一种转基因小麦定量检测单拷贝RPL21内标准引物及应用

摘要

本发明公开了一种转基因小麦定量检测单拷贝RPL21内标准引物及应用，其步骤：A、通过不同数据库筛选结构基因，以非同源区段设计引物，并通过NCBI中Primer-Blast生物信息学工具检测设计引物的物种特异性，并验证其引物在不同数据库中的产物；B、灭菌消毒萌发35种不同小麦品种与15个不同物种种子，取叶片CTAB法提取DNA，并通过普通定性PCR验证其在不同物种间的种属特异性和不同小麦品种中的品种间稳定性,内标准基因引物序列为：名称 Accession 结合位点 序列5’-3’ Size Ta℃；RPL21-7 HM138481.1 928-955 For:CCTAGCCCGTTTCATCTAATGTGTCCTA 161 60；RPL21-8 1088-1062 Rev:TACTACCAACGAGAACCATTAGAGAGC。通过与Southern Blot结果进行比照，可以进行拷贝数精确定量，并且转基因小麦定性检测极限为0.2%，定量检测极限阈值为2%，拷贝数为5个六倍体小麦基因组，与预测的小麦理论检测极限一致。

说明书

技术领域

本发明属于植物检验检疫小麦属作物、食品、深加工产品转基因检测领域，利用qPCR 基于RPL21(Ta RPL21gene，HM138481.1)基因设计的用于小麦转基因定量检测中内标准基因 引物，依据内标准基因引物的物种间特异性、种内稳定性、低拷贝数，通过生物信息学预测， 普通PCR、定量qPCR、Southern、测序Clustal分析验证，证明其确实具有优良种属特异性， 稳定的种间稳定性，拷贝数为1，定位位点为3，来源于A基因组，扩增区域唯一且位于A 基因组。具体应用于转基因检测中内源基因定量，作为一个内标准基因来定量检测外源转入 基因插入位点数，并通过绝对相对定量检测转基因成分所占比例。通过实验证明定性检测极 限为0.2％，定量检测极限为4.95个六倍体小麦基因组，定量检测极限阈值为2％。

背景技术

自1996年世界上第一个转基因作物开始商业应用以来，转基因作物的商品化种植在短 短几年中得到迅猛发展。从转基因作物来看，目前已获得有关国家认可和批准的转基因作物 包括了如玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、烟草、马铃薯等主要农作物的近70多个品系， 导入的基因类型以及改良作物的性状主要涉及抗除草剂、抗虫、抗病毒、品质改良、育性、 耐贮藏等几大类(余四斌，饶荣华转基因作物种子检测技术研究进展2003年第5期)。

小麦作为世界第一大作物，由于受到转基因技术的限制，小麦转基因研究滞后于其它作 物。1992年美国佛罗里达大学的专家利用基因枪法将抗除草剂的Bar基因导人了小麦，并 建立了基因枪法转化小麦的技术体系，获得第一株转基因小麦后；2001年首批转基因小麦由 孟山都进行田间试验；2006年，我国抗穗发芽转基因小麦进入中试；2007年，澳大利亚有 关部门批准进行30个抗旱转基因小麦品系的首次田间试验(张正斌，胡晓君转基因小麦： 在争议中前行生命世界2007年第9期)。

植物转基因检测技术主要包括基于DNA的定性PCR、定量qPCR、Southern Blot，以 蛋白质为检出标的物的ELISA、Western Blot，和其它技术，如：基因芯片、色谱分析、 SPR传感器、近红外线色谱分析法。而对于深加工产品来说，DNA由于其本身的稳定性， 自然成为转基因定量检测的首选物质。

出于对转基因食品可能存在的未知安全隐患的忧虑，同时也是对消费者知情权的保护， 各国政府纷纷立法设立相关的检测阈值以利于管理(C.A.Carter International Approaches to  the Labeling of Genetically Modified Foods Agricultural Issue Center University of California  2003)。

a：计划09％，低于1％；b：暂未执行

而要对转基因食品所占成分进行定量，一个内标准基因就显得极为重要了：

1.烘焙处理或者深加工食品其中可能掺杂了其它的添加剂或者其它食品，因此，内标准引物 可以鉴定所提取的DNA样品质量；

2.作为设置的一个阴性对照用以检测PCR是否正常；

3.可以对总的反应体系中的DNA进行定量；

4.由于具有物种特异性，因此，可以通过对外源基因与内源基因的进行比对，通过绝对相对 定量来实现检测转基因成分比例的目的。

合适的内标准引物是定量检测转基因的前提和基础。其应该具有几个特点：

1.具有物种种属特异性；

2.在各个品种之间稳定存在，不存在拟等位基因；

3.基因组中拷贝数目确定且较低。

60S核糖体蛋白L21是核糖体蛋白中的一种重要蛋白质，参与蛋白的合成过程。RPL21 氨基酸序列在小麦与高等植物中有高度保守性(Xianfang Li，Shoucai Ma Cloning and  expression analysis of rpl21gene in wheat(triticum aestivum l.).Journal of Nuclear Agricultural  Sciences.20111：0006-00013)。同时，编码该蛋白的基因在大麦中为一单拷贝基因(刘良式植 物分子遗传学第二版2003)。

查找现有的小麦数据库(http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/westsql/map_locus.cgi)，发现 RPL21在六倍体小麦中有两个位点(4BL：5-0.86-1.00，1DL：2-0.41-1.00)。但是在本实验中， RPL21在六倍体小麦中很明显有三个条带。同时通过输入RPL21的序列 BlastN(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/blast.shtml)发现其在5AL，4BL，1DL上有三个同源性 极高的位点，因此，可能还有一个位点位于5A染色体组未被定位。

