核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法和应用，该分子印迹固相萃取磁性材料以表面氨基化的Fe

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，尤其涉及一种核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法和应用。

背景技术

罗丹明6G(Rhodamine6G)，又名，蕊香红6G，玫瑰红6G，黄光碱性蕊香红，其分子式为C₂₈H₃₁ClN₂O₃，相对分子量为479，它是一种呈红色或黄棕色的粉末状人工合成染料，溶于水呈猩红色带绿色荧光，溶于醇呈红色带黄色荧光或黄红色带绿色荧光。罗丹明6G是一种常用的指示剂和生物染色剂，广泛用于钢铁、环保等检测领域，同时也被应用于纺织物、皮革、纸张的染色。罗丹明6G为非食用物质，对人体具有潜在致癌、致畸、致突变性等危害。工业染料被严格禁止添加于食品中，但不法商人在利益驱使下，将工业染料违法加入食品中用于染色，严重危害人体健康。

食品样品大多是由各种物质组成的混合物，而其中被检测的有害物质残留往往又是微量甚至是痕量的，因此样品前处理过程对分析结果的确准性、可靠性至关重要。分子印迹固相萃取（Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction，简称MISPE）是近年发展起来的一种新型样品前处理技术，它利用分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，简称MIP)的特异选择性吸附机理制备固相萃取材料，由于MIP对模板分子具有特异选择性和亲合性，而且其受酸、碱、有机溶剂和加热等环境因素影响很小，可以克服食品样品体系复杂、预处理程序烦琐等不利因素，实现复杂食品样品基体中低浓度目标物的分离富集，提高固相萃取的净化效果及分析检测方法的灵敏度和准确性。

核-壳型分子印迹固相萃取材料是由一种磁性材料和非磁性的分子印迹聚合物复合而成的新型功能材料。它以磁性材料为“核”，其外的“壳”则键合了分子印迹聚合膜。核-壳型分子印迹固相萃取材料既具有MIP的诸多特点，如对模板分子具有特异吸附性和分离选择性，通过吸附或共价结合的方式与待分离组分结合；同时，又具有磁性材料“动态”分离的特征，在完成对模板分子的识别与吸附后，能在外加磁场作用下很方便地将其从样品基质中分离出来，因此特别适合于复杂体系中目标物的分离富集。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料及其制备方法，以方便实现对罗丹明6G进行“选择性”吸附和“动态”分离。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料在选择性分离、富集和纯化食品样品中罗丹明6G方面的应用，并能结合高效液相色谱法实现食品中微量罗丹明6G的快速分离检测，利于在食品安全检测中推广和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料，以表面氨基化的Fe₃O₄纳米粒子为磁性核，以罗丹明6G分子印迹聚合膜为壳。

分子印迹聚合膜以罗丹明6G为模板分子、丙烯酰胺为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂制备。

上述核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料是由表面氨基化的Fe₃O₄、罗丹明6G、丙烯酰胺、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈按投料量比0.2～2.0g:0.5～5mmol:10～100mmol:5～50mmol:0.04～0.40g制成的磁性分子印迹聚合物微粒。

上述核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，采用表面印迹聚合法以表面氨基化Fe₃O₄纳米粒子为磁性核，以罗丹明6G为模板分子、丙烯酰胺为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，按投料量比0.2～2.0g:0.5～5mmol:10～100mmol:5～50mmol:0.04～0.40g发生聚合反应，再洗脱除去模板分子罗丹明6G，即得。

上述核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子

将5.3g（0.02mol）FeCl₃·6H₂O，2.0g(0.01mol)FeCl₂·4H₂O置于装有150mL去离子水的三颈烧瓶中，超声溶解，开启搅拌，通N₂除氧，加热至80℃，加入25mL浓氨水，反应6h，用强磁铁将产物与溶液分离（即将磁铁置于三颈烧瓶外侧底部，吸引Fe₃O₄，然后倒出废液），将产物Fe₃O₄放入100mL含0.2mol/L的柠檬酸钠水溶液中，超声5min使分散均匀，再用强磁铁分离出产物，用去离子水清洗Fe₃O₄至中性，再用无水乙醇20～50mL清洗，60℃干燥，得到黑色的Fe₃O₄磁性纳米粒子；

