BIP4基因在控制水稻抗旱性中的应用

摘要

本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够调控干旱耐受能力的水稻BIP4基因及其在水稻抗旱性遗传改良中的应用。所述BIP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过筛选抗旱正调控因子OsbZIP23的互作蛋白，克隆到水稻抗旱性的负调控因子BIP4，BIP4基因的T-DNA插入突变体可以显著提高转基因水稻的抗干旱能力，证实了该基因的功能及其在作物抗旱遗传改良中的应用途径。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够调控干旱耐受能力 的水稻BIP4基因及其在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明通过筛选抗旱正调控因子OsbZIP23的互作 蛋白，克隆到水稻抗旱性的负调控因子BIP4，BIP4基因的T-DNA插入突变体可以显著提高转基因水稻的 抗干旱能力，证实了该基因的功能及其在作物抗旱遗传改良中的应用途径。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，随着环境问题日益严重，水稻生产也面临许多新的挑战，其中 非常重要的一个就是各种非生物逆境对水稻生长发育的影响。全球很多耕地是干旱、半干旱地区，而且很 多受到盐害威胁，水资源短缺以及土壤盐渍化等问题十分严重。随着全球生态环境日益恶化，自然灾害日 益频发，各种环境胁迫严重影响了水稻等作物生长发育，使其遗传潜力难以发挥，造成产量降低。因此， 提高水稻抵抗各种非生物逆境(尤其是干旱和高盐胁迫)的能力已经成为现代植物研究工作中急需解决的 关键问题之一。通过转基因技术对水稻品种进行抗逆性遗传改良是其中重要的一条途径，而寻找水稻中可 真正用于抗逆性遗传改良的基因是其中的关键。植物对逆境的应答反应是一个涉及多基因、多信号途径的 复杂过程。许多基因被证明受逆境诱导并在植物对逆境的耐性方面发挥作用(Shinozaki等，Gene  Expression and Signal Transduction in Water-Stress Response.Plant Physiol，1997，115：327-334)。 这些基因及其表达产物可以分为三类：参与信号级联放大系统和转录调控的基因及产物，如一些激酶和转 录因子；直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。 其中转录因子在植物对非生物胁迫的应答反应中起着非常重要的作用。它们在胁迫诱导下不断合成，调控 一系列下游基因的表达，将信号传递和放大，引起植物生理生化方面的改变，最终使其产生相应的抗逆性 (Hirayama T，Shinozaki K，Research on plant abiotic stress responses in the post-genome era： past，present and future.Plant J，2010，61：1041-1052)。如拟南芥的DREB2A转录因子通过调控许 多下游抗逆基因的表达，从而参与对干旱、高温和低温等多种非生物逆境的应答(Sakuma等，Functional  Analysis of an Arabidopsis Transcription Factor，DREB2A，Involved in Drought-Responsive Gene  Expression.Plant cell，2006，18，1292-1309；Sakuma等，Dual function of an Arabidopsis  transcription factor DREB2A in water-stress-responsive and heat-stress-responsive gene  expression.PNAS，2006，103，18822-18827)。水稻中已鉴定许多转录调控相关基因参与抗旱应答过程， 包括bZIP、NAC、AP2类等家族成员(Fukao T，Xiong L，Genetic mechanisms conferring adaptation to  submergence and drought in rice：simple or complex？Current Opinion in Plant Bielegy，2013)

