一种筛选烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种的PCR引物

摘要

本发明涉及一种筛选烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种的PCR引物，该PCR引物是针对SEQ ID NO.1所示核酸序列设计的，其上游引物为SEQ ID NO.2所示序列，下游引物为SEQID NO.3所示序列。本发明所述PCR引物可用于筛选烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种，而且具有方便快捷、重复性好的优点。

说明书

技术领域

本发明涉生物化学领域，具体涉及一种烟草的核酸检测方法。

背景技术

烟草特有亚硝胺（TSNA）是由硝酸盐、亚硝酸盐和烟草生物碱作为前体物质而形成的可 疑人体致癌物质，它主要包括N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-亚硝基甲基氮)-1-(3-吡啶 基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟草碱(NAT)。近年来烟草及其制 品中TSNA的研究受到广泛的关注，研究表明卷烟烟气中所含有的多种致癌物质以烟草特有的 亚硝胺为主，且其含量与主流烟气中焦油的含量没有相关性。现阶段，降低卷烟烟气中有害 成分一般都是通过降低卷烟的焦油释放量来实现的，所采用的方法主要是利用有接装滤嘴和 应用滤嘴通风稀释技术、使用高透气度和静燃速度快的卷烟纸、掺用烟草薄片、掺用膨胀烟 丝和膨胀梗丝等。但这种方法对于卷烟烟气中的有害成分如烟草特有亚硝胺等物质则难以进 行选择性滤除。

上世纪80年代Hoffmann等（Hoffmann D，Adarns JD，Brunnemann KD and Hecht SS. Formation，occurance，and carcinogenecity of N-nitrosamines in tobacco products.N-nitro  compounds.ACS Symposium Series，1981，174:247-259）分析烟气中TSNA含量的研究表明， 卷烟烟气中有40%左右的TSNA来自烟叶，而其余的可能产生于热解合成反应；但随后的进一 步研究表明烟气中的TSNA含量主要来自于卷烟的烟叶（李勇.卷烟主流烟气中几类有害化合 物分析技术的研究与应用.湘潭大学硕士论文，2007），因此降低卷烟烟叶中的TSNA含量就可 以减少吸烟者所受TSNA危害的程度，提高卷烟的安全性。

影响烟叶TSNA含量的主要因素包括烟草的基因型、其前体物的含量、采收调制方式和时 间、微生物和施氮量等因素（朱风鹏，赵明月，胡清源.TSNA的形成、影响因素、分析及清除 方法综述.烟草科技，2004(7):27-30）。从TSNA形成的前体来看，生物碱是直接前体物，它可 与亚硝酸发生亚硝化反应生成NNK、NNN、NAT和NAB等。多年研究表明生物碱代谢中的两 个关键酶（喹啉酸磷酸核糖转移酶，QPT；腐胺氮甲基转移酶，PMT）可调控烟叶中的生物 碱含量，利用转基因方法限制这二个酶的活性可以极显著的减少调制后烟叶中生物碱含量和 TSNA的含量，并据此申请了利用转基因方法改变烟草叶片中烟碱和TSNA含量的专利 （Conkling MA.Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco.2005，US Patent6907887）。 尽管利用转基因技术可以实现降低烟叶中TSNA的目标，但该技术存在的明显不足，其一是在 减少烟叶中TSNA含量的同时，烟叶中的烟碱含量明显降低，造成烟叶的利用价值下降；二是 我国烟草行业目前禁止使用任何形式的转基因烟草产品，因此该技术不能在中国应用。另外， 改变烟叶的采收和调制方式、微生物数量和施氮量等措施和方法可降低烟叶TSNA含量，但同 时也可能降低烟叶其他品质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种筛选烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种的PCR扩 增引物，该引物不仅可用于烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种的筛选，而且具有方便快捷、 重复性好的优点。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

一种筛选烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种的PCR引物，该PCR引物是针对SEQ ID  NO.1所示核酸序列设计的，其上游引物为SEQ ID NO.2所示序列，下游引物为SEQ ID NO.3 所示序列。

上述方案中，烟草特有亚硝胺(Tobacco-Specific Nitrosamines，TSNA)是指N-亚硝基去 甲基烟碱(NNN)、4-(N-亚硝基甲基氮)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB) 和N-亚硝基新烟草碱(NAT)，在本领域中通常用其英文缩写TSNA表示。

