态和BCAT1蛋白质表达之 间的关系（图1k）。Student t检验（双尾，不配对的）用于所有其他统计对比。 *，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
实施例2
通过加巴喷丁抑制细胞增殖
人类胶质母细胞瘤细胞系U87-MG（HTB-14）、HS683（HTB-138）和 U373-MG（HTB-17；LGC标准品，特丁顿TW110LY，英国）培养于补充有10% 胎牛血清和1%盘尼西林/链霉素混合物的Dulbecco最低必须培养基中。在24孔 板中，总体积为500μL的细胞培养基中以5x104个细胞/孔进行播种。在播种细 胞后4小时时去除培养基，然后用500μL含有最终浓度分别为5mM、10mM和 20mM的1-（氨甲基）-环己烷乙酸（cyclohexylessigsaure）（加巴喷丁，以500mM 浓度溶解于200mM的HEPES缓冲剂）的培养基替换。相应体积的200mM的 HEPES被加入到各个对照孔中。在交换培养基后5小时时，加入5-乙炔基-2'脱 氧尿苷（EdU；卡尔斯巴德，CA92008，美国），以便利用Invitrogens（卡尔斯 巴德，CA92008，美国）增殖试剂盒测量细胞增殖。应用EdU之后的 16小时时，收获细胞，然后根据制造商的使用说明，采用BD Biosciences FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences，富兰克林湖，NJ美国07417）测量增殖。 对于每个处理获得三个重复测量。在所有细胞系中，与模拟物处理的细胞相比， 在加巴喷丁处理的细胞中，观测到细胞增殖的相关浓度显著降低大约20%至 55%。结果示于图10中。
实施例3
通过BCAT1反义寡核苷酸抑制细胞增殖
通过HEK293T细胞与psPAX2（Addgene12260，Didier Trono，包装载体）、 pMD2.G(Addgene12259，Didier Trono，包膜质粒)和pLKO.1shRNA结构 （Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO63178，美国）共转染产生慢病毒载体。利用 -LTl（Mirus Bio LLC，麦迪逊，WI53711，美国）进行转染，且在转染 之后的48小时时和72小时时获取病毒。使用两个靶向BCAT1mRNA转录物的 不同区域的独立的shRNA结构：MISSION shRNA TRCN0000005907 NM_005504.3-1064slcl（shRNAl）和TRCN0000005909NM_005504.3-751slcl （shRNA2）；均为Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO63178，美国。非靶向shRNA 用作对照。
人类胶质母细胞瘤细胞系U87-MG（HTB-14）、HS683（HTB-138）和 U373-MG（HTB-17；LGC标准品，特丁顿TW110LY，英国）播种于24孔板 （5x10^4个细胞/孔）的总体积为500μL的细胞培养基中。24小时后，在8μg/mL 聚凝胺存在下，利用病毒转导细胞。24小时后去除含有病毒的上清液，在转导 后的第三天和第五天分离细胞。利用定量实时PCR和免疫印迹（ECA39抗体， BD Biosciences Pharmingen，圣地亚哥，CA92121，美国）检测到降低的BCAT1 mRNA和蛋白质的表达。在第6天，利用10μM EdU培养细胞16小时后，采用 EdU细胞增殖试剂盒，进行增殖试验。在所有的BCAT1shRNA转导 的细胞中，取决于细胞系，观测到范围从20%至80%的增殖降低这些结果显 示于图11中。
