应用于小麦成熟胚培养的干胚游离方法

摘要

本发明公开了一种应用于小麦成熟胚培养的干胚游离方法。本发明提供了一种禾本科植物取胚方法，包括如下步骤：将禾本科植物的籽粒打碎，先过9目网筛去除大颗粒，再过30目网筛去除小颗粒，从粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取1-2mm的胚组织。本发明提供的取胚方法与现有的刮胚法相比，在后续试验中的愈伤诱导及分化效果差异不大，但是在取胚、保存及消毒环节方便快捷，可以节约劳动力，且可以应用到种质资源的保存，以节约存储空间等。本发明大大方便了禾本科植物成熟胚的组织培养和遗传转化。综上所述，本发明具有重要的应用意义。

说明书

技术领域

本发明涉及应用于小麦成熟胚培养的干胚游离方法。

背景技术

小麦是我国的重要粮食作物，与国家粮食安全、国民经济发展、社会稳定和人民 生活水平的提高有着密切的关系。近年来，农业生物技术的飞速发展为小麦遗传育种 研究提供了新的动力，其中小麦转基因技术为开展小麦的基因组研究和遗传改良开辟 了广阔的前景。

小麦转基因技术的最重要的基础是小麦组培体系的建立及完善。小麦组培体系的 外植体源主要有幼胚、花药、顶端分生组织、幼穗、成熟胚等，其中小麦幼胚的愈伤 组织诱导和再生能力较高，是目前公认的最好的外植体源之一。幼胚的获取有一个严 重的局限性，即受小麦生长季节及环境条件的影响，这给小麦遗传转化研究带来了众 多不便。为了有效地克服以上不足，以小麦成熟胚作为组织培养的外植体越来越受到 广大研究者的欢迎，小麦成熟胚还具有取材方便、保存期长、个体间生理状况相似， 可大量获得等优点，更加有利于小麦转基因研究的进行。

采用成熟胚进行转基因操作，最初采用剥取完整胚直接接种的方法，其再生效果 很差、再生率较低、大多数基因型不能得到再生植株。后来逐步研究并发现了胚乳支 撑接种法、成熟胚切割接种法以及成熟胚刮碎接种法（刮胚法）等，胚性愈伤形成率 及再生频率得到了一定的提高。其中刮胚法的再生效果最好，是目前公认的常规方法。 以上前人的接种方法均是对在种子进行消毒后，在超净台一粒粒的对浸泡过夜种子的 胚进行剥取并接种，其操作繁琐，容易污染，耗费时间及劳动力。

发明内容

本发明的目的是提供用于一种应用于小麦成熟胚培养的干胚游离方法。

本发明提供了一种禾本科植物取胚方法，包括如下步骤：将禾本科植物的籽粒(未 经浸泡处理的籽粒，或称干燥的籽粒)打碎(打碎程度以大多数颗粒的粒度介于9目筛 和30目筛之间为准)，先过9目网筛去除大颗粒，再过30目网筛去除小颗粒，从粒 度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取1-2mm的胚组织（淡黄色，形状似月牙， 约占破碎组织的40%左右）。

所述禾本科植物具体可为小麦，如小麦品种“辽春18号”。

本发明还保护所述方法在制备禾本科植物的愈伤组织中的应用。

本发明还保护一种制备禾本科植物的愈伤组织的方法，包括如下步骤：

（1）将禾本科植物的籽粒(未经浸泡处理的籽粒，或称干燥的籽粒)打碎(打碎程 度以大多数颗粒的粒度介于9目筛和30目筛之间为准)，先过9目网筛去除大颗粒， 再过30目网筛去除小颗粒，从粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取胚组织（淡 黄色，形状似月牙，大小为1-2mm，约占破碎组织的40%左右）；

（2）将步骤（1）得到的胚组织用水洗涤，然后用2.5g/100ml次氯酸钠水溶液 消毒1分钟，然后用水洗涤；

（3）将权利要求（2）得到的胚组织接种至诱导培养基并进行暗培养，得到愈伤 组织。

所述禾本科植物具体可为小麦，如小麦品种“辽春18号”。

本发明还保护所述方法在禾本科植物的遗传转化中的应用。

本发明还保护一种制备转基因禾本科植物的方法，包括如下步骤：

（1）将禾本科植物的籽粒(未经浸泡处理的籽粒，或称干燥的籽粒)打碎(打碎程 度以大多数颗粒的粒度介于9目筛和30目筛之间为准)，先过9目网筛去除大颗粒， 再过30目网筛去除小颗粒，从粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取胚组织（淡 黄色，形状似月牙，大小为1-2mm，约占破碎组织的40%左右）；

