微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯及其制备

摘要

本发明公开了一种微生物燃料电池阳极菌还原氧化石墨烯及其制备方法。将改进Hummers法制备的氧化石墨分散在水中，超声形成分散较好的氧化石墨烯悬浮液。然后将微生物燃料电池阳极菌液加入到氧化石墨烯悬浮液中，并在厌氧条件下静置培养数天，分散好的氧化石墨烯在细菌的作用下去除含氧官能团形成石墨烯；培养完毕，用盐酸、乙醇、去离子水去除还原过程中产生的菌体、代谢产物及其它离子，最后用去离子水清洗至pH为中性为止，干燥得到纯净的石墨烯。本发明以具有产电、分解有机物的微生物燃料电池阳极混合微生物对氧化石墨烯进行生物还原，相对于单一菌种还原氧化石墨烯的方法，具有操作步骤简便，还原速率快，制备的石墨烯缺陷少、层数少等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及通过氧化石墨烯制备石墨烯的绿色生物可控制备技术，属于生物材料领域，特别是一种微生物燃料电池阳极细菌生物还原氧化石墨烯。

背景技术

由于石墨烯具有高的比表面积、突出的的导热性能和力学性能及其非凡的电子传递性能等一系列的优异的性质，所以制备高质量和高产量的石墨烯一直是人们关注的焦点。其中化学氧化-还原已成为可能实现规模化制备石墨烯的有效途径，即石墨氧化变成氧化石墨，再在超声条件下得到单层的氧化石墨溶液，再通过化学还原获得石墨烯。在还原氧化石墨烯过程中，为了减少环境污染，提高石墨烯性能，微生物还原开始引起人们的关注，目前有希瓦氏菌（Gongming Wang, Fang Qian, Chad W. Saltikov, Yongqin Jiao.Microbial Reduction of Graphene Oxide by Shewanella.Nano Res. 2011, 4(6): 563–570），大肠杆菌（O. Akhavan, E.Ghaderi. Escherichia coli bacteria reduce graphene oxide to bactericidal graphene in a self-limiting manner. CARBON 50(2012) 1853 –1860）等等。

阳极细菌还原氧化石墨烯相对于单一还原菌具有明显的优势：首先，阳极细菌还原速度快，反应条件温和，室温下既可进行，符合低碳的理念，培养基成分价格低廉，降低了石墨烯的制备成本，在工艺上简单易行；省去了反复菌种分离的复杂步骤；其次，阳极细菌还原制得的石墨烯相对于单一菌种还原制备的石墨烯具有较低的结构缺陷，最大限度的保留了石墨烯的性能。同时，阳极细菌还原氧化石墨烯的过程易于放大，可以进一步放大实验。

微生物燃料电池除了具有一般燃料电池高效的特点外，还兼具原料来源广泛、操作条件温和等优点。微生物燃料电池属于一种全新的生物质能利用形式。现有的研究均显示，混菌MFC的产电能力远远大于纯菌的MFC，这说明了混菌MFC有更快的电子转移能力。

发明内容

本发明的目的是基于阳极细菌在厌氧条件下优良的电子的转移能力，用其对氧化石墨烯进行还原，制备出低缺陷的石墨烯。

本发明的另一目的在于提供一种绿色低缺陷的阳极细菌生物还原氧化石墨烯的制备方法。

实现本发明的技术解决方案为：一种微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯，包括以下制备步骤：

第一步，将葡萄球菌属的菌种接种到微生物燃料电池的阳极液中，将阳极菌液加入到微生物燃料电池阳极室中，在恒温培养箱中静置培养；

第二步，将氧化石墨烯悬浮液与培养结束的阳极菌液混合，在恒温箱中静置培养，进行生物还原；

第三步，将第二步的生物还原后的氧化石墨烯静置、离心，采用稀盐酸、乙醇、水多次反复清洗、沉淀，至pH为中性为止，最后对纯净的石墨烯进行干燥。

  第一步中所述的葡萄球菌属菌种种子液的接种量为5%-20%，在恒温培养箱中静置培养2-5天，培养温度为25-35℃，当微生物燃料电池开路电压达到200mV -500mV时终止，阳极液的成分包括：葡萄糖2.0g/L，NaHCO₃ 3.13g/L，NH₄Cl 0.31g/L，NaH₂PO₄ 4.97g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.56g/L,KCl 0.13g/L，CaCl₂ 15mg/L，MnSO₄ 20mg/L，FeCl₃ 1mg/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.93g/L，MgSO₄ 0.2g/L；阴极液成分包括：K₃Fe(CN)₆16.5g/L，NaH₂PO₄ ·2H₂O 0.4g/L ，Na₂HPO₄·12H₂O 6.0g/L。