（2）表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子的制备

将0.4～2.0g Fe₃O₄磁性纳米粒子放入装有150～350mL乙醇-水（1:1，V/V）溶液的三颈烧瓶中，开启搅拌，加入0.5～2.5mL3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），用冰醋酸调节pH至4.0，通N₂除氧，然后升温至60℃，反应3h；产物通过强磁铁分离，用去离子水洗涤至中性，60℃干燥，得到表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子；

（3）采用表面印迹法制备含罗丹明6G的分子印迹聚合物磁性微粒

将0.2～2.0g表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子、0.5～5mmol罗丹明6G和10～100mmol丙烯酰胺置于具塞锥形瓶中，加入30～100mL氯仿，超声15min，形成预聚合溶液，密闭避光放置12h；加入5～50mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、0.04～0.40g偶氮二异丁腈，超声15min分散均匀，转移至250～1000mL三颈烧瓶中，再加入70～500mL氯仿，加装搅拌器、冷凝管、温度计，通N₂除氧，以300～350r/min的转速搅拌，加热升温至60℃，反应12h，在磁核表面生成含罗丹明6G的分子印迹聚合膜；

（4）分子印迹聚合膜中罗丹明6G的洗脱

用强磁铁分离步骤（3）中产物，用20～100mL乙醇洗涤，60℃干燥；将产物装入滤纸筒中，以甲醇-冰醋酸(9:1，V/V)为洗脱剂，索式提取4～12h，除去模板分子罗丹明6G后，60℃干燥，即得核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料。

上述核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料在选择性分离、富集和纯化食品中罗丹明6G残留样品中的应用。

上述应用在含罗丹明6G的食品样品分析前处理方面。

上述应用，包括以下步骤：

（1）活化

称取核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料20～25mg，置于具塞锥形瓶中，用3mL甲醇活化，磁场分离，弃去废液；用3mL乙酸乙酯-环已烷（2:8，V/V）淋洗，将分子印迹固相萃取磁性材料表面的甲醇除去，磁场分离，弃去废液；再用3～6mL氯仿平衡，磁场分离，弃去废液；得到活化好的磁性分子印迹聚合物微粒；

（2）萃取

取食品样品1～2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，准确加入氯仿5～10mL，超声提取5～10min，准确移取氯仿提取液2mL加入步骤（1）中的具塞锥形瓶中，与活化好的磁性分子印迹聚合物微粒混合；在振荡作用下萃取20min；萃取完成后，磁场分离，弃去废液；

（3）淋洗

用乙酸乙酯-环已烷（2:8，V/V）1～2mL淋洗经步骤（2）处理的磁性分子印迹聚合物微粒，磁场分离，弃去废液；

（4）洗脱

以甲醇为洗脱剂，按磁性分子印迹聚合物微粒与洗脱剂的质量体积比20～40mg:2mL，洗脱1～3次（将吸附到磁性分子印迹聚合物上的罗丹明6G洗脱下来），磁场分离，收集洗脱液；在40～45℃条件下用N₂将收集得到的洗脱液吹干，得到残渣，用2.0mL乙腈重新溶解残渣，经0.45μm有机滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。

发明人根据“核-壳”型分子印迹固相萃取技术，设计制备了一种核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料，它以表面氨基化的磁性Fe₃O₄纳米粒子为“核”，而“壳”则是在核表面以罗丹明6G为模板分子、丙烯酰胺为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂制成的多孔分子印迹聚合物膜，形成“核-壳”型磁性纳米微粒。

本发明具有以下突出优点：

1.分子印迹固相萃取磁性材料制备方法操作简单，适用性广。

2.聚合反应前，用3-氨丙基三乙氧基硅烷将Fe₃O₄表面进行改性，既增强了其脂溶性，解决了金属氧化物与有机聚合物相容性的问题，又成功引入氨基，使其与模板分子及功能单体能通过形成氢键很好地包埋在聚合物里，成为聚合物的磁“核”。

3.磁“核”外形成的“壳”为分子印迹聚合膜，具有对模板分子有“记忆”功能的空穴和亲合位点，使印迹聚合物与模板分子的再结合过程发生在表面，因此，可以实现对模板分子的快速吸附平衡过程。

4.传统的分子印迹聚合物在用于样品前处理时，需要先湿法装柱填充到聚丙烯固相萃取小柱中，经活化、加样、淋洗、洗脱，完成分离富集的前处理过程；本发明的印迹聚合物由于具有磁性“核”，在吸附萃取模板分子过程中，无需填充装柱，而是直接将其加入到被测样品的提取液中进行吸附富集，即可快速完成对模板分子的萃取；萃取结束后，利用强磁场将印迹聚合物微粒聚集，能很好地实现与样品基体的分离，快速清除样品中的基体干扰，大大简化了分析步骤，节约分析时间，降低有机溶剂的消耗，从而实现对模板分子的快速检测分析。