在植物逆境应答过程中，转录因子主要通过结合下游基因的启动子来调控下游基因的表达，从而实现 逆境信号的传递，而这种转录调控也有许多其它蛋白的参与，其它蛋白的协同、拮抗作用在逆境应答中也 扮演关键的角色。比如，拟南芥WRKY33转录因子参与植株抗病反应，当含有VQ-motif的蛋白SIGMA FACTOR  BINDING PROTEIN(SIB1和SIB2)与其发生互作后，可以大大提高WRKY33与靶基因启动子的结合活性，从而对 其转录激活功能起协同作用(Lai等，Arabidopsis sigma factor binding proteins are activators of the  WRKY33 transcription factor in plant defense.Plant cell，2011，23，3824-3841)。另外也有研究报 道，WRKY8受高盐胁迫等逆境的强烈诱导表达，且调控一系列下游逆境应答基因的表达，介导了植物对高 盐胁迫的耐受性。进一步研究表明，WRKY8因子也与含有VQ-motif的蛋白VQ9蛋白在细胞核内相互作用形成 蛋白复合物。VQ9蛋白也受高盐胁迫的强烈诱导。但是，体外结合试验(EMSA)证实VQ9蛋白会降低WRKY8 因子的DNA结合能力，对WRKY8的转录激活功能起拮抗的作用(Hu等，Arabidopsis transcription factor  WRKY8 functions antagonistically with its interacting partner VQ9 to modulate salinity stress  tolerance.The Plant Journal.2013)。另外，除了互作蛋白与转录因子以协同或拮抗的方式调控靶基因 的表达外，也有互作蛋白对转录因子本身进行调控的例子，比如DREB2A的互作蛋白DRIP1和DRIP2是两个泛 素连接酶，它们可以调控DREB2A的蛋白降解从而参与调控植物的抗逆应答(Qin等，Arabidopsis  DREB2A-interacting proteins function as RING F3 ligases and negatively regulate plant drought  stress-responsive gene expression.Plant cell，2008，20，1693-1707)。

水稻是重要的粮食作物和模式植物，在极端气候条件频发的今天，培育抗逆性增强的水稻具有重要的 意义，鉴定抗逆应答相关的基因是进行抗逆转基因育种的关键。以已经鉴定的抗逆基因为线索，进一步筛 选参与抗逆应答的基因不失为一种相对快捷可靠的方法。OsbZIP23是本室已报道的一个正调控ABA信号和 抗旱性的重要转录因子(Xiang等，2008)。因此，本发明从水稻中分离出一个OsbZIP23的互作蛋白BIP4， 并鉴定它的突变体在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意 义。

发明内容

本发明的目的涉及一个OsbZIP23互作蛋白BIP4在控制水稻抗旱性改良中的应用。本发明通过对BIP4 基因的功能鉴定发现BIP4是水稻抗旱性的负调控因子，抑制表达BIP4基因的T-DNA插入突变体bip4-1，以 及完全敲除BIP4基因表达的T-DNA插入突变体bip4-2都使水稻抗旱性增强。BIP4基因的核苷酸序列如序列 表SEQ ID NO：1所示，序列长度为1206bp，它对应的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示，编码401个氨基酸 序列。

鉴于抑制BIP4基因表达的突变体bip4-1表现出抗旱性增强的能力，可使用包括本发明的BIP4基因的抑 制表达载体转化宿主(包括水稻在内的多种植物)，培育抗旱植物品种。携带有本发明BIP4基因的抑制表 达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物 细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463； Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2nd Edition))。

可将本发明的基因的相关核苷酸片段与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的抑制表达载 体，并转化植物宿主，在干旱条件下可抑制表达该基因，提高植物抗旱性。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的包含有BIP4基因编码区的核苷酸序列，序列长度为1206bp， 它对应的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码401个氨基酸序列。

图1.验证OsbZIP23和BIP4互作。图中：A，酵母双杂交验证OsbZIP23和BIP4互作。CK+和CK-分 别表示阳性和阴性对照。SC-LTH指缺失亮氨酸、色氨酸和组氨酸的培养基。B，利用在水稻原生质体进行 的双分子荧光互补验证OsbZIP23与BIP4的互作。nYFP和cYFP分别指YFP的N端和C端。

