利用幼胚拯救技术获得小报春与岩生报春种间杂种的方法

摘要

本发明提供一种利用幼胚拯救技术获得小报春与岩生报春种间杂种的方法，选择原产我国的报春属小报春与岩生报春进行杂交，采用子房培养手段进行幼胚拯救，对获得的后代材料进行杂种形态学鉴定，选择茎、叶、花期、花序等形态学特征介于双亲之间，出现双亲不具有的新的性状的后代材料，即为种间杂交新品种。实现了报春花属种间远缘杂交，获得了一批杂种新种质。

说明书

技术领域

本发明属于育种领域，具体地说，涉及利用幼胚拯救技术获得小报春与岩生报春种间杂种的方法。 

背景技术

报春花属（Primula）是报春花科(Primulae)最大的属，全世界约500种，我国约300种（陈封怀和胡启明，1990），报春大多早春开花，花色丰富而艳丽，具有很高的观赏价值。报春花属植物多数种类为多年生宿根花卉，少数为一两年生，叶基生，成莲座状叶丛。花两型，分长短花柱，有利于异花传粉，花冠漏斗状或高脚碟状；花序为1-3层伞形花序，少数种类花成穗状或头状花序，花色丰富，有粉、红、黄、橙、紫、蓝、褐色等，很多种类是盆栽、花境、野趣园和岩石园的良好材料。 

在种间杂交育种中，育种家利用二倍体翠南报春(Primula sieboldii)和二倍体P.kisoana进行种间杂交，结合胚拯救获得了种间杂种，而且杂种后代出现多种倍性，当以翠南报春为母本时，杂交后代是三倍体，以P.kisoana为母本时，杂交后代为二倍体(Kato J,2000)。另外，还以翠南报春为母本、四季报春为父本进行种间杂交，通过胚拯救获得了二倍体杂种后代、三倍体后代和四倍体非杂种后代(Kato J,2001)。以二倍体的藏报春(P.sinensis)和二倍体陕西羽叶报春(P.filchnerae)种间杂交，产生了二倍体和六倍体后代，推测六倍体后代的产生可能是由于三倍体后代染色体加倍形成的(Amano J,et al,2006)。四倍体的球花报春(P.denticulata)和二倍体的长白山报春(P.modesta)进行种间杂交，F1代结实率比较高，而且产生了三倍体、五倍体、六倍体和八倍体等不同倍性的后代，这表明多倍体亲本能提高 种间杂交的结实率(Hayashi M,et al,2007)。以四倍体球花报春(P.denticulata)和二倍体P.rosea种间杂交形成的三倍体后代做母本，与四倍体球花报春做父本进行回交，形成了五倍体的植株(Hayashi M,et al,2009)。 

我国在报春花种间杂交方面的研究很少，尚处于起步阶段。李翠娟（2007）取以灯台报春组的橘红灯台报春（P.bulleyana）、霞红灯台报春（P.beesiana）与海仙花报春（P.poissonii）为亲本，进行种间种间杂交后，以未成熟子房为外植体进行胚拯救，成功获得种间杂交苗201株。报春花组的小报春与报春花（P.malacoides）种间杂交，有较高结实率，灯台报春组内种间杂交，不同组合差异显著，其中桔红灯台报春和霞红灯台报春种间杂交产生种子数量最多，报春的组间杂交存在受精障碍(梁树乐,2006)。因此，利用原产我国的报春花属野生资源，通过幼胚拯救技术获得报春花属报春花组的小报春与指叶报春组的岩生报春的种间杂种，进行报春花种质改良，将是我国报春花优良性状（花色、花型与花期等）育种和抗逆育种取得重要突破的关键所在。 