实施例4
在IDHwt胶质母细胞瘤中BCAT1过度表达的测定
对来自确定为WHO II级、III级和IV级的BCAT1的星形细胞神经胶质瘤 的基因表达数据的微阵列的预测分析，可以见于下面的表3中，其作为区分原 发性胶质母细胞瘤和其他星形细胞瘤的最佳分类器：
当基于IDH-突变状态分类肿瘤时，相对于IDHmut神经胶质瘤，对于IDHwt神经胶质瘤的BCAT1mRNA表达水平是明显更高的（图1b；P<0.0001；双尾 Student’t检验），然而，对于BCAT2表达没有观测到类似提高的水平（图1c； P=0.0301）。途径分析表明，除了BCAT1之外，与IDHmut肿瘤相比，在IDHwt肿瘤中，BCAA新陈代谢途径的几个其他基因的RNA表达被上调（图7）。与 RNA表达结果一致，免疫印迹分析表明，不管在IDH1或是IDH2中特异突变， BCAT1蛋白质表达在IDHwt肿瘤中是高的，但是在IDHmut肿瘤中基本上是不存 在的（图1d）。对于20个神经胶质瘤，BCAT1的启动子和编码区域的测序显示， 既不无意义也不能推定激活突变。IDH1突变或IDH2突变与BCAT1表达之间所 观测到的紧密的联系进一步通过来自81个原发性人类神经胶质瘤（77个星形细 胞瘤，4个少突神经胶质瘤）的切片的免疫组织化学染色而证实，其中，46个 IDHwt肿瘤中的45个显示强烈的BCAT1染色（图1e），而具有IDH1（30个R132H， 1个R132C，1个R132S）突变或IDH2（3个R172K）突变的35个肿瘤中的35 个是BCAT1阴性的（图1f-1h）；（P<0.0001；费歇尔精确检验；图1k）。因此， BCAT1染色模式很大程度上补充利用广泛使用的抗IDH1-R132H突变蛋白质抗 体所获得的模式（图1i，1j）。然而，不同于IDH1-R132H染色，BCAT1抗体也 区分IDHwt肿瘤（图1e）和具有较不常见的不被抗-IDHl-R132H识别的IDH1突 变和IDH2突变的肿瘤（图1g-1h）。这些数据表明，高的BCAT1表达是IDHwt神经胶质瘤特有的特征，在诊断环境中这点可用来明确地识别这些肿瘤。
实施例5
BCAT1的底物依赖表达的确定
发现BCAT1在胶质母细胞瘤细胞系LN-229、U-87MG、U-373MG中强烈 表达，在A172中较小程度地表达（图2a），全部这些细胞系都被证实携带IDH1 野生型基因和IDH2野生型基因。在Hs683细胞系中BCAT1表达也提高，Hs683 细胞系最初起源于少突神经胶质瘤，然而显示IDHwt基因型。因此，所用这些细 胞系都可以被认为是用于研究BCAT1的作用的适宜的模型。在缺氧条件下， BCAT1RNA和蛋白质表达被上调，在胶质母细胞瘤中，这点是经常出现的（图 2b）。BCAT1表达与底物α-KG的浓度相关，且在培养基中增大细胞穿膜二甲基 -α-KG底物的浓度后，BCAT1表达上调（图2c）。相反地，IDH1（细胞质中α-KG 的主要来源）的shRNA-介导的基因敲低，导致BCAT1表达的强烈下调（图2d）。
实施例6
在两个可替选的启动子中，通过DNA-甲基化被差异地调节的BCAT1表达
为了进一步阐明在IDHwt神经胶质瘤和IDHmut神经胶质瘤中BCAT1表达的 差异调节，在患者样品中量化转录物表达。利用反转录-聚合酶链式反应 （RT-PCR）和测序，在IDHwt星形细胞原发性肿瘤以及23个正常大脑组织的分 子池中，列于Ensembl数据库中的三个编码蛋白质的BCAT1转录物的表达被证 实（图9）。这三个转录物（Tl、T4和T6）编码386个氨基酸、398个氨基酸和 385个氨基酸的蛋白质，这三个全部对应于通过免疫印迹分析确定的43kD的单 一蛋白质带。这些转录物起源于两个替选的启动子（图3a），且不同之处仅在于 它们的第一外显子，所述第一外显子分别在Tl、T4和T6中编码2个、14个和 1个氨基酸。转录物特异的qRT-PCR识别T6作为在原发性肿瘤中占全部BCAT1 mRNA的73%的主导性转录物（图3b）。显而易见地，与IDHmut肿瘤相比，在 IDHwt肿瘤中所有BCAT1转录物的表达是明显较高的。