   第二步中所述的氧化石墨烯悬浮液浓度为0.22%；所述的阳极菌液与氧化石墨烯悬浮液的体积比为1:1-1:10,所述的混合培养时间为0.5-3d，培养温度为25-35℃。

   第三步中所述的稀盐酸质量浓度为0.1-5mol/L，乙醇的体积分数为70%-80%，离心转速为8000-12000r/min，离心时间15-80min，干燥采用普通真空干燥或真空冷冻干燥，普通真空干燥温度为50-100℃，真空冷冻干燥温度为-20-（-80）℃，真空度≤160Pa，干燥时间为24-48h。

本发明与现有技术相比，具有显著的优点（1）利用稳定的微生物燃料电池阳极细菌，对氧化石墨烯进行还原，可以通过生物还原酶及电子载体的作用进行更快的电子传输，实现更快的氧化石墨烯的还原；（2）生物还原的氧化石墨烯降低了石墨烯的结构缺陷，最大限度保持了石墨烯的原有优异特性；（3）本发明的创新点在于使用混合菌种而不是单一菌种进行生物还原氧化石墨烯，这不仅省去了反复分离菌种和培养基灭菌的步骤，而且大大提高了生物还原氧化石墨烯的速度，为了进一步说明阳极细菌的优越性，我们选择单一希瓦氏菌菌种制备石墨烯过程进行对比。

附图说明

附图1是本发明微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯的流程示意图。

附图2是本发明微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯的效果对比图（a空白菌液，b空白氧化石墨烯 c,d 阳极菌还原氧化石墨烯还原时间2天，3天）。

附图3 是本发明实施例1微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯的拉曼光谱。

附图4是本发明实施例1微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯的场发射扫描电镜图。

附图5是本发明实施例1微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯的循环伏安图（扫描速度5mV/s）。

具体实施方式

结合附图1，本发明微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯，由以下制备方法得到：

第一步，将改进Hummers法制备的氧化石墨分散都水中，超声分散，形成均匀的氧化石墨烯悬浮液；

第二步，将葡萄球菌属菌种接种到微生物燃料电池的阳极液中，将阳极菌液加入到组装好微生物燃料电池中，在恒温培养箱中静置培养，以获得生长旺盛的细菌；

第三步，将氧化石墨烯悬浮液与生长好的阳极菌液进行混合，在恒温箱中培养，进行生物还原；

第四步，将第三步的生物还原后的氧化石墨烯静置、离心，采用稀盐酸、乙醇、水多次反复清洗、离心沉淀，溶解去除氧化过程中产生的菌体及其它离子，至pH为中性为止，最后对纯净的石墨烯进行干燥。

本发明的葡萄球菌属菌种源自南京城东污水处理厂的厌氧污泥，已经过本课题组驯化培养分离，经生理生化实验并比对伯杰细菌鉴定手册，确定该阳极菌主要属于葡萄球菌属(staphylococcus)，兼性厌氧，该菌具有产电能力，可以作为还原氧化石墨烯的主要菌种。

实施例1：本发明微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯及其制备，包括以下步骤：

第一步，氧化石墨烯预处理。在1L三角瓶中加入50mL 的2wt%氧化石墨烯，向三角瓶中加入去离子水至400mL，在250W的超声波清洗机中，于室温下超声处理30min，得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液；

第二步，配制微生物燃料电池阴极液、阳极液各200mL,自然pH值。将10%种子液接种到阳极液中，阳极液中通入20min的N₂，在30℃恒温培养箱中静置培养2天，即当微生物燃料电池开路电压达到200mV时终止，其中种子液通过将斜面上的葡萄球菌属的菌种接种到LB培养基中，在30℃的恒温摇床内培养三天获得，其中燃料电池阳极液成分包括：葡萄糖2.0g/L，NaHCO₃ 3.13g/L，NH₄Cl 0.31g/L，NaH₂PO₄ 4.97g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.56g/L,KCl 0.13g/L，CaCl₂ 15mg/L，MnSO₄ 20mg/L，FeCl₃ 1mg/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.93g/L，MgSO₄ 0.2g/L；阴极液成分包括：K₃Fe(CN)₆16.5g/L，NaH₂PO₄ ·2H₂O 0.4g/L ，Na₂HPO₄·12H₂O 6.0g/L；