（2）将步骤（1）得到的胚组织用水洗涤，然后用2.5g/100ml次氯酸钠水溶液 消毒1分钟，然后用水洗涤；

（3）将权利要求（2）得到的胚组织进行愈伤诱导培养（具体可在诱导培养基中 25℃暗培养1周），得到愈伤组织；

（4）将步骤（3）得到的愈伤组织进行高渗培养（具体可在高渗培养基中25℃暗 培养4-6小时），然后用基因枪轰击携带目的基因的重组表达载体，然后进行恢复培 养（具体可在恢复培养基中25℃暗培养1周）；

（5）取完成步骤（4）的愈伤组织，采用0.75mg/L草甘膦进行筛选培养（具体 可在含0.75mg/L草甘膦的筛选基础培养基中，25℃、光照12小时/黑暗12小时的条 件下培养1周），然后在0.75mg/L草甘膦浓度下进行分化培养（具体可在含0.75mg/L 草甘膦的分化基础培养基中，25℃、光照12小时/黑暗12小时的条件下培养一个月）；

（6）取步骤（5）得到的再生苗，在0.75mg/L草甘膦浓度下进行生根壮苗培养 （具体可在含0.75mg/L草甘膦的生根壮苗培养基中，25℃、光照12小时/黑暗12 小时的条件下培养1个月）。

所述步骤（4）中，在基因枪轰击和所述恢复培养之间，可25℃暗培养16-18小 时。

所述禾本科植物具体可为小麦，如小麦品种“辽春18号”。

所述诱导培养基具体可为含0.75g/L MgCl₂、15g/L山梨醇、15g/L甘露醇、 5mg/L谷氨酰胺、0.5g/L水解酪蛋白、12g/L葡萄糖、10mg/L维生素B1、1mg/L 维生素B6、1mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、39mg/L乙酰丁香酮、2mg/L Dicamba、4mg/L 硝酸银、40mg/L半胱氨酸、100mg维生素C、2.8g/L植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

所述高渗培养基具体可为含1mg/L维生素B1、150mg/L天门冬酰胺、100mg/L 肌醇、2mg/L2,4-D、36.434g/L山梨醇、36.434g/L甘露醇、30g/L蔗糖、2.8g/L 植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

所述恢复培养基具体可为含0.75g/L MgCl₂、15g/L山梨醇、15g/L甘露醇、5mg/L 谷氨酰胺、0.5g/L水解酪蛋白、12g/L葡萄糖、10mg/L维生素B1、1mg/L维生素 B6、1mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、39mg/L乙酰丁香酮、1.5mg/L Dicamba、4mg/L 硝酸银、40mg/L半胱氨酸、100mg维生素C、2.8g/L植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

所述筛选基础培养基具体可为含0.5mg/L维生素B1、0.25mg/L维生素B6、 0.25mg/L烟酸、1mg/L甘氨酸、50mg/L肌醇、20g/L蔗糖、4mg/L硝酸银、2.8g/L 植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

所述分化基础培养基具体可为含0.5mg/L维生素B1、0.25mg/L维生素B6、 0.25mg/L烟酸、1mg/L甘氨酸、50mg/L肌醇、20g/L蔗糖、4mg/L硝酸银、5mg/L 玉米素、2.8g/L植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

所述生根壮苗培养基具体可为：含0.5mg/L维生素B1、0.25mg/L维生素B6、 0.25mg/L烟酸、1mg/L甘氨酸、50mg/L肌醇、20g/L蔗糖、0.5mg/L玉米素、0.5mg/L IAA、8g/L琼脂的1/2MS培养基；pH=5.8。

作为我国第二大口粮作物，小麦在农业生产上具有重要地位。本发明在创新性改 进了现有的小麦成熟胚的取胚方法。本发明提供的取胚方法与现有的刮胚法相比，在 后续试验中的愈伤诱导及分化效果差异不大，但是在取胚、保存及消毒环节方便快捷， 可以节约劳动力，且可以应用到种质资源的保存，以节约存储空间等。本发明大大方 便了禾本科植物（特别是小麦）成熟胚的组织培养和遗传转化。综上所述，本发明具 有重要的应用意义。

附图说明

图1为筛选干胚组织过程中的照片。

图2为不同浓度的草甘膦对分化阶段的愈伤组织的影响的结果照片。

图3为本发明提供的方法和对照方法中，胚组织在诱导培养基培养1周后的照片。

图4为本发明提供的方法和对照方法中，愈伤组织在含0.75mg/L草甘膦的分化 基础培养基生根壮苗培养基培养1个月后的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

小麦品种“辽春18号”：辽宁省农业科学院作物研究所,国审麦2007024,2005年 辽宁省农作物品种审定委员会审定。

pBAC35SIH3载体（含编码抗除草剂草甘膦的蛋白的bar基因）：Promega公司。

诱导培养基（Adi培养基）：含0.75g/L MgCl₂、15g/L山梨醇、15g/L甘露醇、 5mg/L谷氨酰胺、0.5g/L水解酪蛋白、12g/L葡萄糖、10mg/L维生素B1、1mg/L 维生素B6、1mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、39mg/L乙酰丁香酮、2mg/L Dicamba、4mg/L 硝酸银、40mg/L半胱氨酸、100mg维生素C、2.8g/L植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

