一种来源于鲤链霉菌的海洋微生物多糖及其制备方法

摘要

本发明公开了一种来源于鲤链霉菌的海洋微生物多糖及其制备方法，本发明采用海洋来源的鲤链霉菌

说明书

技术领域

本发明属于海洋微生物领域，具体涉及一种来源于鲤链霉菌的海洋微生物多糖及其制备方法。

背景技术

海洋蕴含着丰富的微生物资源，由于特殊的生活环境，导致海洋微生物的合成过程与陆地微生物不同，产生许多结构新颖作用特殊的活性多糖。有关海洋微生物胞外多糖的研究日益受到关注，从一般环境海洋微生物、海洋生物共附生微生物以及海洋特殊环境微生物中，已经分离得到许多新颖多糖类化合物。研究表明，这类多糖大多是由多种单糖按照一定比例及连接方式组成的杂多糖。单糖组成涉及到五碳糖中的阿拉伯糖、核糖、木糖，六碳糖中的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、鼠李糖和岩藻糖，氨基糖中的葡萄糖胺、半乳糖胺，酸性糖中的葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸。其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖最为常见。非糖组分如醋酸、琥珀酸、丙酮酸、磷酸及硫酸也会以酰基、半缩醛及醚的形式取代在多糖上。近年来，新颖结构的甘露聚糖和硫酸半乳聚糖也从海洋微生物发酵液中分离得到。但迄今尚未见有关以3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖为组成单元的线性同聚物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于鲤链霉菌的海洋微生物多糖及其制备方法，所述海洋微生物多糖是3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖以α-2,8连接的线性同聚物，它由海洋来源的鲤链霉菌Streptomyces carpaticus OUCMDZ-726发酵制备而得。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

鲤链霉菌OUCMDZ-726，其分类命名为鲤链霉菌Streptomyces carpaticus，其保藏编号为：CGMCC 7461。

来源于所述鲤链霉菌的海洋微生物多糖，它是3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖以α-2,8连接的线性同聚物，其结构分子式如式Ⅰ所示：其中，n=25； 

式I。

本发明还提供了所述的海洋微生物多糖的制备方法，它包括以下步骤：

发酵培养所述鲤链霉菌OUCMDZ-726，获取含有所述海洋微生物多糖的发酵物，再从该发酵物中分离出发酵液，将所得发酵液浓缩，脱盐，将除去盐后的多糖溶液浓缩，干燥后加水溶解，使溶液中多糖的重量百分比浓度为0.1%~10%；然后通过离子交换色谱柱分离、凝胶色谱柱分离，将所得多糖溶液浓缩，脱盐，将脱盐后的溶液浓缩，干燥，制备出式I所述多糖。

进一步的，所述发酵培养采用高氏一号合成培养基，在28~30℃恒温培养箱中培养。

进一步的，所述脱盐采用透析的方法。

进一步的，所述浓缩为减压浓缩。

进一步的，所述离子交换色谱柱分离为用色谱柱Q Sepharose Fast Flow，所用的洗脱液依次分别为蒸馏水、0.3 mol/L氯化钠水溶液和0.6 mol/L氯化钠水溶液。

进一步的，所述的凝胶色谱柱分离为用色谱柱Sephadex G-100，所用的洗脱液为蒸馏水。

进一步的，所述的干燥为冷冻干燥；或用加入3~6倍体积的95%乙醇使多糖沉淀，将所得沉淀在40~80℃烘箱中干燥0.01~8 小时。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明首次从海洋微生物鲤链霉菌Streptomyces carpaticus OUCMDZ-726发酵液中分离到以3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖为组成单元以α-2，8连接的线性同聚物。本发明的式I多糖的结构独特，来源于海洋微生物，可用于生产研究新型药物的前体或中间体，使其能得到充分利用，其功能和活性能得到广泛的开发。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1A是所述微生物多糖（3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖以α-2,8连接的线性同聚物）的高效凝胶渗透色谱。

图1B 是多糖标准品的分子量对数对保留时间（高效凝胶渗透色谱法测定）绘制的标准曲线及其回归方程。

图2是所述微生物多糖的红外光谱。

图3是所述微生物多糖经降解得到的寡糖在凝胶色谱柱Bio-Gel P 4的分离纯化图。

图4是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的ESI-MS谱。

图5是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F3的ESI-MS谱。

图6是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F4的ESI-MS谱。

图7是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F5的ESI-MS谱。

图8是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F6的ESI-MS谱。

图9A是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F6的碎片离子m/z 1267的ESI-CID-MS/MS谱。

图9B是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F6的质谱断裂模式示意图。

图10A是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F5的碎片离子m/z 1017的ESI-CID-MS/MS谱。