众所周知，面包小麦是由3种不同的物种(T.urartu，A.speltoides，A.tauschii)进化而来 (Junhua.H.P，Eviatar Nevo.Domestication evolution，genetics and genomics in wheat.Mol Breeding 201128：281-301)，因此，也可以认为六倍体小麦具有三个完整的基因组(AA，BB， DD)，或者说三套完整的遗传系统。而对于一个异源多倍体物种来说，单拷贝基因早已不再 是原来简单的一个基因组中仅仅出现一次的定义了，甚至可以被认为是一个大的基因族 (J.F.Wendel Genome evolution in polyploids.PlantMolecular Biology 200042：225-249)，而对 于小麦这样的六倍体而言，一个基因在每个六倍体面包小麦单倍体基因组存在三个位点算一 个单拷贝(P.G.Jones，J.C.Lloyd.Nucleotide Sequence of a Wheat Chloroplastic  Phosphoglycerate Kinase Gene.PlantPhysiol 1995107：1483-1484)。因此，以小麦内源结构 基因为内标准基因引物做qPCR检测外源基因插入位点数时必须先清楚其扩增位点数。

以DNA为基础的转基因成分检测方法(PCR法)，无论是定性还是定量都有技术上的 检测极限。定性检测的极限是指能检测到的DNA的最少数量。定量检测的极限是指测定转 基因DNA实际含量所需的最少转基因DNA数量。另外，有些植物种(如小麦)基因组很 大(含有大量染色体DNA，C＝17.33pg)，相对来说，参加PCR反应的外源基因的DNA只 有很小比例，因此检测的极限值升高。一般来说，小麦的定性检测极限为0.17％，定量检测 极限为1.73％(卢长明转基因作物监测原理与方法 http://blog.sciencenet.cn/home.php？mod＝space&uid＝203436&do＝blog&id＝230756)。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种用于小麦检测内标准基因引物，具有良好的小麦属物种 特异性，优异的种间稳定性。并通过生物信息学预测，普通PCR验证。

本发明的另一个目的是在于提供了一种利用单拷贝内标准基因引物RPL21-7/RPL21-8 在六倍体小麦基因组DNA定量的qPCR定量检测中的应用，定性检测极限为0.95个小麦基 因组，定量检测极限为5个拷贝数的小麦基因组，通过qPCR检测，线性关系良好。

本发明的再一个目的是在于提供了一种单拷贝内标准基因引物RPL21-7/RPL21-8在小 麦转基因拷贝数鉴定及定量检测中的应用。定性检测极限为0.2％转基因成分，定量检测极 限阈值为2％转基因成分。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种小麦检测内标准基因引物的制备方法，其步骤是：

1.通过不同数据库(NCBI、EMBL、DDBJ)筛选结构基因，以非同源区段设计引物，并 通过NCBI中Primer-Blast等生物信息学工具检测设计引物的物种特异性，并验证其引物在 不同数据库中的可能产物；

2.灭菌消毒萌发35种不同小麦品种与15个不同物种种子，取叶片CTAB法(M.G.Murray， W.F.Thompson.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research  1980Vol8：4321-4325)提取DNA。并通过普通定性PCR验证其在不同物种间的种属特异性 和不同小麦品种中的品种间稳定性。

内标准基因引物序列及相关信息

通过生物信息学预测该内标准基因引物仅在小麦属中扩增出目的条带，无非特异性产物， 同时，普通PCR验证其具有良好的小麦种属特异性与品种间稳定性。

一种内标准基因引物(RPL21-7/RPL21-8)在六倍体小麦基因组DNA定量的qPCR定量 检测中的应用，其步骤是：

A、Southern Blot鉴定RPL21基因在六倍体小麦中的位点数；

以下表中引物为探针进行Southern Blot鉴定RPL21基因在六倍体小麦中的拷贝数、 定位位点数

B、普通PCR扩增测序鉴定内标准基因引物扩增位点数；

以下表中引物序列(设计引物区段为基因外显子报收区段)扩增六倍体小麦不同来 源基因组物种种子萌发叶片提取DNA，并测序进行比对，并确认内标准基因引物来 源于六倍体小麦A基因组(Triticum Urartu)，且仅有位于A基因组上的模板，也就 意味这RPL21-7/RPL21-8在六倍体小麦中仅有一个扩增结合位点。

C、普通PCR确定内标准基因引物检测极限；

通过分光光度计测量提取的扬麦158DNA浓度，并梯度稀释，以普通PCR确定其定 性检测极限为0.95个六倍体小麦基因组DNA。

PCR反应体系：

10X EasyTaq Buffer；2U EasyTaq Polymerase；120μM dNTPs；1μL模板DNA；200μM 上、下游引物；ddH₂O补足至25μL；

PCR反应条件

预变性：95℃5min；

扩增：94℃40s；Ta 40s；72℃20s 40Cycle；

再延伸：72℃10min；

保温：10℃10min；

D、qPCR确定其定量检测极限；

qPCR体系

2X SsoFast Eva SYBR GreenI mixture(Bio-Rad Co.Ltd，USA)；125μM上、下游引物；

1μL DNA模板(梯度稀释)；ddH2O补足至20μL；

qPCR条件

(Roche LightCycler480III，Roche Co.Ltd，Switzerland)

Pre-Denaturation：98℃2min；

Quantitative：98℃5s；Ta 20s；72℃20s(single)45Cycele；

Melting Curve：95℃10s；65℃1min；95℃(continuous)；

Cooling：40℃2min

确定内标准基因引物定量检测极限为5个六倍体小麦基因组。

E、PCR确定C_T值与小麦基因组数目之间的线性关系。

qPCR体系：

2X SsoFast Eva SYBR GreenI mixture(Bio-Rad Co.Ltd，USA)；125μM上、下游引物；

1μL DNA模板(梯度稀释)；ddH2O补足至20μL；

qPCR条件

(Roche LightCycler480III，Roche Co.Ltd，Switzerland)