高渗培养基（GS培养基）：含1mg/L维生素B1、150mg/L天门冬酰胺、100mg/L 肌醇、2mg/L2,4-D、36.434g/L山梨醇、36.434g/L甘露醇、30g/L蔗糖、2.8g/L 植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

筛选基础培养基（SX培养基）：含0.5mg/L维生素B1、0.25mg/L维生素B6、 0.25mg/L烟酸、1mg/L甘氨酸、50mg/L肌醇、20g/L蔗糖、4mg/L硝酸银、2.8g/L 植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

分化基础培养基（FS培养基）：含0.5mg/L维生素B1、0.25mg/L维生素B6、 0.25mg/L烟酸、1mg/L甘氨酸、50mg/L肌醇、20g/L蔗糖、4mg/L硝酸银、5mg/L 玉米素、2.8g/L植物凝胶的MS培养基；pH=5.8。

生根壮苗培养基（SG培养基）：含0.5mg/L维生素B1、0.25mg/L维生素B6、 0.25mg/L烟酸、1mg/L甘氨酸、50mg/L肌醇、20g/L蔗糖、0.5mg/L玉米素、0.5mg/L IAA、8g/L琼脂的1/2MS培养基；pH=5.8。

恢复培养基：Dicamba浓度为1.5mg/L，其它同Adi诱导培养基。

实施例1、实验条件的摸索

一、干胚组织的制备

均匀打碎小麦品种“辽春18号”的籽粒，先过9目网筛去除大颗粒，再过30目网 筛去除小颗粒，从粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取胚组织（淡黄色，形状 似月牙，大小为1-2mm，占破碎组织的40%左右），放到1.5ml离心管中备用。筛选过程 中的照片见图1，A和B为粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒，C为粒度介于9目筛和30 目筛之间的胚乳颗粒，D粒度介于9目筛和30目筛之间的胚的颗粒。

二、消毒时间的摸索

1、取步骤一得到的胚组织，先用无菌水洗2-3次，然后用2.5g/100ml次氯酸钠水 溶液消毒（分别采用30秒、1分钟、2分钟或3分钟的消毒时间），再用无菌水冲洗3-5 次。

2、将完成步骤1后的胚组织接种至诱导培养基（每个培养皿80个胚组织），25℃ 暗培养1周，统计愈伤组织生成率和污染数。

每种消毒时间处理后的胚组织接种3培养皿诱导培养基。愈伤组织生成率=该皿中 的生成愈伤组织的胚组织的数量÷接种的胚组织的数量×100%。污染数为三个培养皿 中存在污染发生的培养皿的数量。

采用30秒消毒时间后，胚组织的愈伤组织生成率为95%（3个培养皿的平均值）， 污染数为2。采用1分钟消毒时间后，胚组织的愈伤组织生成率为94.1%（3个培养皿的 平均值），污染数为0。采用2分钟消毒时间后，胚组织的愈伤组织生成率为86.6%（3 皿个培养皿的平均值），污染数为0。采用3分钟消毒时间后，胚组织的愈伤组织生成 率为85.1%（3个培养皿的平均值），污染数为0。结果表明，消毒时间短的消毒效果不 好，消毒时间越长则对干愈伤组织生成率的影响越大，消毒时间为1分钟时愈伤组织 生成率较高且消毒效果也较好（没有污染），因此建议最佳消毒时间为1分钟。

三、存放时间对胚组织生成愈伤组织的能力的影响

取步骤一刚刚制备的胚组织或步骤一制备后室温存放半年的胚组织分别进行如 下实验：（1）取胚组织，先用无菌水洗2-3次，然后用2.5g/100ml次氯酸钠水溶液消 毒1分钟，再用无菌水冲洗3-5次；（2）将完成步骤（1）后的胚组织接种诱导培养基 （每个培养皿80个胚组织，重复3个培养皿），25℃暗培养1周，统计愈伤组织生成率。

刚刚制备的胚组织进行上述操作后，愈伤组织生成率为91%（3个培养皿的平均值）。 室温存放半年的组织进行上述操作后，愈伤组织生成率为92%（3个培养皿的平均值）。 通过观察，存放半年和刚刚取出的干胚在愈伤的诱导生长状态没有显著区别。