为了研究BCAT1转录调节的可能机理，采用自涵盖所述两个替选的启动子 的亚硫酸氢盐处理的DNA扩增的PCR产物的分子量阵列分析，对所有等级的 星形细胞瘤进行量化的DNA甲基化分析（图3c）。对于IDHwt肿瘤和IDHmut肿 瘤，观测到不同的甲基化模式。主要启动子（启动子2）在IDHmut肿瘤中被高 度甲基化，但在IDHwt肿瘤和正常大脑中几乎未被甲基化（图3c，右平板）。A6 扩增子和A7扩增子的平均甲基化程度与IDH1突变状态强烈地相关（图3d）。 这些数据显示了在IDHmut肿瘤中，通过启动子2的甲基化抑制转录物T4和T6。 启动子1（图3c，左平板）在所有肿瘤样品以及在正常大脑中几乎未被甲基化， 除了紧接着CpG岛的上游的一段高度甲基化序列之外。在该上游区域内，在 IDHwt肿瘤和IDHmut肿瘤之间，在扩增子A2中的位置-699/-697（CpG4；CpG5） 和-660（CpG6）处，识别出三个不同甲基化的CpG二核苷酸。与启动子2中的 甲基化模式形成对照，CpG4、CpG5（图3e）和CpG6（图3f）显示出了在IDHmut肿瘤中比在IDHwt肿瘤中明显地少的甲基化。在该不同甲基化区域（DMR）中 的甲基化程度与在支持其功能相关性的IDHwt肿瘤中的BCAT1转录物T1的表 达相关联（图3g）。所观测到的CpG特异性甲基化模式与结合至导致T1下调的 DMR的阻遏物相一致。阻遏物HEY1与BCAT1启动子1而非启动子2结合（图 3a）先前已由染色质免疫沉淀-测序（ChlPseq）数据表明。RNA表达数据的分析 证实，与正常大脑相比，在星形细胞肿瘤中HEY1阻遏物过度表达。与HEY1- 阻遏物活性一致，在HEK293T细胞中siRNA介导的HEY1基因敲低增强转录 物T1的表达（图3h，图i）。ChIP分析证明，与上游对照域和接近转录起始位 点的区域相比，两个不同HEY1结构的最强结合出现在DMR（图3j，图3k）。 同时，这些数据强烈地表明，通过涉及在IDHmut肿瘤中启动子2的普遍的甲基 化和在IDHwt肿瘤的启动子1中的HEY1-阻遏物结合位点中的CpG-位点特异的 甲基化的DNA甲基化，调控星形细胞瘤中BCAT1转录物的差异表达。
实施例7
通过抑制BCATl来降低胶质母细胞瘤细胞释放谷氨酸盐
为了深刻理解胶质母细胞瘤中BCATl的功能作用，用加巴喷丁，特别抑制 BCATl而非BCAT2的亮氨酸类似物，处理细胞系U-87MG和细胞系U-373MG。 用20mM加巴喷丁处理20小时的细胞提取物的1H-NMR光谱学证明，BCAA的 细胞内累积与BCATl抑制一致（图4a，图4b）。胶质母细胞瘤释放高浓度的谷 氨酸盐，导致由于兴奋毒性机制而神经元死亡。利用加巴喷丁抑制BCATl，显 著地降低了谷氨酸盐的释放（图4c），这表明，对于在IDHwt神经胶质瘤中通过 BCAA的分解代谢生产谷氨酸盐，BCATl是主要的促进者。
为了独立地证明这些发现，在U-87MG细胞、U-373MG细胞和Hs683细胞 中，采用两种均靶向全部三种BCAT1转录物的shRNA,进行shRNA-介导的 BCAT1基因敲低。在培养24小时后时进行的U-87MG细胞培养基的串联质谱 分析显示，与对照细胞相比，在BCAT1基因敲低细胞中谷氨酸释放以及BCAA 吸收降低（图4d）。还观测到丙氨酸、甘氨酸和苏氨酸释放的显著的增加。细胞 内氨基酸浓度的量化显示出天冬氨酸、甘氨酸和苏氨酸的显著的累积（图4e）。 在BCAT1基因敲低后也观测到谷氨酸盐的少的但是显著的累积；然而，考虑到 培养基体积与细胞内的体积的高的比率，谷氨酸的总浓度没有明显地受到这个 少的细胞内的累积的影响。在BCAT2基因敲除小鼠中，通过雷帕霉素机械靶点 （mTOR）信号转导通路和补充增强的蛋白质降解（增强的蛋白质转换），抑制 BCAA分解代谢导致周围组织中高浓度的BCAA和较高速率的蛋白质合成。