5.本发明磁性分子印迹聚合物对模板分子罗丹明6G具有特异吸附性和分离选择性，用于食品样品分析前处理中痕量罗丹明6G的“选择”吸附及“动态”萃取分离，可以很好的清除基体干扰，实现对含罗丹明6G的食品样品的快速分离检测，方法的回收率高、相对标准偏差小、分离选择性高、灵敏度高，具有有机溶剂使用更少、操作更为简单、快速、高效等特点。

具体实施方式

实施例1

一、核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料的制备

（1）采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子

将5.3g（0.02mol）FeCl₃·6H₂O，2.0g(0.01mol)FeCl₂·4H₂O置于装有150mL去离子水的三颈烧瓶中，超声溶解，开启搅拌，通N₂除氧，加热至80℃，加入25mL浓氨水，反应6h，用强磁铁将产物与溶液分离，弃去废液；将产物放入100mL含0.2mol/L的柠檬酸钠水溶液中，超声5min使分散均匀，再用强磁铁分离出产物，用去离子水清洗Fe₃O₄至中性，再用无水乙醇20～50mL清洗，60℃干燥，得到黑色的Fe₃O₄磁性纳米粒子；

（2）表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子的制备

将0.4g Fe₃O₄磁性纳米粒子放入装有150mL乙醇-水（1∶1，V/V）溶液的三颈烧瓶中，开启搅拌，加入0.5mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，用冰醋酸调节pH至4.0，通N₂除氧，然后升温至60℃，反应3h；产物通过强磁铁分离，用去离子水洗涤至中性，60℃干燥，得到表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子；

（3）采用表面印迹法制备含罗丹明6G的分子印迹聚合物磁性微粒

将0.2g表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子、0.5mmol罗丹明6G和10mmol丙烯酰胺，置于具塞锥形瓶中，加入30mL氯仿，超声15min，形成预聚合溶液，密闭避光放置12h；加入5mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、0.04g偶氮二异丁腈，超声15min分散均匀，转移至250mL三颈烧瓶中，再加入70mL氯仿，加装搅拌器、冷凝管、温度计，通N₂除氧，以300r/min的转速搅拌，加热升温至60℃，反应12h，在磁核表面生成含罗丹明6G的分子印迹聚合膜；

（4）分子印迹聚合膜中罗丹明6G的洗脱

用强磁铁分离步骤（3）中产物，用20mL乙醇洗涤，60℃干燥；将产物装入滤纸筒中，以甲醇-冰醋酸(9∶1，V/V)为洗脱剂，索式提取4h，除去模板分子罗丹明6G后，60℃干燥，即得核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料。

二、罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料应用于果脯中罗丹明6G的选择性分离、富集和纯化

（1）称取制备好的分子印迹固相萃取磁性材料20～25mg，置于25mL具塞锥形瓶中，依次用3mL甲醇活化，3mL乙酸乙酯-环己烷（2:8，V/V）淋洗，3～6mL氯仿平衡，磁场分离，弃去废液；得到活化好的磁性分子印迹聚合物微粒；

（2）取市售木瓜果脯（阴性样品），切成小粒，准确称取1g，置于具塞锥形瓶中，准确加入4μg/mL的罗丹明6G对照品氯仿溶液5mL，超声5min；准确移取2mL上清液置于步骤（1）中的具塞锥形瓶中，与活化好的磁性分子印迹聚合物混合，在振荡作用下萃取20min，磁场分离，弃去样品溶液，用1～2mL乙酸乙酯-环己烷（2:8，V/V）淋洗分子印迹聚合物，弃去废液；

（3）用甲醇洗脱（2mL×3次），磁场分离，收集洗脱液，在40～45℃条件下用N₂将收集得到的洗脱液吹干，得到残渣，用2.0mL乙腈重新溶解残渣，经0.45μm有机滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。