图2.BIP4和OsbZIP23受脱落酸(ABA)和干旱诱导表达。横坐标指取样时间点，“h”指代小时， “d”指代天数，“Re”指代干旱后复水。

图3.bip4T-DNA插入突变体鉴定。图中A，BIP4基因结构及T-DNA插入位点。黑框示意外显子区域。 B，bip4-2基因型鉴定。6为纯合，基因组特异引物(F和R)和T-DNA特异引物(T)的位置分别在A中 用箭头表示。C，实时定量PCR检测BIP4在突变体和野生型中的表达量。引物扩增位置在A中用星号表示。

图4.在水稻中超表达BIP4。图中：A，BIP4超表达载体BIP4-pU1301的T-DNA区示意图。B，用实时 荧光定量检测转基因植株的表达量。转化产生的23株转基因植株中有9株是表达量得到较大提高(大于 25倍)。

图5.bip4T-DNA插入突变体对ABA的敏感性增强。bip4两个等位突变体(bip4-1和bip4-2)和野生 型(WT)在正常(Normal)或含有3μM脱落酸(ABA)的培养基上生长情况。

图6.BIP4超表达减弱植株对ABA的敏感性。图中：A，BIP4超表达家系(编号OF-20、OE-23)、阴 性家系(编号CK7和CK14)和野生型(WT)在正常(Normal)或含有3μM ABA(ABA-1，ABA-2)的培养 基上生长情况。B，图A中实验材料的苗长和根长统计。

图7.bip4T-DNA插入突变体的抗旱性鉴定。图中：A，bip4两个等位突变体(编号bip4-1和bip4-2) 和野生型(WT)在正常(Normal)或干旱胁迫下(Drought)的表型。B，bip4突变体和对照在苗期干旱胁 迫后的存活率统计。

图8.OsbZIP23的靶基因的表达量和BIP4的表达量呈负相关。图中，A.OsbZIP23靶基因在BIP4超 表达植株中表达量下降。OE-20和OE-23为BIP4超表达家系，WT指野生型。RAB21和OsPP2C是两个受 OsbZIP23正调控的靶基因。B.OsbZIP23靶基因在bip4突变体植株(bip4-2)中表达量上升，WT指野生型。

图9.是BD融合载体pDEST32的图谱。

图10.是AD融合载体pDEST22的图谱。

图11.是载体pVYNE和pVYCE图谱(详细信息参见文献，Rainer Waadt等，2008，Multicolor  bimolecular fluorescence complementation reveals simultaneous formation of alternative CBL/CIPK  complexes in planta)。

图12.是空载体pU1301的图谱。

图13.超表达目标载体BIP4-pU1301的图谱。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有BIP4基因完整编码区段的DNA片段，以及 验证BIP4基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征， 并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和 条件。

1、验证OsbZIP23和BIP4的互作

我们用OsbZIP23作为诱饵筛选了水稻胁迫条件下叶片的酵母双杂交cDNA文库，筛选得到一个受逆境 胁迫诱导表达的互作蛋白，将其命名为BIP4(OsbZIP23-interacting protein 4)，BIP4在水稻基因组注 释网站RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上功能注释为unknown function protein，注释号 为LOC_Os03g11550，KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)上BIP4基因的注释号为AK100623， 该基因的完整核苷酸序列见SEQ ID NO：1所示，其编码区核苷酸长度为1206bp，该核苷酸序列对应的蛋 白质的氨基酸序列为401个。中于筛选酵母双杂交文库得到克隆不包括完整的BIP4基因的ORF(Open  reading frame，开放阅读框)，为了对BIP4基因进行后续功能验证，我们在华中农业大学作物遗传改良 国家重点实验室明恢63全生育期平衡化cDNA文库(Chu等，2003)中检索到一个含有BIP4基因编码区5’ 部分序列的cDNA克隆(克隆号：EI#84-J20)(该文库对外公开的网址： http://redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/)。从文库中挑取该克隆，抽提质粒，利用通用引物SP6 (5’-ATTTAGGTGACACTATA-3’)、T7(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)从两端进行了测序验证，测序工作 在ABI7500仪器上完成。然后与KOME数据库中的BIP4基因的全长cDNA进行序列比较，确定克隆EI#84-J20 包含BIP4基因的完整开放阅读框(ORF，open reading frame)。