图10B是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F5的质谱断裂模式示意图。

图11A是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F4的碎片离子m/z 767的ESI-CID-MS/MS谱。

图11B是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F4的质谱断裂模式示意图。

图12是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的¹³C NMR谱。

图13是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的¹H NMR谱。

图14是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的DEPT谱。

图15是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的¹H-¹³C HMQC谱。

图16是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的¹H-¹³C HMQC部分放大谱。

图17是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的¹H-¹H COSY谱。

图18是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的¹H-¹H COSY部分放大谱。

图19是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的¹H-¹³C HMBC谱。

图20是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F2的¹H-¹³C HMBC部分放大谱。

图21是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F3的¹H-¹H COSY谱。

图22是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F3的¹H-¹H COSY部分放大谱。

图23是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F3的¹H-¹³C HMBC谱。

图24是所述微生物多糖经降解得到的寡糖组分F3的¹H NMR谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一、     鲤链霉菌的保藏

本发明所述鲤链霉菌由广东湛江泥样中分离得到，其为一种海洋微生物, 革兰氏阳性细菌。在高氏一号合成培养基上培养其基丝呈灰色，气丝呈灰色。

该菌株的16S rDNA基因序列编号是KC832293.1（基因编号是GI:483124984），所述菌株经形态特征和16S rDNA序列鉴定为鲤链霉菌Streptomyces carpaticus OUCMDZ-726。该菌株已于2013年4月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年4月11日；鲤链霉菌Streptomyces carpaticus保藏编号：CGMCC No. 7461。  

二、所述微生物多糖的具体制备方法如下：

1、发酵生产

微生物的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取所述鲤链霉菌Streptomyces carpaticus OUCMDZ-726适量，接种于高氏一号琼脂固体斜面培养基上，在28℃培养箱中培养7天。

取斜面培养7天的鲤链霉菌Streptomyces carpaticus OUCMDZ-726适量，接种到一个含100毫升种子培养液（培养基组成：可溶性淀粉20 g，KNO₃ 1 g，K₂HPO₄ ·3H₂O 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄ 0.01 g，NaCl 0.5 g，琼脂20 g，无菌海水1升，pH 7.5）的三角烧瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获种子培养基。

取该种子培养液，按5%接种量分别接种于100个内装100毫升生产培养液（培养基组成同种子培养液培养基）的三角烧瓶中，装载于28℃、120转/分钟摇床上进行为期7天的生产发酵，获得含有式I多糖的发酵物。相同条件下发酵两次，共获发酵物60升。

2、含所述微生物多糖的发酵液粗提物的制备

    将所述鲤链霉菌Streptomyces carpaticus OUCMDZ-726的发酵物（约60升）抽滤，滤取液体部分，用活性炭脱色，即在100℃水浴中将1.5%活性炭缓慢加入到发酵液中保温5~10 分钟，待溶液冷却至室温后，用含有硅藻土滤饼的布氏漏斗抽滤至干即可。脱色后的溶液浓缩至一定体积。将预冷2 小时的95%的乙醇缓慢加入到浓缩液中（体积比5:1），边加边搅拌，有大量白色絮状沉淀析出，把醇沉后的溶液放入冰箱中静止过夜。倾出上层清液，沉淀部分用布氏漏斗三层滤纸抽滤，并依次用无水乙醇数次脱水后于40℃烘干，将其溶于适量蒸馏水后的上清液置于截留分子量为3500 道尔顿的透析袋中透析2天，电导率仪测试透析后外液至恒定值时停止透析，将透析液浓缩干燥，得含式I多糖的粗品（26.5g）。

3 所述微生物多糖I的分离精制

取含式I多糖的多糖粗品配成浓度为每毫升含60 mg的粗多糖的溶液，通过阴离子交换柱Q Sepharose Fast Flow分离，依次分别用蒸馏水、0.3 mol/L氯化钠水溶液、0.6 mol/L氯化钠水溶液洗脱2个柱体积，收集0.6 mol/L氯化钠水溶液的洗脱液，将所得多糖溶液减压浓缩，然后进行透析去除盐，将除去盐后的多糖溶液减压浓缩，干燥后加蒸馏水溶解，使溶液中多糖的重量百分比浓度为5%。

再通过凝胶色谱柱Sephadex G-100进一步分离，用蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚法检测，收集多糖洗脱峰的洗脱液，将所得多糖溶液减压浓缩，然后进行透析去除盐，将除去盐后的多糖溶液减压浓缩，干燥，得所述微生物多糖I 纯品（1.968 g）。