Pre-Denaturation：98℃2min；

Quantitative：98℃5s；Ta 20s；72℃20s(single)45Cycele；

Melting Curve：95℃10s；65℃1min；95℃(continuous)；

Cooling：40℃2min

一种内标准基因引物(RPL21-7/RPL21-8)在小麦转基因定量检测中的应用，其步骤是：

a、不同比例转基因小麦DNA提取；

1)实验试剂配制：Extraction Buffer：50mM Tris-HCl PH 9.0；200mM NaCl； 1％Sarkosyl(m/v)；20mM EDTA；5mM DTT)，121℃35min；

2)CK(Y11)与T(转基因株系R4)后代种子(见遗传资源表2)，由实验室高春生博士 提供置于28℃烘箱3天，研磨机研磨成均一粉末，并称取不同重量共计2克混合；

3)将称量好的小麦粉末加入15ml Extraction Buffer，涡旋仪剧烈摇匀5min；

4)加入等体积15ml预冷PCI，剧烈摇匀，12,000rpm 10min；

5)吸取上清13ml，加入等体积CI，剧烈摇匀，12,000rpm 10min；

6)吸取上清10ml，加入0.8倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min；

7)12,000rpm 10min，弃上清，预冷70％(V/V)乙醇洗涤沉淀，12,000rpm 10min；

8)弃上清，预冷无水乙醇洗涤沉淀，12,000rpm 10min。弃上清，甩干，吸取多余 无水乙醇，置于通风橱内风干；

9)加入2ml TER，室温溶解一周，凝胶电泳检测(见附图10)并用分光光度计(UV-1800， Shimadzu Co.Ltd，Japan)测量DNA浓度及质量；

b、qPCR计算不同样品DNA中拷贝数、转基因成分比例，并与样品本身相互验证。

qPCR体系：

2X SsoFast Eva SYBR GreenI mixture(Bio-Rad Co.Ltd，USA)；125μM上、下游引物；

1μL DNA模板(梯度稀释)；ddH2O补足至20μL；

qPCR条件：

(Roche LightCycler480III，Roche Co.Ltd，Switzerland)

Pre-Denaturation：98℃2min；

Quantitative：98℃5s；Ta 20s；72℃20s(single)45Cycele；

Melting Curve：95℃10s；65℃1min；95℃(continuous)；

Cooling：40℃2min

以下表中引物序列扩增外源插入基因，设计的内标准基因引物扩增内源基因，并通过 拷贝数比值得出插入拷贝数和转基因成分比例。

qPCR结果分析外源目的基因与内标准基因引物扩增效率，通过下列公式得出外源目的 基因插入拷贝数，与转基因成分所占比例。

$\frac{{(1+E_F)}^{-C_{T_F}}}{{(1+E_R)}^{-C_{T_R}}}=n···\left(1\right)$

$n=2^{-\Delta C_T}···\left(2\right)$

n/N＝Transgenic％…………………………………(3)

$C_T=-3.268*{\log }_{(1+E_R)}N+35.72···\left(4\right)$

EF、EF＝外源基因，内标基因扩增效率；CTF、CTR＝外源基因，内标基因扩增循环

阈值；n＝外源基因插入位点数与内标准基因定位位点数比值，N＝单倍体基因组中外源

基因插入位点数与内标准基因位点数比值，当样品为100％转基因时，n＝N。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

在国内2006年由栾凤侠等人设计的基于γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)的内标准基因引 物可以用于转基因小麦定性检测(栾凤侠，张洪祥，白月小麦内源特异参照基因的查找与 定性PCR和实时荧光PCR验证生物技术200616卷：50-52)；而在国外，M_AYU I_IDA等 人通过设计Waxy-D1为模板的内标准引物检测极限为15个基因组，定量极限未知(M_AYU  I_IDA，AKIHIRO HINO Development of Taxon-Specific Sequences of Common Wheat for the  Detection of Genetically Modified Wheat.J.Agric.Food Chem 200553：6294-6300)；Hernandez 等人基于ACC-1基因设计的内标准基因引物检测极限1个基因组，定量极限20个基因组 (M.Hernandez Real-Time Polymerase Chain Reaction Based Assays for Quantitative Detection of  Barley，Rice，Sunflower，and Wheat.J.Agric.Food Chem 200553：7003-7009)；2006年，Ronning 等人基于PKABA1基因设计的内标准基因引物检测极限与本实验大体一致，定量极限为5 个基因组，检测极限1.8个基因组(S.B.Ronning，A.H.Jensen.Novel Reference Gene，PKABA1， Used in a Duplex Real-Time Polymerase Chain Reaction for Detection and Quantitation of  Wheat-and Barley-Derived DNA.J.Agric.Food Chem 200654：682-687)；Vautrin等人基于 ALMT-1基因设计的内标准基因引物检测极限2个基因组，定量极限20个基因组(S.Vautrin， D.Zhang.Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for Endogenous Reference Gene for  Specific Detection and Quantification of Common Wheat-Derived DNA (Triticum aestivumL.). Journal of AOAC international 200790：794-801)。其中，已知Waxy-D1位于D基因组中， GAG56D至少位于A、D基因组中，ACC-1、PKABA、ALMT-1来源未知。而本发明的用于 转基因小麦定量检测的内标准引物RPL21-7/RPL21-8确定来源于A基因组，定性PCR检测 极限为0.95个小麦基因组，定量qPCR检测极限为5个小麦基因组，2％的转基因成分小麦 DNA。