为了验证OsbZIP23和BIP4的互作，我们首先将BIP4全长构建到BD融合载体pDEST32(购自Invitrogen 公司，质粒图见所附载体图1)，将OsbZIP23构建到AD融合载体pDEST22(购自Invitrogen公司，质粒 图见所附载体图2)，再将它们共转化酵母菌株进行互作检测。结果共转化两个载体的酵母菌株能激活报 告基因His和LacZ的表达，说明两个蛋白在酵母系统内确实是能够互作的(图1A)。另外，为了进一步 验证酵母双杂交的结果，我们利用双分子荧光互补实验(BiFC，bimolecular fluorescence  complementation)来验证OsbZIP23和BIP4在体内互作的情况。我们将OsbZIP23构建到载体pVYNE(Kudla 博士惠赠，质粒图见所附载体图3，详细信息参见文献Waadt等，2008，Multicolor bimolecular  fluorescence complementation reveals simultaneous formation of alternative CBL/CIPK  complexes in planta)上与YFP的N端1-155氨基酸融合(OsbZIP23-nYFP)，BIP4构建到pVYCE(Kudla 博士惠赠，质粒图见所附载体图3)上与YFP的C端156-239氨基酸融合(BIP4-cYFP)，将两个载体共 转化水稻原生质体，孵育过夜后用激光共聚焦显微镜观察。如果两个蛋白互作会形成一个完整的YFP蛋白， 产生黄色荧光，反之检测不到荧光。实验结果显示，OsbZIP23-nYFP和BIP4-cYFP共转的原生质体中能 检测到黄色荧光(见图1，B)，而阴性对照实验中，上述两个载体与相应的空载体转化的原生质体中均检 测不到荧光，结果说明OsbZIP23和BIP4在体内也是互作的。

2、检测水稻内源BIP4基因的表达水平

前期查找本室芯片数据(未发表数据)显示BIP4受逆境胁迫诱导表达，为了确认这个结果，我们用 实时荧光定量PCR检测BIP4的逆境表达谱，并同时与OsbZIP23的逆境表达谱进行了比较(图2)。申请 人选用粳稻品种“中花11”(简称ZH11，来自中国农业科学院作物研究所商业品种)作为表达谱分析的 材料。生长至4叶期幼苗进行干旱和脱落酸(ABA)的处理。干旱处理是不浇水让其自然干燥0d、1d、3d、 6d以及复水12小时后取样，ABA处理是100μM的ABA均匀的喷洒水稻植株表面后并加到幼苗根部， 0h，3h，6h，12h后取样。总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照 TRIZOL试剂说明书，利用反转录酶SSIII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据 Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃5min，50℃60min，70℃10min。以上述 反转录合成的cDNA为模板，用引物(BIP4RealT-F：5’-GGTGAGGATTGTCTGTGTTTGC-3’和BIP4RealT-R： 5’-CCTCCGGCGTGCTTCA-3’)对BIP4基因进行特异的PCR扩增。同时用引物(actin76F：5’- TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和actin76R：5’-TGCACAAT GGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actinl基因(登录 号：X16280)做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：95℃10sec； 95℃5sec，60℃34sec，45个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。检测结果显示，BIP4 和OsbZIP23一样受到ABA和干旱的诱导表达，不过两者受诱导的具体模式有所不同。OsbZIP23在ABA和 干旱处理的初期就开始诱导表达，随着处理程度的加深，受诱导程度逐渐增强，且诱导幅度很大。而BIP4 在干旱处理的初始阶段表达量并没有变化，只是在处理晚期才诱导表达，且诱导幅度相对较小。在复水 恢复阶段，两个基因的表达量部恢复到正常水平(图2)。