上述方案中，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为83bp，分子类型为DNA，从第56个碱基 起（包括第56个碱基）随后具有3个TCT的重复序列。

上述方案中，所述的PCR引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3是由生工生物工程（上海） 股份有限公司按本发明人所提供的序列合成的。

本发明人长期对各种不同烟草类型的遗传基因进行研究分析，发现SEQ ID NO.1所示核 酸序列与烟叶中烟草特有亚硝胺（TSNA）含量直接相关，因此上述PCR引物可用于烟草特 有亚硝胺含量低的烟草品种的筛选，具体筛选方法由以下步骤组成：

（Ⅰ）分别取3叶期以后的各种烟草苗株的叶片，并采用以下方法获得每一种烟草苗株的 基因组DNA：①称取0.1～0.5g叶片，搁置于研钵中，加入30mL的液氮，轻轻捣碎叶片，等 液氮快挥发完时，快速研磨到粉状，把粉末转移到2mL无菌离心管中；②加入650μL预热的 缓冲液，振荡1～2分钟，立即放入65℃水浴锅中保温45min～2h；所述保温期间，每隔15min 轻微振荡3至4次；所述的缓冲液内含2％（g/mL）CTAB、20mmol/L EDTA、100mmol/L Tris-HCl （pH8.0）、1.4mol/L NaCl和体积百分比为2％的β-巯基乙醇；③从水浴锅中取出样品管，加 入650μL预冷的体积比为氯仿∶异戊醇=24∶1的氯仿和异戊醇，盖好管盖后缓慢上下颠倒摇 动5～10min；④在14000r/min下离心10min，然后用移液枪缓慢吸取上层清液约500μL到1.5 mL离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻上下摇动离心管；⑤静置5～10min，然后在 13000r/min条件下离心5min，小心吸出上清液；⑥加入70%乙醇600μL洗涤沉淀，5000转/ 分条件下离心去上清液，重复洗涤沉淀1次；⑦室温下通风柜中干燥DNA沉淀，在见到无色 胶状物附在管壁时，加入100μL双蒸馏水溶解沉淀的DNA，置于-20℃冰箱中保存备用；

（Ⅱ）以每一种烟草苗株的基因组DNA为模板，再以5’ -TCCTCTTTTCTACGCTCTAACTT-3’（SEQ ID NO.2）为上游引物，以5’ -GAGTCGACGACGACGACGA-3’（SEQ ID NO.3）为下游引物，按常规PCR进行扩增，获 得每一种烟草苗株的扩增片段；

（Ⅲ）将每一种烟草苗株的扩增片段上样于浓度为4%（g/mL）的琼脂糖凝胶的样品孔 中，并以DNA ladder marker为标记进行琼脂糖电泳；所述的琼脂糖凝胶中含有溴化乙锭，且 溴化乙锭的含量为500ng/mL；

（Ⅳ）当扩增片段中具有83bp的条带（即SEQ ID NO.1）时，所对应的烟草苗株即为烟 草特有亚硝胺含量低的烟草品种。

利用本发明所述的PCR引物筛选出的烟草品种不仅成熟烟叶中的烟草特有亚硝胺含量低 于20ng/g，而且可保持烟草的其他品质，较转基因烟草还具有更容易被广大消费者接受的优 点；本发明所述的筛选方法既方便快捷，又有很好的重复性，具有广泛的推广价值。

附图说明

图1为19种烟草苗株的扩增片段的琼脂糖电泳图，图中，1至19分别为NC89、CF20、 TI245、粤红一号、丰字6号、大白筋599、S1640、NC27NF、C316、云烟85、C48、许金1 号、KE1、RG112、索马里5号、青梗、TN90、81-26、KY14的扩增产物的电泳条带，M为 DNA ladder marker的电泳条带。