附图说明：

图1为一种BlastN检测RPL21基因物种特异性示意图

RPL21基因在禾本科作物中小麦属特异性好，目的基因RPL21仅在找到小麦属中具有高 同源性片段；

图2为一种Primer-Blast检测RPL21-7/RPL21-8引物特异性示意图

在NCBI数据库中通过Primer-Blast检测引物在禾本科中的可能扩增产物，仅找到设计引 物区段产物

图3为一种检测RPL21-7/RPL21-8引物特异性示意图

RPL21-7/RPL21-8在16不同物种中的扩增结果：1：DL 100Marker；2：ddH2O；3：Triticum  aestivum：郑9023；4-12：oryza Sativa：华质49、华560、华564、Ne-3、Ne-9、Ne-L-11、RHS、 ZR64、9311；13-17：Hordeum vulgare：大麦1号、大麦6741、大麦A438、大麦07A349、大 麦32386；18：Zea mays：郑单958；19：Secale cereale：黑麦4；20：Lycopersicon sculentun：番茄 3号；21：Vigna unguiculata：江西丰城3号；22：Brassica campestris：油菜3；23：Brassica rapa： 华良早5号；24：Gossypium spp：鄂棉杂；25：Giycine max：中黄3号；26：Arabidopsis thaliana：；27： Vigna radiata：中绿1号；28：Cucumis sativus：华黄瓜2号；29：Solanum tuberosum：中薯13；30： Pisum sativum：中豌6。仅在小麦属的郑9023中有扩增产物。

图4为一种检测RPL21-7/RPL21-8种间稳定性示意图

RPL21-7/RPL21-8在35个不同小麦品种中的扩增结果：1、20为DL100Marker；2为ddH₂O； 3-19、21-38依次为35个小麦品种：Ponpei，周麦19，豫农99，豫麦10，温麦6号，郑 麦004，小偃81，徐麦958，泰山034682，洛麦21，冀58，科农119，新原958，中国春， 矮抗8号，吨抗58，运4002，烟福188，平安3号，众麦1号，新麦19，阜麦936，冀麦 776，郑9023，豫农49498，豫农391，豫麦9676，豫麦7036，豫麦58，周麦16，温麦8， 温麦19，泰山04533，丰舞981，矮抗58。在所有小麦品种中均能扩增出目的条带。

图5为一种Southern Blot鉴定RPL21基因大致位点示意图

1-4依次表示ECoR V、Hind III、Nde I、Sac I酶切消化扬麦158基因组DNA，RPL21在 3号泳道最多有多达3个条带，由此推知RPL21在六倍体小麦中有1个拷贝，3个定位位点。

图6为一种普通PCR检测RPL21-7/RPL21-8检测极限示意图

其中：1.DL100Marker；2.ddH₂O；3.82.33ng；4.16.5ng；5.8.233ng；6.1.65ng；7.823pg； 8.165pg；9.82.3pg；10.16.5pg；11.8.23pg；12.4.1pg；13.1.65pg。RPL21-7/RPL21-8常 规PCR检测极限为16.5pg或0.95个基因组。

图7为一种qPCR检测RPL21-7/RPL21-8溶解峰值示意图

通过查看RPL21-7/RPL21-8在qPCR中扩增溶解曲线，在反应中仅有一个峰值，证明其 无非预期产物

图8为一种qPCR检测RPL21-7/RPL21-8扩增循环曲线示意图

通过查看RPL21-7/RPL21-8在qPCR中扩增循环曲线，梯度相关性，扩增荧光累积量均正 常。

图9为一种qPCR RPL21-7/RPL21-8扩增标准曲线示意图

利用Roche480所带软件分析扩增CT值与qPCR体系起始DNA浓度之间的线性关系，结 果良好。

图10为一种提取小麦种子DNA结果示意图

其中1：DL100Marker；2：0.0％；3.0.2％；3.0.5％；4.1.0％；5.2.0％；6.5.0％；7.20％；8.50％； 9.100％。可以很清楚的看到提取小麦DNA质量很好。

图11为RPL21-7/RPL21-8扩增内标准基因及NPR-3/NPR-4扩增外源插入基因结果示意图

其中3、14：DL100Marker；1：RPL21-7/RPL21-8水对照；2：以0.0％转基因小麦DNA 扩增RPL21-7/RPL21-8产物；4：以0.2％转基因小麦DNA扩增RPL21-7/RPL21-8产物；5： 以0.5％转基因小麦DNA扩增RPL21-7/RPL21-8产物；6：以1.0％转基因小麦DNA扩增 RPL21-7/RPL21-8产物；7：以2.0％转基因小麦DNA扩增RPL21-7/RPL21-8产物；8：以 5.0％转基因小麦DNA扩增RPL21-7/RPL21-8产物；9：以20％转基因小麦DNA扩增 RPL21-7/RPL21-8产物；10：以50％转基因小麦DNA扩增RPL21-7/RPL21-8产物；11：以 100％转基因小麦DNA扩增RPL21-7/RPL21-8产物；12：NPR-3/NPR-4水对照；13：以0.0％ 转基因小麦DNA扩增NPR-3/NPR-4产物；15：以0.2％转基因小麦DNA扩增NPR-3/NPR-4 产物；16：以0.5％转基因小麦DNA扩增NPR-3/NPR-4产物；17：以1.0％转基因小麦DNA 扩增NPR-3/NPR-4产物；18：以2.0％转基因小麦DNA扩增NPR-3/NPR-4产物；19：以5.0％ 转基因小麦DNA扩增NPR-3/NPR-4产物；20：以20％转基因小麦DNA扩增NPR-3/NPR-4 产物；21：以50％转基因小麦DNA扩增NPR-3/NPR-4产物；21：以100％转基因小麦DNA 扩增NPR-3/NPR-4产物。从图中可以看到，RPL21-7/RPL21-8除ddH₂O外均能扩增出目的 片段，NPR-3/NPR-4可以在ddH₂O、0.0％转基因小麦DNA以外所有样品中具有良好扩增结 果，同时扩增产物与转基因成分比例明显成正相关。