第三步，将生长结束的微生物燃料电池阳极菌液分装至4个250mL的三角瓶，每瓶的装量50mL，每瓶氧化石墨烯悬浮液的装量为50mL,每瓶通入20min的N₂，以除去溶解氧。将瓶口进行密封，防止氧气进入，在恒温箱中静置厌氧培养2d，30℃，进行生物还原。

第四步，将第三步生物还原完毕的发酵液静置，10000r/min转速离心30min；向获得的混合物沉淀中加入1mol/L稀盐酸100mL，搅拌均匀，室温下静置1h；以10000r/min转速离心30min，倾去上清液，用80%乙醇溶液清洗沉淀，搅拌均匀，室温下静置1h，10000r/min转速离心30min 倾去上清液，最后用去离子水清洗沉淀，如上重复3次，最后用去离子水洗到中性为止，将沉淀置于真空冷冻箱中，-50℃，真空度≤160Pa，干燥时间为48h，得到纯净的石墨烯。

    如图2所示，氧化石墨烯悬浮液基本全部变黑，沉淀在瓶底，说明阳极细菌对氧化石墨烯具有很强的还原性。

    对得到的阳极细菌生物还原氧化石墨烯进行拉曼光谱测试，生物还原氧化石墨烯制备的石墨烯在1350cm^-1，1580cm^-1左右分别出现了D峰和G峰两个特征峰，生物还原氧化石墨烯制备的石墨烯D/G小于希瓦氏菌还原制备的石墨烯（见参考文献Gongming Wang, Fang Qian, Chad W. Saltikov, Yongqin Jiao.Microbial Reduction of Graphene Oxide by Shewanella.Nano Res. 2011, 4(6): 563–570），表明阳极细菌生物还原氧化石墨烯具有较低的缺陷和无序性；

对得到的生物还原的氧化石墨烯进行场发射扫描电镜观察，如图4所示。可以看到石墨烯的具有明显的少数几层（一般1-6层），这也可以由图3中G峰的红移可以得到验证。

如图5所示，阳极细菌制备的石墨烯比希瓦氏菌制备的石墨烯（见参考文献Gongming Wang, Fang Qian, Chad W. Saltikov, Yongqin Jiao.Microbial Reduction of Graphene Oxide by Shewanella.Nano Res. 2011, 4(6): 563–570）具有更强的氧化还原峰和更好的对称性，说明阳极细菌制备的石墨烯具有更好的电化学性质和存较少的缺陷。

实施例2：本发明微生物燃料电池阳极菌生物还原氧化石墨烯及其制备，包括以下步骤：

第一步，氧化石墨烯预处理。在1L三角瓶中加入50mL 的2%氧化石墨烯，向三角瓶中加入去离子水至400mL,在250W的超声波清洗机中，于室温下超声处理30min，得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液；

第二步，配制微生物燃料电池阴极液、阳极溶各200mL,自然pH值。将培养基接种10%阳极细菌种子液，在30℃恒温培养箱中静置培养3d，即当微生物燃料电池开路电压达到300mV时终止，其中燃料电池阳极液成分包括：葡萄糖2.0g/L，NaHCO₃ 3.13g/L，NH₄Cl 0.31g/L，NaH₂PO₄ 4.97g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.56g/L,KCl 0.13g/L，CaCl₂ 15mg/L，MnSO₄ 20mg/L，FeCl₃ 1mg/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.93g/L，MgSO₄ 0.2g/L；阴极液成分包括：K₃Fe(CN)₆16.5g/L，NaH₂PO₄ ·2H₂O 0.4g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.0g/L；

第三步，将生长结束的微生物燃料电池阳极菌液分装至4个250mL的三角瓶，每瓶的装量10mL，每瓶氧化石墨烯的装量为100mL,每瓶通入20min的N₂，以除去溶解氧。将瓶口进行密封，防止氧气进入，在恒温箱中静置厌氧培养0.5d，30℃，进行生物还原。

第四步，将第三步生物还原完毕的发酵液静置，12000r/min转速离心20min；向获得的混合物沉淀中加入1mol/L稀盐酸100mL，搅拌均匀，室温下静置1h；以12000r/min转速离心30min，倾去上清液，用80%乙醇溶液清洗沉淀，搅拌均匀，室温下静置1h，12000r/min转速离心30min 倾去上清液，最后用去离子水清洗沉淀，如上重复3次，最后用去离子水洗到中性为止，将沉淀置于普通真空干燥箱中，50℃，真空度≤160Pa，干燥时间为48h，得到纯净的石墨烯。