具体实施方式

实施例1（烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种的筛选方法）

1、每一种烟草苗株的基因组DNA的制备：

采用漂浮育苗技术，对NC89、CF20、TI245、粤红一号、丰字6号、大白筋599、S1640、 NC27NF、C316、云烟85、C48、许金1号、KE1、RG112、索马里5号、青梗、TN90、81-26 和KY14等19个烟草品种进行育苗，取3叶期各品种的烟草苗株各1株，分别截取各品种的 叶片并采用以下方法获得每一种烟草苗株的基因组DNA：①称取0.1～0.5g叶片，搁置于研 钵中，加入30mL的液氮，轻轻捣碎叶片，等液氮快挥发完时，快速研磨到粉状，把粉末转 移到2mL无菌离心管中；②加入650μL预热的缓冲液，振荡1～2分钟，立即放入65℃水 浴锅中保温45min～2h；所述保温期间，每隔15min轻微振荡3至4次；所述的缓冲液内含 2％（g/mL）CTAB、20mmol/L EDTA、100mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1.4mol/L NaCl和 体积百分比为2％的β-巯基乙醇；③从水浴锅中取出样品管，加入650μL预冷的体积比为氯 仿∶异戊醇=24∶1的氯仿和异戊醇，盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5～10min；④在14000 r/min下离心10min，然后用移液枪缓慢吸取上层清液约500μL到1.5mL离心管中，加入2/3 体积预冷的异丙醇，轻轻上下摇动离心管；⑤静置5～10min，然后在13000r/min条件下离 心5min，小心吸出上清液；⑥加入70%乙醇600μL洗涤沉淀，5000转/分条件下离心去上 清液，重复洗涤沉淀1次；⑦室温下通风柜中干燥DNA沉淀，在见到无色胶状物附在管壁 时，加入100μL双蒸水溶解沉淀的DNA，置于-20℃冰箱中保存备用。

2、PCR扩增：

以步骤1所得到的每一种烟草基因组DNA作为PCR扩增的DNA模板，以 5′-TCCTCTTTTCTACGCTCTAACTT-3′（SEQ ID No.2）为正向引物， 5′-GAGTCGACGACGACGACGA-3′）（SEQ ID No.3）为反向引物进行PCR扩增。PCR扩增 体系的总体积为10μL，内含1×PCR反应缓冲液，2.5mM MgCl₂，230μM dNTP，0.3μM正向 和反向引物，1μ的DNA聚合酶和20-50ng模板DNA。扩增程序为：94℃变性5min后进入 循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min，共35个循环，最后一步为72℃7min延伸，获得 每一种烟草苗株的PCR扩增产物。

3、烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种的确定：

将每一种烟草苗株的扩增片段上样于浓度为4%（g/mL）的琼脂糖凝胶的样品孔中，进 行琼脂糖电泳；电泳条件为：电压100V，电泳时间为45min，以DNA MarkerⅡ（DNA ladder  marker）作为DNA分子大小的标准，并将电泳结果在凝胶成像系统中拍照，得到如图1所示 的琼脂糖凝胶电泳图。上述的琼脂糖凝胶中含有溴化乙锭，且溴化乙锭的含量为500ng/mL。

由图1可见，NC89、CF20、TI245、粤红一号、丰字6号、S1640、NC27NF、C316、C48、 KE1、RG112、索马里5号、81-26和KY14烟草苗株基因组DNA的扩增片段中具有83bp 的条带，它们所对应的烟草苗株即为烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种。

实施例2（SEQ ID NO.1与烟叶中烟草特有亚硝胺含量的相关性研究）

1、栽培

取实施例1中步骤1所培育的NC89、CF20、TI245、粤红一号、丰字6号、大白筋599、 S1640、NC27NF、C316、云烟85、C48、许金1号、KE1、RG112、索马里5号、青梗、TN90、 81-26和KY14烟草品种的苗株各20株，移栽种植于广东省南雄市古市镇溪口村大田，110 天后采收成熟的中部烟叶。

2、与烟草特有亚硝胺含量相关的基因序列的检测

2.1将步骤1所得到的成熟烟叶采用实施例1相同的方法分别先提取基因组DNA再进行 PCR扩增；

2.2分别取步骤2.1和实施例1步骤2所得到的成熟烟叶与烟草苗株的扩增片段，送交 生工生物工程（上海）股份有限公司和华大基因公司分别进行二次双向测序，以DNAMAN 等生物信息学软件分析，取具有相同扩增片段大小的呈现同源性100%的DNA序列，结果显 示，19种烟草苗株及其对应的成熟烟叶中，NC89、CF20、TI245、粤红一号、丰字6号、S1640、 NC27NF、C316、C48、KE1、RG112、索马里5号、81-26和KY14这14种烟草苗株及其对 应的成熟烟叶的DNA序列均如SEQ ID NO.1所示。