图12通过以AA、BB、DD基因组为模板，保守外显子区域设计引物扩增RPL21基因特定 区域，将扩增产物测序并与NCBI数据库中已知RPL21基因进行Clustal比对分析，其中黑 框为内标准基因引物RPL21-7/RPL21-8序列。由图可以很明显看出RPL21-7/RPL21-8来源 与AA基因组中，与NCBI数据库中已知RPL21基因序列一致，同时，与BB，DD差异明 显，在BB，DD基因组中无扩增结合位点。

图13以AA、BB、DD基因组为模板扩增所得RPL21基因特殊区域测序结果与NCBI数据 库中已知RPL21基因进行进化树分析示意图

从图中可以看出六倍体小麦中RPL21基因与AA基因组中亲缘关系更近，DD次之，BB 最远。

图14一种以100％转基因小麦为模板，利用RPL21-7/RPL21-8、NPR-3/NPR-4引物进行qPCR 扩增，检测转基因小麦外源基因插入数示意图

从图中可以看出RPL21-7/RPL21-8、NPR-3/NPR-4扩增曲线良好。

图15一种以RPL21-7/RPL21-8、NPR-3/NPR-4为特异引物进行qPCR扩增检测其溶解曲线 RPL21-7/RPL21-8、NPR-3/NPR-4进行qPCR退火温度均稳定，没有非特异性产物。

图16一种以不同转基因浓度小麦DNA：0.0％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、20％、 50％、100％通过NPR-3/NPR-4、RPL21-7/RPL21-8进行内标准基因及外源插入基因的特异 扩增，利用Roche LightCycler480所带定量分析软件，进行外源基因和内标准基因分子数相 对定量计算结果示意图

不同转基因浓度小麦DNA：0.0％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、20％、50％、100％， 以NPR-3/NPR-4、RPL21-7/RPL21-8为引物进行qPCR扩增，计算其外源基因与内标准基因 拷贝数比值分别为0.00717、0.0115、0.0361、0.0477、0.1055、0.3926、0.9872、1.771，最 终得出其转基因成分比值依次为：0.40％、0.65％、2.04％、2.69％、5.96％、22.17％、55.74％、 100.00％，可知其拷贝数为2左右，定量检测极限阈值为2％左右。

图17一种利用Southern Blot检测R4株系外源插入数示意图(高春生博士提供)

图中CK为扬麦11，R4很明显有2个插入位点。

图18一种利用普通PCR检测R4株系纯和率的示意图

随机挑取R4株系后代种子40颗，萌发，挑选其中35棵长势较好幼苗提取幼嫩叶片DNA， 以特异性引物NPR-3/NPR-4进行鉴定。其中，1、21：DL100Marker；2：ddH₂O；3、4：扬 11CK；5-20、22-40：R4转基因株系后代植株DNA。从中可以看出，5、9、11、25无明显 条带，也就意味着R4并非纯合植株，但是纯和率与计算所得1.771个拷贝比较一致。

具体实施方法：

实施例1：

一种小麦检测内标准基因引物的制备方法，其步骤是：

1.筛选物种特异性好的基因，同时以非同源区段设计引物，非同源区段(见图1)。以此 为模板设计引物，扩增区段如下，同时将上下游序列进行Primer-Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/#)

分别设置比对参数，特异物种：Poales；数据库：nr(见图2)。

901 ATGTAATGTT GCATATGGGT TGCATATCCT AGCCCGTTTC ATCTAATGTG TCCTAGTTTG

961 GATGCATTTC ATGGCTTGTT TTGTCTAATA TGTAGTAGTT TGGATGCATT TCATGGCTCA

1021 TCTTTGTATG CTGATAAGAT TTTTGTACAC GGTAAGTGTT AGCTCTCTAA TGGTTCTCGT

1081 TGGTAGTAGT TGTTTGTTTT ATCCATTTGG ATTGGTAGAC CACAGTAAGC CACATTTTAC

2.实验材料(购自华中农业大学农贸市场)：

16个不同物种种子：1：小麦Triticum aestivum：郑9023；2：水稻oryza Sativa：华质49、 华560、华564、Ne-3、Ne-9、Ne-L-11、RHS、ZR64、9311；3：大麦Hordeum vulgare：大 麦1号、大麦6741、大麦A438、大麦07A349、大麦32386；4：玉米Zea mays：郑单958； 5：黑麦Secale cereale：黑麦4；6：番茄Lycopersicon sculentun：番茄3号；7：豇豆Vigna  unguiculata：江西丰城3号；8：油菜Brassica campestris：油菜3；9：小白菜Brassica rapa： 华良早5号；10：棉花Gossypium spp：鄂棉杂；11：黄豆Giycine max：中黄3号；12：拟 南芥Arabidopsis thaliana：；13：绿豆Vigna radiata：中绿1号；14：黄瓜Cucumis sativus：华 黄瓜2号；15：马铃薯Solanum tuberosum：中薯13；16：豌豆Pisum sativum：中豌6。

35个不同小麦品种：Ponpei，周麦19，豫农99，豫麦10，温麦6号，郑麦004，小偃 81，徐麦958，泰山034682，洛麦21，冀58，科农119，新原958，中国春，矮抗8号， 吨抗58，运4002，烟福188，平安3号，众麦1号，新麦19，阜麦936，冀麦776，郑9023， 豫农49498，豫农391，豫麦9676，豫麦7036，豫麦58，周麦16，温麦8，温麦19，泰山04533， 丰舞981，矮抗58。

不同物种种子灭菌消毒取叶片：

挑选饱满干净的种子，70％(V/V)乙醇浸泡30秒，然后10％NaClO浸泡10分钟， 无菌水冲洗3-5次每次1-3min，消毒的种子浸泡在无菌水中、28℃，220r/min萌动过夜， 露白后放置于灭菌培养皿中滤纸上萌发至2叶期取幼嫩叶片。