3、构建bip4基基因T-DNA插入突变体材料

为了鉴定bip4基因是否具有抗逆功能，我们从韩国POSTECH植物功能基因组实验室(Plant Functional  Genomics Laboratory)的Rice T-DNA Insertion Sequence Database(RISD)突变体库购买了BIP4的两个 T-DNA插入突变体1D-03345和3A-14659)(分别命名为bip4-1和bip4-2)，相关信息可以检索地址 http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE。产生突变体株系所用载体和遗传转化方法可参照相关文献 (Jeong等.Generation of a flanking sequence-tag database for activation-tagging lines in  japonica rice.Plant J.2006，45：123-32)，限于篇幅本说明书不再展开描述。其中在上述突变体库网 站中所登录的bip4两个突变体的侧翼序列分别如下：

bip4-1：GGCTGCNATACCTGCATATAACCTGTAAGATTTAGCACCCCAAGTTAGTCATGTAATTAGCCACATAGCAAAAAAAATAGCACC GTGGCAGCAATGGCGGATTACTCGCTCGGTCAGTTCTTGGCTCACCACCGTTGGTGTTCCCCTGTTTCTTGGTTCACGCCAGGCGCTTCTT CTTCTTCTTCTCGGATGCNAGAGCTTGCTGTGATTGCTGGCTAGCTAGCTTGCCGGAATGGAGGGCTTCTCGAGGGACTTGCTGTGCGGCA TCGGCAAGGGAGGAGACGGGCCCCGCGGCGAGGTGAGGCCGCGCGTGGACATGGAGGCTGAGGAGGTGGAGCTCAACCTCGGGCTGTCGCT CGGCGGCCGGTTCGGGCTGGACAGGAGAGGGGAGAAGCTCGCCAGGTCGTCGTCGGTCGCGGCCATCTTGGCGGCGCCGACGGAGCCNTCG NCNCCCCNTTCCGGGNCTNTTTNANAANNAACCTCGCTGCNAAACGGTGNCCCCCCGGGAAGCCGAAAAAAAAANCAGGGNGGGAANAAAT TNAAAATTGCCCCCCCCNCAAAGGGGNNGCNGANAANGCAAANCCCNCCGNCCNAAAANTNTTNCCGAAAAANANAAACCCCTTTTTTNGT TTTTNTTNNAAANNAAAAAAGGCCNNANTTTTAAANNCCCCCCCCCNNTTTCCCCNNGGGGGGGGGGGGCNAACCNTTCNTTTNTTTNGNT TTTAANNATTCCNAACCAAACCGATTTTANTNNCTTTTTTTGAAAAAAAANGGGCGGAAATTAANNAANTNAAANAAANTTTTTTGGTAATT CAAGGGAAANNCCCNTTGGAAANNNAAATNCCCNCAANTTTTTTTACCTGNCNCCNGGGAAAAAAANTTGANAAAANGTTGGGGGTGNNTT GNAAANAAA(注：N表示测序不确定核苷酸)。

bip4-2：GGCGTTTGATTCNGGGTGGGGTTCTACAGGACGTAACATAAGGGACTGACCTACCCGGGACCTGCCTATAACCTGCATATAACC TGGTAAGGATTTAGCACCCCAAGTTAGTCATGTAATTAGCCACATAGCAAAAAAAATAGCACCGTGGTAGTAAGAATGGAACTCACCTGGTAC CTGGTACCTCGGATCCGTGTTTGATAGTAGCCCTTTAAGTCACATGACACGCGCAAAAAGAATCTTAATGGGTATTCTTCCTTGTTCTGTA ACTTTCTAATTTCACCTGCNGTAGACTTTCTTCAGTACTCCTTTTATAGGAACGCCTACAATCTTTTTAACCCAAAGGGTGAGGATGGGAA TTAAGTAAATATGGATAACTGCTAGAATGGATAACTTTGTAGGTGAACTGAATTCATAGATCTTATTCAACTAAGCAATCAGATTCAGCAAG CTTTTTTTTTTTANCCGGGAGGNTTTACCCCCCTCNNTNCNTANGGGGGGGNGGGGNCCGGGNNNCNTGGGGGCAGTGTTTNCGGNGGNNG GAACAAANTGCNGGNAAGCCCCCCGGGATTAAGGAAAAACCCCCCTTTTTGGTTCNGGGAAAA