所述步骤2和3中的干燥为冷冻干燥或用加入3~6倍体积的95%乙醇使多糖沉淀，将所得沉淀在40~80℃烘箱中干燥0.01~8 小时。

三、所述微生物多糖I的结构分析

所述微生物多糖I的纯度和分子量通过高效凝胶渗透色谱法测定，结果如图1A所示，由图1A可知，微生物多糖I呈现单一对称峰，说明微生物多糖I的纯度高；在同样的分析条件下，绘制各种多糖标准品（分子量：84.4，47.1，25.5，12.5，9.6，5.7和2.5千道尔顿）的分子量对数对保留时间的标准曲线，并获得标准曲线的回归方程（图1B），通过将微生物多糖I的保留时间代入标准曲线回归方程，计算得到微生物多糖I的平均分子量约为6.2千道尔顿。

所述微生物多糖I的红外光谱（IR）如图2所示。波数3402 cm^–1的强吸收峰为O-H的伸缩振动，2938 cm^–1吸收峰为C-H的伸缩振动，1732 cm^–1吸收峰为-COOH中C=O伸缩振动，1615 cm^–1吸收峰为C=O非对称伸缩振动，1401 cm^–1吸收峰为C=O对称伸缩振动，1213 cm^–1吸收峰为-COOH中OH变角振动吸收峰，1064 cm^–1吸收峰为C-O-H环内醚的C-O伸缩振动和O–H的变角振动。

为进一步研究所述微生物多糖I的结构，采用酸解法对多糖进行降解，选用凝胶柱Bio-Gel P4对降解产物进行分离纯化。对所得寡糖片段采用电喷雾电离质谱（ESI-MS）测定寡糖片段的分子量，通过电喷雾电离-碰撞诱导解离二级质谱（ESI-CID-MS/MS）和核磁共振氢谱（¹H NMR）、核磁共振碳谱（¹³C NMR）、无畸变极化转移增强谱（DEPT）、同核化学位移相关谱（¹H-¹H COSY）、异核多量子化学位移相关谱（¹H-¹³C HMQC）和异核多键化学位移相关谱（¹H-¹³C HMBC）等技术相结合对寡糖组分的结构进行研究，最终确定多糖I的结构。

所述微生物多糖I的降解：所述微生物多糖I配成重量百分比浓度为1%的溶液，加入适量盐酸至反应体系盐酸浓度为0.01 mol/L，在30 ℃，40℃，50℃和60℃时各反应1~6小时分析比较了不同条件对降解的影响，采用高效薄层层析对降解产物进行对比分析检测多糖降解情况。最终选定0.01 mol/L盐酸在60℃降解3小时作为降解条件制备所述微生物多糖I的寡糖。  

寡糖的制备：采用凝胶柱Bio-Gel P4（100×1.6 cm）层析柱对多糖I的降解产物进行分离，洗脱液为0.2 mol/L碳酸氢铵，采用示差检测器在线检测，收集主峰部分，浓缩，冷冻干燥。所得寡糖在相同条件下进行二次纯化，收集主峰部分，脱盐后冻干即得寡糖。所得寡糖依次命名为F2、F3、F4、F5和F6。多糖I降解所得寡糖产物在凝胶Bio-Gel P4层析柱的分离纯化，如图3所示。

寡糖分子量的确定：通过负离子方式的ESI-MS谱分析各寡糖组分的分子量（图4～图8），结果表明F2、F3、F4、F5、F6的分子量分别为268、518、768、1018和1268道尔顿。

寡糖的序列分析：应用电喷雾电离质谱并利用撞击分散诱导技术对所得的均一片段的寡糖进行序列分析。首先，对寡糖组分F6进行序列分析，其ESI-CID-MS/MS谱如图9A所示。从图中可以看到几个较为显著的质谱峰：质荷比（m/z） 249，267，499，517，749，767，999和1017分别代表了从糖苷键的断裂产生的环间断裂碎片离子B₁/ Z₁、C₁/ Y₁、B₂/Z₂、C₂/ Y₂、B₃/Z₃、C₃/Y₃、和B₄/Z₄、C₄/Y₄，这些碎片分别是来源于五糖—F6组分的还原端和非还原端的特征离子碎片，并进一步证明此寡糖。另外，靠近m/z 499和m/z 749附近还出现了两个奇特的碎片峰：m/z 455和m/z 705。它们互相间均有44的差异，因此推断上述两碎片峰是三糖和二糖存在的羧基在高能场中发生脱羧的现象所导致。寡糖组分F6的质谱断裂模式示意图如图9B所示。

对寡糖组分F5进行ESI-CID-MS/MS分析，与F6碎片相比，F5的ESI-CID-MS/MS谱中除了少了更大的分子量碎片1267，如图10A所示，图谱中出现了与F6完全相同的碎片峰，如m/z 249，267，499，517，749和767，即分别代表从糖苷键的断裂产生的环间断裂的碎片离子B₁/ Z₁、C₁/ Y₁、B₂/Z₂、C₂/ Y₂和B₃/Z₃。寡糖组分F5的质谱断裂模式示意图如图10B所示。