结果：分子印迹固相萃取磁性材料对木瓜果脯中的罗丹明6G具有专一选择性的分离富集和纯化能力，对木瓜果脯样品中加标回收率为98.42%，相对标准偏差为0.85%。

实施例2

一、核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料的制备

（1）采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子

同实施例1

（2）表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子的制备

将1.2g Fe₃O₄磁性纳米粒子放入装有250mL乙醇-水（1∶1，V/V）溶液的三颈烧瓶中，开启搅拌，加入1.5mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，用冰醋酸调节pH至4.0，通N₂除氧，然后升温至60℃，反应3h；产物通过强磁铁分离，用去离子水洗涤至中性，60℃干燥，得到表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子；

（3）采用表面印迹法制备含罗丹明6G的分子印迹聚合物磁性微粒

将1.0g表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子、2.5mmol罗丹明6G和50mmol丙烯酰胺，置于具塞锥形瓶中，加入70mL氯仿，超声15min，形成预聚合溶液，密闭避光放置12h；加入25mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、0.2g偶氮二异丁腈，超声15min分散均匀，转移至500mL三颈烧瓶中，再加入250mL氯仿，加装搅拌器、冷凝管、温度计，通N₂除氧，以320r/min的转速搅拌，加热升温至60℃，反应12h，在磁核表面生成含罗丹明6G的分子印迹聚合膜；

（4）分子印迹聚合膜中罗丹明6G的洗脱

用强磁铁分离步骤（3）中产物，用50mL乙醇洗涤，60℃干燥。将产物装入滤纸筒中，以甲醇-冰醋酸(9∶1，V/V)为洗脱剂，索式提取8h，除去模板分子罗丹明6G后，60℃干燥，即得核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料。

二、罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料应用于饼干中罗丹明6G的选择性分离富集和纯化

（1）称取制备好的分子印迹固相萃取磁性材料20～25mg，置于25mL具塞锥形瓶中，依次用3mL甲醇活化，3mL乙酸乙酯-环己烷（2:8，V/V）淋洗，3～6mL氯仿平衡，磁场分离，弃去废液；得到活化好的磁性分子印迹聚合物微粒；

（2）取市售香橙味饼干（阴性样品），将其粉碎，准确称取1g，置于具塞锥形瓶中，准确加入0.5μg/mL的罗丹明6G对照品氯仿溶液10mL，超声5～10min。准确移取2mL上清液置于步骤（1）中的具塞锥形瓶中，与活化好的磁性分子印迹聚合物混合，在振荡作用下萃取20min，磁场分离，弃去样品溶液，用1～2mL乙酸乙酯-环己烷（2:8，V/V）淋洗分子印迹聚合物，弃去废液；

（3）用甲醇洗脱（2mL×3次），磁场分离，收集洗脱液，在40～45℃条件下用N₂将收集得到的洗脱液吹干，得到残渣，用2.0mL乙腈重新溶解残渣，经0.45μm有机滤膜过滤后进行高效液相色谱分析；

结果：分子印迹固相萃取磁性材料对香橙味饼干中的罗丹明6G具有专一选择性的分离富集和纯化能力，对香橙味饼干样品中加标回收率为92.31%，相对标准偏差为1.1%。

实施例3

一、核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料的制备

（1）采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子

同实施例1

（2）表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子的制备

将2.0g Fe₃O₄磁性纳米粒子放入装有350mL乙醇-水（1∶1，V/V）溶液的三颈烧瓶中，开启搅拌，加入2.5mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，用冰醋酸调节pH至4.0，通N₂除氧，然后升温至60℃，反应3h；产物通过强磁铁分离，用去离子水洗涤至中性，60℃干燥，得到表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子；

（3）采用表面印迹法制备含罗丹明6G的分子印迹聚合物磁性微粒

将2.0g表面氨基化磁性Fe₃O₄纳米粒子、5mmol罗丹明6G和100mmol丙烯酰胺，置于具塞锥形瓶中，加入100mL氯仿，超声15min，形成预聚合溶液，密闭避光放置12h；加入50mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、0.4g偶氮二异丁腈，超声15min分散均匀，转移至1000mL三颈烧瓶中，再加入500mL氯仿，加装搅拌器、冷凝管、温度计，通N₂除氧，以350r/min的转速搅拌，加热升温至60℃，反应12h，在磁核表面生成含罗丹明6G的分子印迹聚合膜；

（4）分子印迹聚合膜中罗丹明6G的洗脱

用强磁铁分离步骤（3）中产物，用80～100mL乙醇洗涤，60℃干燥；将产物装入滤纸筒中，以甲醇-冰醋酸(9∶1，V/V)为洗脱剂，索式提取12h，除去模板分子罗丹明6G后，60℃干燥，即得核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料。