GGNAAAAAAAAANAGGCTTGGCCTTGGCCCAATCCAANNAACCCCTNCCCCNAGGGGAAAAAANNTTAANCCCCNCCCCCCCCNNGGGTNGGA NAAATANGTTTGNCGGGGGGGGGGGGGGGGNAAANGNNNNTGGANAGNCTNTTCNNCCCCTAAACCTGAAANGNNNTTNGANCGGGGGGGTNC NGGGACAAGNTTCNCAAAAAAAGNTCCTTTAATTAAANCNCCCCNTCCCCCAAAAANAGCCCCCNGGGGGCNGGTNTGGCNAATTTTTCNG GGGGCCCGNGGNNCTTTTTNTACNAAATTG(注：N表示测序不确定核苷酸)。

经基因型检测得到bip4-1和bip4-2的纯合插入突变体，bip4-1的T-DNA插入在5’UTR区，bip4-2的 T-DNA插入在ORF内，实时定量PCR(基本步骤同实施例2所述)检测发现bip4-1突变体内BIP4基因的表达量部 被显著抑制，bip4-2突变体中BIP4基因的表达几乎完全缺失(图3)，两份突变体材料可以用做后续功能 分析。

4、构建BIP4基因超量表达材料

超量表达载体的构建：

另外，为了从另一方面更全面认识BIP4基因的抗逆功能，申请人将BIP4基因在水稻中超量表达。超量 表达载体构建方法如下：

将全长cDNA克隆EI#84-J20用KpnI和BamHI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带 Ubiquitin启动子的遗传转化载体pU1301(pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上 改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体，见所附 载体图4)，酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含BIP4基因的酶切片 段和酶切的pU1301载体做连接反应，其后转化大肠杆菌DH10β(该大肠杆菌DH10β菌株购自Promega公司)。 通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体命名为BIP4-pU1301，T-DNA区结构示意图见图4A，完整质粒 图见所附载体图5)。

遗传转化步骤：

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述超表达载体BIP4-pU1301转入到 水稻品种“中花11”(来源中国农业科学院作物科学研究所)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有 潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传 转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa  L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J. 6：271-282，1994)基础上改良进行。本实施例的具体遗传转化步骤如下：

(1)电转化：用1800v电压，将最终超表达目标载体BIP4-pU1301电转化入农杆菌EHA105菌株，涂 到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。

(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟；0.15％氯化 汞(HgCl₂)表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)； 将接种后的诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下 培养2周，温度25±1℃。

(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温 度25±1℃。

(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于 CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的超表达载体BIP4-pU1301)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转 移至悬浮培养基(成分见后)，28℃摇床上培养2-3小时。

(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；将 愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后) 上培养3天，培养温度19-20℃。

(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN) 的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3 次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。

(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7天；转移预分化培养的 愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照(3500lux)下培养，温度26℃。

(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(10)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分 湿润。

培养基组分及其配方：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌 呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid， 萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid， 2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate， 水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6 大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶 解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取2，4-D100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取NAA100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml， 4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取IAA100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml， 4℃保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g。在另一个大三角 瓶中加入300ml蒸馏水用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶 (25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25 ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml 葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml 葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml 葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN 和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶 (50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25 ml/管)，封口灭菌。