BCAT1的基因敲低导致3-羟酰辅酶A脱氢酶（HADH）（参与BCAT1下游 的缬氨酸和异亮氨酸的分解代谢的酶）的强烈的下调（图4f，图4g）。因为HADH 对于脂肪酸的新陈代谢是重要的，所以BCAT1的基因敲低也将改变对膜合成是 必要的脂肪酸的合成或降解。
实施例8
通过BCAT1基因敲低，限制胶质母细胞瘤在微通道中的迁移
BCAT1基因敲低强烈地影响细胞形态，从而导致圆形的、少延伸的外貌（图 5a-b）。为了测试这些形态变化是否可以影响肿瘤细胞侵袭临近组织的能力，采 用微通道迁移芯片来模拟三维环境（图5c）。BCAT1基因敲低后，大多数U-87MG 细胞（55%）短距离渗入到微通道中，但不能够积极地使它们自己变形以便完全 侵入微通道，但是，大多数对照细胞（78%）完全侵入该通道（图5d）。BCAT1 基因敲低细胞的该降低的侵入力可能是起因于由所观测到的长链脂肪酸的较低 的丰度和在胆固醇新陈代谢中的差异而引起的改变了的膜组成（图4g），这样的 改变可能充分地影响膜组成的总体利用率以及膜妨碍细胞入侵的弹力。
实施例9
BCAT1对于胶质母细胞瘤的生长是重要的
为了评定BCAT1对肿瘤细胞的增殖的影响，进行了抑制和基因敲低实验。 用抑制剂加巴喷丁处理时，基于EdU-合并进行的评估，观测到增殖的浓度依赖 的降低达到56%（图6a）。细胞循环分析表明，加巴喷丁处理诱导了部分G1-阻 滞，这点通过G1-期中细胞的增加的部分连同同时降低的G2和S-部分而表明（图 6b）。ShRNA-介导的BCAT1基因敲低引起了相似的效果（图6c，图6d）。BCAT1 基因敲低在所有三个细胞系中使增殖降低了20%至70%（图6c），且导致G1- 阻滞和细胞的CDKN1B/p27KIP1的强烈的增加。显而易见地，CDKN1B/p27KIP1的累积的程度显示了与G1-部分的尺寸的正相关（图6d）。除了在Hs683的情况 下，由亚-G1期中的细胞部分表明的细胞死亡保持低于5%，这点显示了如下面 表4中展示的适度的增加：
当无血清的培养基中的胶质母细胞瘤原代球状培养物中的BCATl基因敲低 时，除了观测到这些细胞展示出由Annexin V/7AAD染色测定的细胞凋亡的较高 的速率之外，观测到细胞增殖的相当的降低（图9）。与所观测到的增殖降低一 致，BCATl基因敲低导致U-87MG细胞、U-373MG细胞和Hs683细胞中v-akt 鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物（AKT）的磷酸化降低。
通过向CD-1裸鼠脑内移植U-87MG细胞来评估体内BCATl基因敲低对肿 瘤生长的影响（图6f-h）。在移植等量的活细胞之后四周时，所有6个对照小鼠 （但6个小鼠中的仅一个小鼠移植有BCAT1-shRNA转导的细胞）表现出了神经 症状，如嗜眠或不协调的肌动活动。小鼠大脑切片的苏木精和伊红染色显示了 在移植有对照细胞的小鼠中有大的肿瘤（图6f），而在移植有BCATl-基因敲低 细胞的小鼠中发现了明显较小的肿瘤（图6g）。定量分析证实了组群之间的肿瘤 体积的显著的差异（图6h，P=0.0091）。
机译： 支链氨基转移酶-1（BCAT1）抑制剂用于治疗脑肿瘤
机译： 支链氨基转移酶-1（BCAT1）抑制剂治疗脑肿瘤
机译： 支链氨基转移酶1（BCAT1）抑制剂治疗脑肿瘤