提取DNA：

取幼嫩小麦叶片，采用改进的CTAB法抽提DNA，具体步骤如下：

1)取小麦幼嫩叶片0.1～0.5g放入烘干灭菌的研钵，倒入液氮迅速将叶片磨成粉末并装入2 ml离心管中。

2)磨好的样品中加入0.9ml预热的CTAB缓冲液混匀，65℃水浴1小时，期间颠倒混匀3次。

3)加入5mol/L的醋酸钾214μl，氯仿158μl，上下颠倒混匀至氯仿层颜色加深，-20℃放置 30min。

4)室温(20℃，以下相同)下10500r/min离心15min，吸取上清液700μl转移入新的1.5ml 离心管，加入560μl异丙醇，70μl3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀数次，室温放置10min。

5)10000r/min离心15min，弃上清，风干至异丙醇挥发完全(约20min)。

6)加入500μl预冷的70％(V/V)乙醇浸洗沉淀，将沉淀悬起，使之脱离管底。

7)10500r/min离心5min，弃上清，自然干燥。

8)加入30μlTE缓冲液，0.1～0.2μl10mg/mlRNaseA，4℃过夜溶解，-20℃贮存备用。

3.物种特异性、品种间稳定性检测：

PCR反应体系：

10X EasyTaq Buffer(Transgene Co.Ltd，China)，

2U EasyTaq Polymerase，

120μM dNTPs，

1uL模板DNA(不同物种和不同品种小麦提取DNA)

200μM上、下游引物，

ddH2O补足至25μL；

PCR反应条件

(ABI 2720ThermoCycler，Applied Biosystem Co.Ltd，USA)

预变性：95℃5min；

扩增：94℃40s，

      Ta 40s，

      72℃20s 40Cycle；

再延伸：72℃10min；

保温：10℃10min

图3为不同物种内标准基因引物扩增结果，仅小麦中郑9023有目的条带；图4为不同品种 小麦扩增结果，其中除ddH2O以外，均能看到目的条带。通过上述结果可以发现：设计的 内标准基因引物，仅在小麦属中能扩增出目的条带且无非特异性条带，其它物种中无目的条 带；该内标准基因引物在35个小麦品种中均能扩增出目的条带，也就是说，该基因稳定存 在于小麦基因组中(极有可能来源于AA基因组乌拉尔图小麦)，该内标准基因完全适用于 小麦属基因组DNA特异性检测。

实施例2：

一种内标准基因引物(RPL21-7/RPL21-8)在六倍体小麦基因组DNA定量的qPCR定量检 测中的应用，其步骤是：

1.Southern Blot鉴定拷贝数

探针制备：

用Takara的随机引物标记试剂盒进行探针的同位素标记。

标记的步骤如下：

1)在1.5ml离心管中加入100ng探针DNA，2μl随机引物；并补水到14μl。

2)沸水中煮沸5min，冰水浴中冷却5min，离心。

3)加入2.5μl 10×Buffer，2.5μl dNTP，5μl α-[32P]-dCTP。

4)加入1ul DNA聚合酶。37℃水浴30min。

5)加入1.6ul的0.5MEDTA，终止反应。

6)沸水中煮沸5min，冰水浴中冷却10min，离心。

酶切和电泳：

取约15～20μg小麦基因组DNA，加3U/μg的限制性内切酶ECoRV、Hind III、Nde I、SaC I，在合适的反应体系中，37℃的温箱中进行DNA的消化。酶切时间为12h左右。

1)酶切结束后，取二十分之一的DNA在0.8％的胶上电泳检测酶切的效果，其他的放在 4℃中。

2)检测完后，若酶切效果可以，将DNA于75℃水浴中灭活10min，然后置于4℃中 备用。

3)电泳前于56℃水浴中，2～3min，使重新粘连的片段断开。

4)制0.8％的琼脂糖凝胶，胶厚度10mm，360ml胶，梳孔宽7mm。胶倒好后，检查一 下孔里是否有气泡。

5)DNA样品中加入0.1倍体积10×Loading Buffer。混合均匀后，缓慢的点入孔内，使 DNA沉入底部。

6)先在100V的电压下进样10min，然后在30V的电压下电泳20h，使溴酚蓝到点样 孔的距离为15cm左右。

7)电泳结束后用一个荧光标尺标记Marker各条带与点样孔间的距离。

转膜：

1)用刀片切去胶的无用部分，但是要留下一半的点样孔，便于将其标示在杂交膜上。

2)在胶的左下角(第一个样品的末端)切一个小三角，用于标记电泳的方向。

3)将Marker泳道切去。

4)将胶浸入盛有0.2M HCl的塑料盘中，至溴酚蓝变为黄色，立即将胶转入蒸馏水中反复 漂洗约10min。

5)将胶在0.4M NaOH/1M NaCl溶液中浸泡胶25min，并反复的摇动；

6)裁一块四周都比胶大2mm的杂交膜，及两块与膜同样大小的厚滤纸。

7)将裁好的杂交膜漂在蒸馏水中，直至从上到下都被浸湿，将其转入碱转移液中浸5min， 然后用干净的剪刀剪去膜的一角，正好与胶上切出的角对应。

8)DNA变性过程的同时，在塑料盘中加入合适量的转移液，并在盘上放一块合适大小的 玻璃板。裁两块比较大的滤纸条(用作盐桥)，将其中间浸湿搭于玻璃板上，两头浸在 转移液中，使滤纸完全浸湿，并用玻璃棒将可能的气泡赶去。