发明内容

本发明的目的是提供一种利用幼胚拯救技术获得小报春与岩生报春种间杂种的方法。 

为了实现本发明目的，本发明的一种利用幼胚拯救技术获得小报春与岩生报春种间杂种的方法，包括以下步骤： 

1）小报春与岩生报春杂交：利用岩生报春新鲜花粉，以小报春为母本进行人工去雄并套袋隔离，重复授粉2-3次（优选3次），将授粉后的小报春置于温室内培养； 

2）幼胚拯救及杂交后代的获得：取杂交授粉后25-30d的小报春子房，以75%酒精进行表面消毒（优选消毒30s）后，置于含吐温20的次氯酸钠溶液中灭菌，然后用无菌水冲洗（优选冲洗5次），沥干或吸干表面水分，切开子房取出未成熟的种子接种至培养基I中，于20-25 ℃，每日光照10-12h，光照度1600-2000lx的条件下进行培养；25-30d后，将得到的幼苗转接至培养基II中壮苗，于20-25℃，每日光照10-12h，光照度1600-2000lx的条件下进行培养；25-30d后，将得到的幼苗转接至培养基III中，于20-25℃，每日光照10-12h，光照度1600-2000lx的条件下进行扩繁，即获得小报春与岩生报春杂交后代； 

3）种间杂种鉴定：对获得的杂交后代进行杂种形态学鉴定。选择茎、叶、花期、花序等形态学特征介于双亲之间，出现双亲不具有的新的性状的后代材料，即为最终获得的小报春与岩生报春种间杂交新品种。 

其中，培养基I为：1/2MS+50g/l蔗糖+0.1mg/l NAA+0.1mg/l6-BA+6g/l琼脂；培养基II为：1/2MS+30g/l蔗糖+6g/l琼脂；培养基III为：1/2MS+30g/l蔗糖+0.1mg/l NAA+2.0mg/l6-BA+6g/l琼脂。 

前述方法中，步骤2）中所述含吐温20的次氯酸钠溶液中有效氯含量为2%，吐温20含量为1-1.5mL/L，灭菌15min。 

本发明具有以下优点： 

（一）本发明利用我国原产的报春花属植物小报春与岩生报春，采用幼胚拯救技术进行报春花种质改良，促进了小报春与岩生报春之间的遗传交流，合并了两个种的优异基因，实现了报春花属种间远缘杂交，获得了一批新种质。 

（二）使利用改良的报春花种质进行报春花进行育种成为可能，为报春花起源演化和报春属亲缘关系的研究奠定基础。 

（三）达到丰富报春花基因库，获得父母本优异性状（基因）的目标，形成一整套系统的报春花品种改良和育种新方法。 

附图说明

图1为岩生报春（左）、杂种后代1（中）与小报春（右）株型、花与叶的对比图。 

图2为岩生报春（左）、杂种后代2（中）与小报春（右）株型、 花与叶的对比图。 

图3为岩生报春（左）、杂种后代3（中）与小报春（右）株型、花与叶的对比图。 

图4为岩生报春（左）、杂种后代4（中）与小报春（右）株型、花与叶的对比图。 

图5为岩生报春（左）、杂种后代5（中）与小报春（右）株型、花与叶的对比图。 

图6为岩生报春（左）、杂种后代6（中）与小报春（右）株型、花与叶的对比图。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 

实施例利用幼胚拯救技术获得小报春与岩生报春种间杂种的方法 

1.小报春与岩生报春种间杂交后代材料的获得 

1.1材料选择 

选择原产我国的报春花属报春花组小报春(Primula forbesii)与报春花属指叶报春组岩生报春(Primula saxatilis)。 

1.2幼胚拯救及杂种获得 

于北京林业大学温室内进行杂交，以小报春为母本进行人工去雄并套袋隔离，采集岩生报春花粉，于上午9-11时或下午3-5时授粉，重复授粉3次；杂交后采用子房培养手段进行幼胚拯救，接种时取杂交授粉后25-30d的子房，以75%酒精表面消毒30s后置于有效氯为2%的次氯酸钠溶液（吐温20含量为1.5mL/L）中灭菌15min，无菌水冲洗5次后，用镊子和手术刀将子房切开取未成熟的种子接入1/2MS+50g/l蔗糖+0.1mg/l NAA+0.1mg/l6-BA+6g/l琼脂培养基上，于20-25℃，每日光照10-12h，光照度1600-2000lx的条件下进行培养。30d后将得到 的幼苗转入生根培养基（1/2MS+30g/l蔗糖+6g/l琼脂）壮苗，30d后幼苗转入1/2MS+30g/l蔗糖+0.1mg/l NAA+2.0mg/l6-BA+6g/l琼脂的培养基中扩繁，培养温度20-25℃，每日光照10-12h，光照度1600-2000lx，获得报春花属小报春（2n=2x=18）与岩生报春（2n=2x=24）的种间杂交后代材料。 

