惠楼山药的脱毒快繁方法

摘要

本发明公开了一种惠楼山药的脱毒快繁方法，从正在生长的植株中，选择生长健壮，无病虫的植株，剪取带有茎尖的茎蔓，去掉可见叶，消毒灭菌，利用解剖针剥离茎尖含1-2个叶原基，快速接种到分化与诱导培养基中；通过病毒检测后，将脱毒无菌苗剪成带有1-2个节间的茎段转接到增殖培养基中；选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有1-2个节间的小段转入生根培养基中，生根后进行炼苗。本发明的方法可人为的控制培养基生长条件，不受自然条件的影响，取材量小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，管理方便，利于产业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物的组织培养脱毒与快繁技术，确切地说是用 山药的茎尖分生组织进行脱毒、茎段无性组织培养进行快繁，以及组 织培养扩繁时所用的营养物质—培养基的配比。

背景技术

山药是一种介于粮食和蔬菜之间的食物，我国年产量居世界之 首，既可大规模集约化生产，也可小面积庭院栽培。但由于我市及周 边地区山药栽培历史悠久，山药病毒危害相当严重，田块发病率 100%，品种感病率100%。山药感染病毒后，导致品种退化，产量下 降30%以上，严重的田块产量下降50%以上，有的甚至绝收；山药病 毒已成为导致山药种性退化产量下降的重要原因，每年造成经济损失 近亿元。只有采用无性营养体进行组织培养脱毒快繁，才能保持原品 种全部的遗传性和实现该品种种质的一致性。

植物组织培养脱毒与快繁技术近几年飞快发展，已广泛应用在花 卉、林果、蔬菜以及农作物上。植物不同其培养方法也不同，即使是 一种植物，但品种不同培养方法亦不尽相同。也就是说在同一种植物 内的每一个品种，都有它各自的生长发育规律，以及适宜生长发育所 需要的营养和环境条件。因此，惠楼山药的组织培养脱毒与快繁技术， 适宜的惠楼山药茎尖分生组织培养和茎段组培快繁，最佳培养基和外 界环境条件，与其他植物的培养物质和环境条件也是不同的。

发明内容

本发明的目的是提供一种山药的组培脱毒与快繁技术以及用于 山药组培快繁的培养物质，通过无性营养体进行组织培养脱毒快繁， 一是不受季节限制，实现多次、快速、高系数繁殖；二是可保证原品 种全部的遗传性和该品种品质的一致性。为了实现本发明的目的，拟 采用如下技术方案：

本发明的组培繁育方法包括如下步骤：

（1）分化培养

从正在生长的山药植株中，选择生长健壮，无病虫的植株，剪取 带有茎尖的茎蔓，去掉可见叶，在流动的自来水中冲洗，拮干水分； 在无菌室内的超净工作台上，用酒精和升汞溶液灭菌，无菌水冲洗5-7 遍，采用解剖镜，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.1-0.3毫米，带 1-2个叶原基，接种到分化与诱导培养基中；然后在温度25±2℃，日 照系数12-14h光照强度2200-2500LX的条件下培养；24-26d后重新转 入分化培养基中继续培养，40-50d后培养瓶内小苗长出5-7片叶，除 去病苗弱苗，其余的快繁一次，待苗子长出7-9片叶时进行病毒检测；

（2）茎尖苗带毒检测

脱毒茎尖苗和在形态长势上差异明显，脱毒茎尖苗生长快，叶色 浓，植株健壮；带毒茎尖苗长势弱叶色淡，叶片上有明显花叶明脉或 褪绿斑；经目测，把带毒症状明显的茎尖苗除去；用血清学检测法对 剩余的山药茎尖苗进行检测，去除对山药危害严重的PVA、PVM、 PLRV、PVS、PVX、PVY和马铃薯卷叶病毒的茎尖苗；

（3）增殖培养

通过病毒检测后，剩下的无毒苗进行快繁，在超净工作台上，将 脱毒无菌苗剪成带有1-2个节间的茎段转接到继代与增殖培养基中进 行增殖培养，PH5.6-5.8，在温度26-28℃，光照12-14h/d，光照强度 2000-2500lx，湿度65-70%的环境条件下进行培养；20-25d后形成4-5 个丛生芽，28-35d生长高度4-6cm左右，在同一培养基上继代繁殖， 继代周期为25-28d；循环往复6次以上；

（4）生根培养

选取生长势强、健壮的无菌芽切成含有1-2个节间的小段，长 1.0-1.5cm，转入生根培养基中，，培养温度26±2℃，湿度65-75%， 光照强度2200-2500LX，光照时间12-14h/d，25-28d后选取长出3-5 条0.3-3cm长的根以及展开叶3-5片的植株，待苗长至30-35d时，进行 炼苗移栽；

（5）炼苗与移栽

练苗前首先揭开培养瓶的封口膜，练苗时逐步调节湿度和温度使 得其接近自然环境，练苗时间为5-7天，然后取出，用自来水冲洗净 苗基部的培养基，并灭菌，然后移栽到已灭过菌的腐殖质、碎炉渣、 珍珠岩以3-5：1-2：1-2的比例混合的基质中，前期适当遮阴并保持湿 度在90%，逐步降至70-75%，15天后去掉薄膜罩，定期杀菌，7-10天 一次，共计2-3次。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤1）中的灭菌过程 是指采用重量百分比为70-80%的酒精浸泡15-25秒钟，用百分比为 0.05-0.15%的升汞溶液灭菌6-11分钟。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的山药是惠楼山药。

本发明的培养物质及配比：

惠楼山药的脱毒快繁的培养物质：由基本培养基、生长调节剂加 椰汁、蔗糖和琼脂组成分化与诱导培养基、继代与增殖培养基和生根 培养基。基本培养基为MS，基本培养基MS的配置方法为公知技术， 生长调节剂由6-苄基腺嘌呤（6-BA）、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）、a- 萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IBA）、玉米素（ZT）组合而成。