通过观察寡糖组分F4的ESI-CID-MS/MS谱（图11A）发现同样情况，出现相同的从糖苷键的断裂产生的环间断裂的碎片离子B₁/ Z₁、C₁/ Y₁、B₂/Z₂的m/z 249，267，499和517峰。寡糖组分F4 的质谱断裂模式示意图如图11B所示。

由此可推断多糖I的重复单元是糖残基分子量为250的化合物，即3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。这与前面通过一级质谱测得的各寡糖组分F2～F6之间的分子量均有250道尔顿的差异相一致，寡糖组分F2（268道尔顿）恰好是此差值加上一分子水（18道尔顿），其中535为二聚体的分子离子峰，那么假设F2（268道尔顿）是多糖I的重复单位，而寡糖组分F3（518道尔顿）是两个这样的重复单位减去一分子水，同理道理可推断寡糖组分F4（768道尔顿）是三个这样的重复单位减去两分子水；寡糖组分F5（1018道尔顿）是四个这样的重复单位减去三分子水；寡糖组分F6（1268道尔顿）是五个这样的重复单位减去四分子水。为进一步确定其结构将继续采用¹H NMR, ¹³C NMR, DEPT, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMQC 和¹H-¹³C HMBC谱对寡糖组分F2的化学结构进行解析，以最终确定其结构。

寡糖组分F2的¹³C NMR谱（图12）共有9个碳信号，并按其从低场到高场的顺序依次编号为C1～C9。在化学位移176.8 ppm处有羧基碳的特征信号峰。¹H NMR谱（图13）中除活泼氢外共有九个氢信号，在3.40～3.80 ppm有7个连氧氢信号，较高场区有两个sp³杂化氢2.01 ppm和1.62 ppm。 ¹³C NMR和DEPT谱（图14）提示结构中含有1个羧基（176.9 ppm），1个半缩醛季碳（96.5 ppm），5个连氧的sp³杂化的叔碳（68.3，69.2，70.4，70.7，71.6 ppm），1个连氧的sp3杂化的仲碳（63.4 ppm），另外还有1个较高场的sp³杂化的仲碳（39.2 ppm）。根据其¹H NMR和¹³C NMR谱的数据，推测结构中应含有糖环。

继续解析寡糖组分F2的二维核磁共振波谱的数据 (¹H-¹³C HMQC，¹H-¹³C HMBC，¹H-¹H COSY)。根据¹H-¹³C HMQC谱（图15，16）对各个碳原子上的氢原子进行归属。在¹H-¹H COSY谱（图17，18）中，可以推测从H3到H9之间的信号。再观察¹H-¹³C HMBC谱（图19，20），根据H9a、H9b（a平伏健，b直立健）与C1和C2之间的相关信号，而且C1是个羧基只能连在末端，可以推测C2与C9相连，而C1只能连在C2上。由于C2是连氧碳，而化学位移及其偏低场，可推断C2是羧酮结构，连两个“O”。最后根据H3与C2之间信号相关，所以C3应该与C2隔一个氧相连，即C2与C3之间通过1个氧相连，形成一个六元糖环结构，最终确定化合物为带有羧基的酸性九碳糖化合物，F2的结构分子式如下所示：

其分子量与ESI-MS确定的分子量268道尔顿相一致，可进一步准确证明从海洋微生物Streptomyces carpaticus OUCMDZ-726中提取到的胞外多糖的重复结构单元为3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。

为了阐明多糖I的连接方式，进一步解析寡糖组分F3的二维核磁共振波谱。在¹H-¹H COSY谱（图21，22）中高场区的1.54 ppm和2.53 ppm同碳氢耦合说明这两个氢为C3上的两个氢，因其化学位移值是非连氧碳上的氢，也可推断只能是C3上的氢；同时把该化合物所有的氢信号进行归属。¹H-¹³C HMBC谱（图23）给出的信号，可发现C2与H8信号相关，证明该寡糖组分F3即二糖之间的连接方式为2，8连接的3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。同时结合寡糖组分F3的¹H NMR谱（图24）可进一步证明寡糖的结构单元为由α-2，8连接的3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖组成的直链结构。

   综合寡糖组分F2和F3的核磁共振波谱、寡糖的电喷雾负离子各离子峰的表征和电喷雾电离-碰撞诱导解离二级质谱的序列分析，并根据多糖的分子量6.2千道尔顿，可确定多糖I是α-2，8连接的25个3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖单元组成的聚合物，海洋微生物多糖的结构分子式如下： 

式I

其中n=25。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。