二、罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料应用于饮料中罗丹明6G的选择性分离富集和纯化

（1）称取制备好的分子印迹固相萃取磁性材料20～25mg，置于25mL具塞锥形瓶中，依次用3mL甲醇活化，3mL乙酸乙酯-环己烷（2:8，V/V）淋洗，3～6mL氯仿平衡，磁场分离，弃去废液；得到活化好的磁性分子印迹聚合物微粒；

（2）取市售水蜜桃味饮料（阴性样品），准确移取1mL，置于具塞锥形瓶中，准确加入0.5μg/mL的罗丹明6G对照品氯仿溶液5mL，超声5min，静置；准确移取2mL下层氯仿溶液置于步骤（1）中的具塞锥形瓶中，与活化好的磁性分子印迹聚合物混合，在振荡作用下萃取20min，磁场分离，弃去样品溶液，用1～2mL乙酸乙酯-环己烷（2:8，V/V）淋洗，弃去废液；

（3）用甲醇洗脱（2mL×3次），磁场分离，收集洗脱液，在40～45℃条件下用N₂将收集得到的洗脱液吹干，得到残渣，用2.0mL乙腈重新溶解残渣，经0.45μm有机滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。

结果：分子印迹固相萃取磁性材料对水蜜桃味饮料中的罗丹明6G具有专一选择性的分离富集和纯化能力，对水蜜桃味饮料样品中加标回收率为99.23%，相对标准偏差为0.91%。

实施例4核-壳型罗丹明6G分子印迹固相萃取磁性材料对罗丹明6G的分子识别性研究一、核-壳型分子印迹聚合物与非印迹聚合物的制备

为了评价所制备的核-壳型罗丹明6G磁性分子印迹聚合物（MIP）对模板分子罗丹明6G的分子识别性，作为对比，同时合成了核-壳型磁性非印迹聚合物（NIP），其制备方法与上述实施例中的MIP基本相同，仅不加模板分子。

二、核-壳型分子印迹聚合物对罗丹明6G的分子识别性研究

特异选择吸附性是分子印迹聚合物的基本特征，碱性嫩黄O同为偶氮类色素且其颜色与模板分子罗丹明6G相近，通过比较MIP对模板分子罗丹明6G及碱性嫩黄O的吸附行为上的差异，来评价其分子识别性。

（1）吸附量的测定

取罗丹明6G和碱性嫩黄O对照品适量，分别用氯仿配制成0.2mg/mL溶液。准确称取25mg的MIP和NIP（共2组），分别置于25mL的具塞三角锥瓶中，分别准确加入上述罗丹明6G和碱性嫩黄O溶液10mL，置于振荡器上室温振荡(80r/min)20min，置于强磁铁上静置，用移液枪精密量取上清液适量，用氯仿稀释定容，分别在各自的最大吸收波长下测定其吸光度。

根据公式Q=（C₀-C_e）V/m，通过吸附前后溶液浓度变化计算聚合物吸附量。公式中，Q为平衡吸附量（mg/g）；C₀与C_e分别为各底物的初始浓度与吸附平衡浓度(mg/mL)；V为溶液的体积(mL)；m为MIP或NIP的质量(g)。

（2）印迹因子的计算

用印迹因子α评价MIP对模板分子的特异吸附性，α=Q_MIP/Q_NIP。式中Q_MIP为MIP对底物的吸附量（mg/g）；Q_NIP为NIP对底物的吸附量（mg/g），α值越大，印迹效果越好，说明MIP对模板分子的特异吸附性能越强。

（3）核-壳型罗丹明6G磁性分子印迹聚合物对罗丹明6G的分子识别性研究结果（见表1）

表1罗丹明6G磁性分子印迹聚合物对罗丹明6G的分子识别性研究结果

由于MIP的印迹空穴及结合位点与模板分子罗丹明6G具有高度的匹配性，所以其对罗丹明6G具有较强的印迹能力，印迹因子较高，达到2.22，表现出较好的分子识别性；碱性嫩黄O与罗丹明6G虽为结构类似物，但由于空间结构和功能基团上的差异，使MIP和NIP对其的吸附未表现出明显的差异，即MIP对碱性嫩黄O没有特异吸附性，因此，印迹因子只有1.06。实验结果表明，核-壳型罗丹明6G磁性分子印迹聚合物对罗丹明6G具有优良的分子识别和选择性，而非印迹聚合物则不具备这种分子识别性。