1、分化与诱导培养基：MS基本培养基1升加6-苄基腺嘌呤（6-BA） 1.0-3.5mg、a-萘乙酸（NAA）0.5-3.0mg、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D） 0.2-2.5mg、玉米素（ZT）0.1-0.3mg、椰汁100-200mg、蔗糖30g、琼 脂6.5g；

2、继代与增殖培养基：MS基本培养基1升加6-苄基腺嘌呤（6-BA） 1.0-3.0mg、a-萘乙酸（NAA）0.5-2.0mg、吲哚丁酸（IBA）0.2-1.5mg、 玉米素（ZT）0.1-0.3mg、蔗糖30g、琼脂6g；

3、生根培养基：1/2MS基本培养基1升加a-萘乙酸（NAA） 0.5-2.0mg、蔗糖20g、琼脂6g。

本发明的积极效果是：

1、利用“惠楼山药”的茎尖脱毒、茎段快繁，解决了年复一年 用零余子繁殖、块根顶部繁殖导致“惠楼山药”病毒病严重、使新育 品种品质变劣、种质退化、产量降低等难题；脱毒后在保持原品种特 征特性的基础上，纯化了种质，增强了品种抗疫性，提高了品质和产 量，增产30%以上，并且薯皮光滑，薯块耐储存；

2、快繁克服了传统的块根顶部繁殖速度慢的弊端，1年内1个生 长点或1个茎段可增殖70-80万个，1个人1年内可快繁10-15万个与母 体生理特征完全一致的小植株，可实现工厂化育苗、高效率生产；

3、可人为的控制培养生长条件，不受自然条件的影响，取材量 小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，管理方便，利于产业 化生产；

4、培养基质是腐殖质、碎炉渣、珍珠岩以4：1：1比例混合的物 质，既经济又有效，降低了生产成本；

5、采用脱毒山药苗三级育苗体系和无病毒甘薯种苗的繁殖更新， 有效地防止了品种退化，确保了种质纯度。

具体实施方式

本实施例是用河南豫东四大特产之一“惠楼山药”进行组培快 繁的实例。

1、分化与诱导培养

从正在生长的植株中，选择生长健壮，无病虫，具有本品种特征 特性的植株，剪取带有茎尖的茎蔓，去掉可见叶，在流动的自来水中 冲洗20-30min，拮干水分待用。在无菌室内的超净工作台上，用重量 百分比为75%的酒精浸泡20秒钟，0.1%的升汞溶液灭菌8-12分钟，无 菌水冲洗5-7遍，在借助于60-80倍解剖镜下，利用解剖针剥离茎尖， 所剥茎尖为0.1-0.3毫米，带1-2个叶原基，快速接种到分化与诱导培养 基：MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）3.0mg/L+a-萘乙酸（NAA）1.0mg/L+2.4- 二氯苯氧乙酸（2.4-D）1mg/L+玉米素（ZT）0.2mg/L+椰汁120mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L中，封口后做好标记，然后在温度26±2℃， 日照系数16h，光照强度2200-2500LX的条件下培养。20d后重新转入 分化培养基中继续培养，40-50d后培养瓶内小苗长出5-7片叶，除去 病苗弱苗，其余的进行编号并快繁一次，待苗子长出7-9片叶时即可 以进行病毒检测。

2、增殖培养

通过病毒检测后，不符合标准的全部淘汰，剩下的无毒苗加速快 繁。在超净工作台上，将脱毒无菌苗剪成带有1-2个节间的茎段转接 到增殖培养基：MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）2.0mg/L+a-萘乙酸（NAA） 1mg/L+吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L+玉米素（ZT）0.2mg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂6g/L中进行增殖培养，PH5.6-5.8，在温度26-28℃，光照12-14h/d， 光照强度2200-2500lx，湿度65-70%的环境条件下进行培养。28-35d 生长高度5cm左右，即可在同一培养基上继代繁殖，继代周期为 25-28d。循环往复，增殖倍数6以上。

3、生根培养

选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有1-2个节间的小段长 1.0-1.5cm转入生根培养基：1/2MS+a-萘乙酸（NAA）1mg/L+蔗糖 20g/L+琼脂6g/L中，25-28d有95%以上的植株长出3-5条0.3-3cm长的 根，展开叶3-5片，待苗长至30-35d时，即可炼苗移栽，培养温度 （26±2）℃，湿度65-75%，光照强度2200-2500LX，光照时间12-14h/d。

4、炼苗与移栽

炼苗前首先揭开培养瓶的封口膜，炼苗时间5-7天，炼苗时在保 证温、湿度的条件下，逐步接近自然环境，以利提高成活率，然后小 心取出，用自来水冲洗净苗基部的培养基，并灭菌，然后移栽到已灭 过菌的腐殖质与碎炉渣以2:1的比例混合的基质中，前期适当遮阴并 保持湿度在90%，逐步降至70-75%，15天后去掉薄膜罩，定期杀菌， 7-10天一次，共计2-3次，成活率达95%以上。

采取组织培养脱毒和快速繁殖新技术，对脱毒山药进行无性繁 殖，是解决生产和市场对其大量需求的一个有效途径。1年内1个生长 点或1个茎段可增殖70-80万个，1个人1年内可快繁10-15万个与母体 生理特征完全一致的小植株，可实现工厂化育苗、高效率生产。而且 所培育的品种适宜种植范围广，产量1800-2500kg/亩，脱毒后较脱毒 前增产38.9%，对促进农民增收、农业增效具有很大的意义。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发 明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限 定的保护范围为准。