9)将第5步中变性好的胶点样孔方向向下置于盐桥的中央，胶与滤纸之间不能有气泡，用 塑料片将胶的四周围起来，以免转印短路。

10)将适量的转移液洒于胶上，将膜缓慢的盖在胶上，避免气泡，膜的一边应该稍稍超出胶 的点样孔线。放好后就不能再移动。

11)用转移液浸湿两张厚滤纸，然后将其放在膜上。用玻璃棒赶出气泡。

12)将5～8cm厚的吸水纸(与步骤6的印迹滤纸同样大小)放置在印迹滤纸上，上面放一块 玻璃板，并放约500g的重物。

13)随时更换浸湿的吸水纸，同时注意补加转移液，转移24h。

14)转移完毕后，将吸水纸和印迹滤纸揭去，将膜置于干燥的滤纸上。

15)把膜放在中和缓冲液(0.5M Tris-Cl(pH 7.2)，1M NaCl)中浸泡10min。用两张滤纸 包住膜，在室温下干燥膜30min，然后置于80℃的干燥箱中，干燥1.5h。杂交膜如果 不直接用于杂交，可用滤纸包起来，在4℃中保存。

预杂交：

1)根据下表配制预杂交液。

(预)杂交液组成(10ml)

浸入6×SSC或6×SSPE使膜充分的浸湿约2min。

3)将Salmon Sperm DNA在沸水中煮8min。冰水浴中充分冷却(10min)。加入65℃预热 的杂交液中。

4)轻柔的将浸湿的杂交膜卷成圆柱形，放入杂交管中，加入65℃预热的预杂交液，旋 转杂交管，去除气泡，拧紧杂交管。

5)将杂交管放入65℃的杂交炉中，预杂交15h左右。

杂交：

1)补加300ul杂交液于标记好的探针液中，100℃煮沸5mm，放在冰水浴中冷却，离心。

2)倒掉预杂交液，将65℃预热的杂交液加入杂交管中，再将变性的探针加入杂交管中， 杂交36h左右。

洗膜：

1)将杂交膜从杂交管中取出，将杂交液倒入放射性废液桶中。

2)将膜放入盛有300ml的1x SSC和0.5％SDS洗膜液的塑料盘中，室温下摇动10min。

3)将第一次的洗膜液倒入放射性废液桶中，加入300ml的1x SSC和0.1％SDS洗膜液，45℃， 摇动2min。

放射自显影：

1)将膜从洗膜液中取出，放置在干净的滤纸上，除去大部分的液体。

2)然后用保鲜膜包住，放在曝光夹中，将磷屏压上。压片15h左右。

3)将磷屏取出，在富士公司的磷屏显像仪上照相。

杂交膜的回收利用：

1)将0.1％SDS煮沸。

2)将其倒入放有膜的塑料盒中，反复摇动15min。

3)用2×SSC漂洗。

如图5所示：1-4依次表示ECoR V、Hind III、Nde I、SaC I酶切消化Yangmai158基因组 DNA。

RPL21在1，2，4号泳道有1个条带，在3号泳道里有三个条带，由此推知RPL21在六倍 体小麦中有3个定位位点，1个拷贝。

2.普通PCR扩增测序鉴定内标准基因引物扩增位点数：

利用已知数据库(NCBI)中RPL21序列，根据其保守外显子区域设计引物，扩增六倍体小 麦不同来源物种中RPL21部分区段，并通过克隆测序比对其差异位点，并通过PCR验证， 最终确认内标准基因引物在六倍体小麦中扩增位点数。

实验材料：小麦六倍体基因组不同来源物种品种

AA Genome：Triticum Urartu     UR202、UR207

BB Genome：Aegilops Speltoides AE142、AE160

DD Genome：Aegilops Tauschii   Y220、Y225

其中AA(Triticum Urartu)、DD(Aegilops Tauschii)基因组种子由中国农科院作物研究所 贾继增老师提供(见遗传资源表1)；BB(Aegilops Speltoides)基因组种子由刘易科博士提 供(见遗传资源表3)。

通过以上结果可以确认，内标准基因引物在已知面包小麦中扩增结合位点与AA基因组几乎 完全一致，意味着，内标准基因引物在一个六倍体小麦基因组中中仅有一个来源于A基因 组中的扩增模板(比对结果及进化树分析见附图12、13)。

表：扩增区段测序结果与已知RPL21基因比对结果

3.PCR定性检测极限：

PCR反应体系：

10X EasyTaq Buffer(Transgene Co.Ltd，China)，

2U EasyTaq Polymerase，

120μM dNTPs，

1μL模板DNA(小麦提取DNA利用NanoDrop测定浓度，并梯度稀释，浓度依次为：

1.82.33ng；2.16.5ng；3.8.233ng；4.1.65ng；5.823pg；6.165pg；7.82.3pg；8.16.5pg；9.8.23pg； 10.4.1pg；11.1.65pg)

200μM上、下游引物，

ddH2O补足至25uL；

PCR反应条件：

(ABI 2720ThermoCycler，Applied Biosystem Co.Ltd，USA)

预变性：95℃5min；

扩  增：94℃ 15s，

        Ta   20s，

        72℃ 20s 40Cycle；

再延伸：72℃ 10min；

保  温：10℃ 10min

如图6所示，RPL21在小麦中的定性检测极限为16.5pg或者0.95个基因组。

4.定量PCR鉴定定量极限

qPCR体系

2X SsoFast Eva SYBR GreenI mixture(Bio-Rad Co.Ltd，USA)，

125μM上、下游引物，

1μL DNA模板(梯度稀释)，

ddH₂O补足至20μL；

qPCR条件

(Roche LightCycler480III，Roche Co.Ltd，Switzerland)