3、成熟烟叶（未调制）中烟草特有亚硝胺含量的检测

（1）取步骤1所得到的19种成熟烟叶适量，除去主脉的叶片置于研钵中，加入液氮研 磨成粉末并过40目筛。

（2）准确称取1.000g待测烟粉用0.1%乙酸铵的水溶液（用双蒸水配制）超声萃取30min， 萃取液与等体积的乙腈（溶液中含有100ng/mL内标）混合，高速离心分离后取上层清液， 经0.22μm水系微孔滤膜过滤。

（3）滤液进入液相色谱-串联质谱联用仪，选择离子扫描检测，采用同位素内标法定量。 每种类型的TSNA，选择单一的同位素作内标，根据组分峰和内标物峰的面积比进行定量分析。

为更好地分离待测组分，首先探讨得出采用水-乙腈体系对4种烟草特有亚硝胺的分离效 果。结果显示，使用Waters Xterra C8柱，在流动相为水-乙腈体系（V/V=10/90，含0.01%乙 酸铵），柱温为50℃，流速为0.3mL/min时，能够使四种烟草特有亚硝胺在4min内实现完全 的色谱基线分离，内标d₄-NNN、d₄-NNK、d₄-NAT、d₄-NAB的流出性能分别与NNN、NNK、 NAT和NAB一致。各待测成分的保留时间分别为：NNN和d₄-NNN；1.18-1.22min；NNK 和d₄-NNK，1.25-1.30min；NAT和d₄-NAT，1.42-1.48min；NAB和d₄-NAB，1.50-1.60min。 然后在正离子模式下，利用针泵直接将混合有1.0mg/L的NNN、d₄-NNN、NNK、d₄-NNK、 NAT、d₄-NAT、NAB和d₄-NAB的标准溶液流动注射入质谱仪，先进行母离子全扫描，准确 找出[M+H]⁺峰，然后分别以此为母离子进行轰击，找出信号较强的碎片离子，以母离子与子 离子组成检测离子对，以多反应监测方式获得4种烟草特有亚硝胺及内标的最佳参数。在确 定的参数条件下，将所配制的TSNA标准系列溶液由低到高浓度依次进样分析，确定出四种 烟草特有亚硝胺在标准系列范围内呈良好的线性关系的检出限，之后检测待测样品的四种烟 草特有亚硝胺含量。具体测定参数如下：

其中液相色谱条件为：①色谱柱：Waters Xterra C8柱(50mm高×2.1mm内径，粒径3.5 μm)；②流动相：0.1%乙酸铵的水–乙腈混合溶液（体积比为10﹕90）；③洗脱方式：等度洗 脱，流速0.30mL/min；④柱温：50℃；⑤运行时间：4min；⑥样品进样量：10μL。

质谱条件为：①电离方式：电喷雾离子化正离子模式(ESI+)；②电离电压：5000V；③ 离子源温度：400℃；④碰撞能量：10V；⑤碰撞气压力：0.3Pa；⑥辅助气流速：7L/min； ⑥扫描时间：0.2s；⑦监测模式：多反应监测（MRM）。

（4）将上述通过LC-MS/MS检测的数据记录下来便得到如下表1所示的结果。由表1 可见，实施例1所筛选出烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种，即NC89、CF20、TI245、粤红 一号、丰字6号、S1640、NC27NF、C316、C48、KE1、RG112、索马里5号、81-26和KY14 这14种成熟烟叶中的总烟草特有亚硝胺含量较低，均小于20ng/g。

比较上述步骤2和3的结果可见，SEQ ID NO.1所示的核酸序列与烟叶中烟草特有亚硝 胺含量密切相关，可用于烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种的筛选。

表1

实施例3（本发明所述烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种筛选方法的重复性的研究）

将实施例筛选出的NC89、CF20、TI245、粤红一号、丰字6号、S1640、NC27NF、C316、 C48、KE1、RG112、索马里5号、81-26和KY14这14种烟草特有亚硝胺含量低的烟草品种 进行育苗，取苗株各20株，于2011年2月26日移栽种植于广东省南雄市古市镇溪口村大田， 6月上旬采收成熟的中部烟叶。然后将所获得的成熟烟叶按实施例2步骤3所述的方法进行 烟草特有亚硝胺含量的检测，其结果如下表2所示：

表2

上表2的结果表明，本发明所述的筛选方法重复性好，具有广泛的推广价值。