结果表明，存放时间对胚组织生成愈伤组织的能力基本没有影响。

四、筛选剂浓度的选择

1、不同浓度的草甘膦对诱导阶段的愈伤组织的影响

（1）取步骤一得到的胚组织，先用无菌水洗2-3次，然后用2.5g/100ml次氯酸钠 水溶液消毒1分钟，再用无菌水冲洗3-5次。

（2）将完成步骤（1）后的胚组织接种至含不同浓度的草苷膦（浓度分别为0、1、 2或4mg/L）的诱导培养基，25℃暗培养1周，比较愈伤组织生成情况。各个草甘膦浓 度下，愈伤组织生成情况没有显著差异，因此建议诱导阶段不宜进行筛选工作。

2、不同浓度的草甘膦对分化阶段的愈伤组织的影响

（1）取步骤一得到的胚组织，先用无菌水洗2-3次，然后用2.5g/100ml次氯酸钠 水溶液消毒1分钟，再用无菌水冲洗3-5次。

（2）将完成步骤（1）后的胚组织接种至诱导培养基（每个培养皿80个胚组织， 重复3个培养皿），25℃暗培养2周。

（3）将步骤（2）得到的愈伤组织转移到含不同浓度的草甘膦（浓度分别为0、 0.25、0.5、0.75、1或1.25mg/L）的分化基础培养基，25℃、光照12小时/黑暗12 小时的条件下培养一个月。

步骤（3）中培养一个月后的照片见图2。在草甘膦浓度为0.75mg/L的条件下培 养一个月，培养一周后出苗，再生苗在生长过程中逐渐变黄、枯萎，培养一个月后最 后全部死亡。建议草甘膦的最佳筛选浓度为0.75mg/L。

实施例2、本发明提供的方法的应用

1、均匀打碎小麦品种“辽春18号”的籽粒，先过9目网筛去除大颗粒，再过30目 网筛去除小颗粒，从粒度介于9目筛和30目筛之间的颗粒中挑取胚组织（淡黄色，形 状似月牙，大小为1-2mm，占破碎组织的40%左右），放到1.5ml离心管中备用。

2、取步骤1得到的胚组织，先用无菌水洗2-3次，然后用2.5g/100ml次氯酸钠水 溶液消毒1分钟，再用无菌水冲洗3-5次。

3、将完成步骤2后的胚组织接种至诱导培养基（每个培养皿80个胚组织，重复 3个培养皿），25℃暗培养1周（照片见图3A）。愈伤组织生成率为94.9%（3个培养 皿的平均值）。

4、将完成步骤3的愈伤组织转移到高渗培养基（共400个愈伤组织，每个培养 皿80个愈伤组织），25℃暗培养4-6小时；然后用基因枪轰击pBAC35SIH3载体（每 个培养皿轰击5次），25℃暗培养16-18小时；然后转移到恢复培养基，25℃暗培养1 周。

5、将完成步骤4的愈伤组织转移到含0.75mg/L草甘膦的筛选基础培养基，25℃、 光照12小时/黑暗12小时的条件下培养一周，然后转移至含0.75mg/L草甘膦的分化 基础培养基，25℃、光照12小时/黑暗12小时的条件下培养一个月(照片见图4A)。

6、将步骤5得到的再生苗转移至含0.75mg/L草甘膦的生根壮苗培养基，25℃、 光照12小时/黑暗12小时的条件下培养。

得到14株再生苗。

筛选再生率=（筛选苗数/基因枪轰击的愈伤数）×100%=14/400×100%=3.5%。

实施例3、对照方法

1、取小麦品种“辽春18号”的籽粒，先用70%（体积比）酒精水溶液浸泡10分钟， 再用2.5g/100ml次氯酸钠水溶液浸泡25分钟。

2、取完成步骤1的种子，用水浸泡12小时。

3、取完成步骤2的种子，用次氯酸钠溶液浸泡15分钟。

4、取完成步骤3的种子，用尖刀轻轻刮种子胚部5-6次，将碎末（每个胚的碎 末接种至诱导培养基的同一位置，作为1个）接种至诱导培养基，25℃暗培养1周（照 片见图3B）。愈伤组织生成率为94.1%（3个培养皿的平均值）。

5、同实施例2的步骤4。

6、同实施例2的步骤5。愈伤组织在含0.75mg/L草甘膦的分化基础培养基，25℃、 光照12小时/黑暗12小时的条件下培养一个月的照片见图4B。

7、同实施例2的步骤6。

得到16株再生苗。筛选再生率=4%。

本发明提供的方法与对照方法的比较见表1。

综上所述，本发明提供的方法的消毒、保存及接种均比刮胚法方便，可以大大的 节省劳动力，实现快速大规模的选胚工作，这便可以在较耗费劳动力的小麦组培技术 上有一个较大的突破，进而可以大大方便小麦遗传转化的进行。本发明提供的方法也 可以进一步推广至玉米水稻等转基因研究中，此外，离体干胚在常温下保存半年也能 诱导出愈伤，因此可用于种植资源的保存研究，大大节约保存空间。