1.3小报春与岩生报春组间杂种的鉴定 

将杂交父母本及后代材料杂种于10月份同时在温室进行盆栽，12月起开始对杂交父母本及后代材料的形态学进行观察与统计。后代材料的茎、叶、花序等形态学特征介于双亲之间、出现双亲不具有的新的性状，即可判定其为真杂种。 

对杂交父母本及杂种后代材料的初步观察表明：新材料的株型、冠幅、株高、叶、花眼、花萼与花序等形态特征介于双亲之间，具有父母本综合性状。小报春全株被白粉、花葶绿色、花萼反卷；岩生报春全株无白粉、花葶节部深红色、花萼不反卷；小报春与岩生报春杂种全株仅花萼被白粉、花葶节部淡紫红色、花萼不反卷。小报春、岩生报春与小报春×岩生报春杂种后代的形态特征描述如下： 

小报春：株高14.2-21.0cm，冠幅29.5-40.1cm，群体花期12月11号-翌年6月10号，叶长9.4cm、宽5.9cm、叶柄长11.6cm，花径2.26cm、花筒长0.61cm，最多花轮数5，总花序长48.9cm，全株被白粉，花葶绿色，花萼反卷。 

岩生报春：株高9.8-14.2cm，冠幅22.3-31.6cm，群体花期12月11号-6月28号，叶长9.0cm、宽9.1cm、叶柄长8.2cm，花径2.41cm、花筒长1.34cm，最多花轮数2，总花序长21.2cm，全株无白粉、花葶节部深红色、花萼不反卷。 

杂种后代1：株高7.2-11.5cm，冠幅12.3-24.2cm，群体花期12月15号-翌年5月10号，叶长6.3cm、宽5.7cm、叶柄长7.7cm，花径2.06cm、花筒长0.79cm，最多花轮数6，总花序长46.2cm，花萼被白粉，花葶 节部淡紫红色，花萼不反卷。（图1） 

杂种后代2：株高7.5-10.7cm，冠幅14.4-25.1cm，群体花期12月15号-翌年5月10号，叶长5.8cm、宽5.4cm、叶柄长8.0cm，花径2.13cm、花筒长0.93cm，最多花轮数6，总花序长46.2cm，花萼被白粉，花葶节部淡紫红色，花萼不反卷。（图2） 

杂种后代3：株高9.2-12.5cm，冠幅19.6-27.6cm，群体花期12月13号-翌年5月10号，叶长7.2cm、宽5.9cm、叶柄长8.5cm，花径2.29cm、花筒长0.95cm，最多花轮数6，总花序长46.2cm，花萼被白粉，花葶节部淡紫红色，花萼不反卷。（图3） 

杂种后代4：株高6.5-9.3cm，冠幅13.1-19.1cm，群体花期12月13号-翌年5月10号，叶长4.2cm、宽4.5cm、叶柄长6.7cm，花径1.86cm、花筒长0.81cm，最多花轮数6，总花序长46.2cm，花萼被白粉，花葶节部淡紫红色，花萼不反卷。（图4） 

杂种后代5：株高7.8-11.9cm，冠幅15.5-28.3cm，群体花期12月11号-翌年5月10号，叶长4.3cm、宽6.1cm、叶柄长10.1cm，花径1.65cm、花筒长0.89cm，最多花轮数6，总花序长46.2cm，花萼被白粉，花葶节部淡紫红色，花萼不反卷。（图5） 

杂种后代6：株高8.6-12.6cm，冠幅17.5-24.7cm，群体花期12月27号-翌年5月10号，叶长9.3cm、宽7.5cm、叶柄长12.5cm，花径1.94cm、花筒长0.94cm，最多花轮数6，总花序长46.2cm，花萼被白粉，花葶节部淡紫红色，花萼不反卷。（图6） 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。