BIP4超表达植株的表达量鉴定：

本发明采用荧光实时定量PCR方法对上述获得的转基因水稻植株中BIP4基因的表达进行检测。基本步 骤同同实施例2所述。表达量检测结果显示，大约一半转基因植株中BIP4基因的表达量相对于野生型显著 提高(图4B)。

5、鉴定突变体和超表达植株对ABA的敏感性

脱落酸(ABA)信号在植物抗旱中发挥重要作用，许多材料抗旱性提高是由于ABA信号传导的增强， 增强ABA信号传导一般部会表现出对外源ABA处理的超敏感性。本室已有结果显示OsbZIP23是ABA信号 传导的正调控因子，于是我们检测了其互作蛋白BIP4的相关遗传材料对ABA的敏感性。将超量表达(或 纯合突变体)家系和对照(转基因阴性或野生型)家系的种子去壳消毒，超表达家系种子在含有25mg/L 潮霉素的1/2MS培养基上发芽，其余家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上。4-5天后，挑选发 出芽且长势一致的转基因和对照家系种子(各12颗，三次重复)转移到小方盒中，小方盒中为正常1/2MS 培养基或者含有3μmol/L ABA的1/2MS培养基，在培养室中避光培养两星期后观察表型并测量植株的根 长和苗长。检测结果显示，在含有3μM ABA的培养基上生长时，突变体材料(bip4-1和bip4-2)的苗长 和根长比野生型部要短(图5)，超表达材料的苗长和根长比野生型都要长(图6)，这些实验结果显示，在 萌发或苗期生长阶段，bip4突变体增强植株对ABA的敏感性，BIP4超表达减弱植株对ABA的敏感性。由 此我们推测BIP4在ABA信号传导上的作用可能和OsbZIP23的相反，是一个ABA信号传导的负调控因子。

6、鉴定突变体干旱胁迫表型

由于OsbZIP23参与抗旱应答，而其互作蛋白BIP4的突变体已被证明负调控ABA信号的传导，我们希望 进一步鉴定bip4突变体在水稻抗旱方面的作用。我们将两个等位突变体(bip4-1和bip4-2)的纯合突变体 家系以及分离出的野生型家系种子去壳消毒，播于正常1/2MS培养基上，一周后挑选长势一致的植株种到 小圆桶中，每桶种突变体植株和野生型对照各30株。试验用的土壤为泥土与粗沙按体积比为2∶3混合而成， 每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。当植株生长到三 至四叶期时进行断水处理，断水至叶片全卷，叶尖开始发白(一般断水一周左右，具体根据天气情况而定)， 然后复水恢复一个星期，观察表型并统计植株的存活率。试验结果显示，经干旱胁迫和复水后，突变体家 系的存活率比对照要高，而且两个等位突变体的的表型一致(图7A and B)，结果表明bip4的突变体增强 植株的抗旱性。由此我们推测BIP4在逆境应答上的作用和OsbZIP23相反，是抗旱性的负调控因子。

7、BIP4负调控OsbZIP23靶基因的表达

由前面可知，BIP4和OsbZIP23互作且在ABA信号和逆境应答上的作用相反，我们进一步探讨两者的具 体关系。我们检测了BIP4超表达植株和bip4突变体中OsbZIP23靶基因的表达量变化。RAB21和OsPP2C是两 个OsbZIP23的靶基因，且受OsbZIP23正调控(Xiang等，2008)。经检测发现这些受OsbZIP23正调控的靶 基因的表达量在BIP4超表达植株中下降(图8A)，在bip4突变体中上升(图8B)，这反映了BIP4可能通过 以拮抗的方式参与调控OsbZIP23靶基因的表达，或者直接参与对OsbZIP23本身的调控，从而参与ABA信号 传导和抗旱应答。7A and B)，结果表明bip4的突变体增强植株的抗旱性。由此我们推测BIP4在逆境应答 上的作用和OsbZIP23相反，是抗旱性的负调控因子。

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