Pre-Denaturation：98℃2min；

Quantitative：98℃  5s，

              Ta    20s，

              72℃  20s(single)45Cycele；

Melting Curve：95℃ 10s，

               65℃ 1min，

               95℃(continuous)；

Cooling：      40℃ 2min

定量检测极限，PCR体系中模板逐级稀释，浓度及计算结果见下表

5.线性相关性

qPCR体系：

2X SsoFast Eva SYBR Green I mixture(Bio-Rad Co.Ltd，USA)，

125μM正向/反向引物，

1μLDNA模板(梯度稀释，基因组拷贝数量依次为：9990，4995，2497.5，1248.8，624.4，312.2， 78.0，39.0)，

ddH2O补足至20μL；

实施例3：

一种内标准基因引物(RPL21-7/RPL21-8)在小麦转基因定量检测中拷贝数鉴定及转基因成 分计算中的应用，其步骤是：

1.用于转基因小麦定量检测小麦种子DNA提取：

1)实验试剂配制

Extraction Buffer：50mM Tris-HCl PH 9.0：200mM NaCl；1％Sarkosyl(m/v)：20mM EDTA； 5mM DTT)，121℃35min：

2)CK(Y11)与T(转基因株系R4)后代种子，由实验室高春生博士提供置于28。℃烘箱3天， 研磨机研磨成均一粉末，并称取不同重量混合；

3)将称量好的小麦粉末加入15ml Extraction Buffer，涡旋仪剧烈摇匀5min；

4)加入等体积15ml预冷PCI，剧烈摇匀，12，000rpm 10min；

5)吸取上清13ml，加入等体积CI，剧烈摇匀，12，000rpm 10min；

6)吸取上清10ml，加入0.8倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min；

7)12，000rpm 10min，弃上清，预冷70％乙醇洗涤沉淀，12，000rpm 10min；

8)弃上清，预冷无水乙醇洗涤沉淀，12，000rpm 10min。弃上清，甩干，吸取多余无水乙 醇，置于通风橱内风干；

9)加入2ml TER，室温溶解一周，凝胶电泳检测(见附图10)并用分光光度计(UV-1800， Shimadzu Co.Ltd，Japan)测量DNA浓度及质量(结果见下表)；

qPCR体系：

2X SsoFast Eva SYBR GreenI mixture(Bio-Rad Co.Ltd，USA)；125μM上、下游引物；1μL DNA模板(梯度稀释)；ddH2O补足至20μL；

qPCR条件

(Roche LightCycler480III，Roche Co.Ltd，Switzerland)

Pre-Denaturation：98℃2min；

Quantitatiye：98℃  5s；Ta    20s；72℃  20s(single)  45Cycele；

Melting Curve：95℃  10s；65℃1min；95℃(continuous)；

Cooling：40℃ 2min

如图7、8、9所示，溶解峰值、扩增曲线、标准曲线均很好，线性相关性很好。

$\frac{{(1+E_F)}^{-C_{T_F}}}{{(1+E_R)}^{-C_{T_R}}}=n···\left(1\right)$

$n=2^{-\Delta C_T}···\left(2\right)$

n/M＝Transgenic％…………………………………(3)

$C_T=-3.206*{\log }_{(1+E_R)}N+35.21···\left(4\right)$

E_F、E_F＝外源基因，内标基因扩增效率；C_TF、C_TR＝外源基因，内标基因扩增循环阈值；n＝外源基因插入位点数与内标准基因定位位点数比值，N＝ 单倍体基因组中外源基因插入位点数与内标准基因位点数比值，当样品为100％转基因时，n＝N。

通过利用公式(1)，100％转基因材料可以检测外源基因插入位点数，当EF＝EF＝1时，可以 通过公式(2)快速计算得知；

公式(4)可以定量检测小麦基因组拷贝数；

当已知一种转基因小麦外源插入位点数时，利用公式(3)计算转基因成分所占百分比。 检测外源基因拷贝数及转基因成分比例

以已知NPRI基因序列(高春生师兄提供)为模板，设计特异性引物，序列信息见下表。

表：NPR特异引物及相关信息

通过公式(2)、(3)可得其拷贝数和转基因成分比例计算值如下表

表：混合不同比例转基因预测所得转基因成分比值

从上表可以看出转基因定量检测极限在2％左右时结果比较可信，而这也与预测的转基 因小麦定量检测极限阈值1.73％较为接近。将35颗R4植株后代单粒种子萌发，提取DNA， 通过NPRI特异引物鉴定，在35个单粒种子萌发植株叶片提取的DNA中有4粒种子未鉴定 出目的基因(见附图18)，而已知R4株系有两个拷贝(见附图17)。由此可知，由于R4后 代并未完全纯和，所以造成qPCR拷贝数结果低于Southern Blot结果。

<110> Organization Name : 华中农业大学

<120>  适用于转基因小麦定量检测单拷贝RPL21内标准引物设计及应用

<130>  适用于转基因小麦定量检测单拷贝RPL21内标准引物设计及应用

<213> Organism Name:Triticum aestivum

<400> Pre Sequence String:

ATGTAATGTT GCATATGGGT TGCATATCCT AGCCCGTTTC ATCTAATGTG TCCTAGTTTG      60

GATGCATTTC ATGGCTTGTT TTGTCTAATA TGTAGTAGTT TGGATGCATT TCATGGCTCA     120

TCTTTGTATG CTGATAAGAT TTTTGTACAC GGTAAGTGTT AGCTCTCTAA TGGTTCTCGT     180

TGGTAGTAGT TGTTTGTTTT ATCCATTTGG ATTGGTAGAC CACAGTAAGC CACATTTTAC     240

<212> Type: DNA

<211> Length: 240

      Sequence Name :RPL21小麦属特异性区段

      Sequence Description : 小麦转基因定量检测内标准基因引物序列

Sequence:RPL21小麦属特异性区段:

<221> Forward Primer: RPL21-7

<222> Location From: 38

<222> Location To: 65

      CCTAGCCCGTTTCATCTAATGTGTCCTA

Sequence: RPL21小麦属特异性区段:

<221> Reverse Primer: RPL21-8

<222> Location From: 198

<222> Location To: 176

      TACTACCAACGAGAACCATTAGAGAGC