一种高水平表达基因启动子Ospz4及其应用方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从水稻中克隆出来的高水平表达基因启动子Ospz4及其应用方法。该Ospz4启动子能驱动下游基因在转基因水稻植株的根、茎、叶、花、胚乳和芽及转基因烟草叶脉中表达；经组织化学染色初步分析，该启动子的启动活性较高，这为水稻Ospz4启动子更广泛的高效启动外源基因的表达打下坚实基础。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从水稻中克隆出来的高水平表达基因启动子Ospz4及其应用方法。

背景技术

植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的DNA序列，位于基因上游，由核心元件和上游元件构成。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别是依赖DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。一旦RNA聚合酶结合在启动子上即可启动转录过程，因此启动子是基因表达调控的重要顺式元件，它与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等元件的相互作用是启动子调控模式的实质。

植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子(constitutive promoter)、组织特异性启动子(tissue-specific promoter)和诱导型启动子(induciblepromoter)。组成型启动子是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，不受外界环境条件的影响，几乎在所有植物不同组织中都能表达，且表达水平没有明显差异。目前，植物转基因工程中使用的多是组成型启动子。典型的是烟草花叶病毒(cauliflower mosaicvirus,CaMV)35S启动子，被广泛应用于双子叶植物转基因研究中。还有广泛应用于单子叶植物转基因工程研究的水稻Actin1和玉米Ubiquitin启动子。

近年来，植物启动子已被大量地研究，并且在农作物的分子遗传改良领域得到了广泛的应用。Zheng等利用Gt1基因启动子将菜豆球蛋白（β-phaseolin）基因特异表达于水稻种子的内胚乳中，获得了高蛋白质含量的水稻种子。Kasuga等利用rd29A启动子驱动来自拟南芥的转录因子DREB1A或CBF1，在转基因拟南芥中表达，有效地提高了抗寒力，而且对植物的生长影响甚微。

为了便于开展水稻的遗传改良研究，我们在水稻基因组芯片分析的基础上，克隆到一个在水稻中高水平表达基因5’末端启动子区域1.6-kb的DNA片断,命名为Ospz4启动子。转基因研究结果证实，水稻Ospz4启动子能高效启动外源基因的表达，具有很好的生产应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种从水稻中克隆出来的高水平表达基因启动子Ospz4及其应用方法。

一种高水平表达基因启动子Ospz4，序列如SEQ NO:1。

启动子Ospz4序列还包括将SEQ NO:1的整个序列改变不超过10%的碱基序列。

所述的基因启动子Ospz4的应用方法，能够启动外源基因的表达。

Ospz4启动子驱动下游基因在转基因水稻植株的根、茎、叶、花、胚乳和芽中表达，以及在转基因烟草叶脉中表达。

Ospz4启动子经PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）软件分析表明，翻译起始位点上游-131到-139位点之间有一个可能的TATA盒，-196到-200之间有一个可能的CAAT盒，该序列中存在G-BOX元件和5UTR Py-rich stretch元件，这些元件可能参与基因的表达调节。

SEQ NO:1

-1690CCATAAA TCAACTATAA ACATATTTTT AAGAGATAAA

-1630ATAAAATATA AGAGTAGCGG ACTACAGATC TGCAGCATGA AATCCAAGAC GTAATGTGTG

-1570TATGACAGGT AGGACTAGAT ATTAATAGTG TAATAAGTAT TATTGTATGA ATTAGCTATT

-1510ATATTGACTA TAAATAATTT AAAGATAGTA GTTGACTATA CTATTAAACT TCCTCTTACT

-1450CGTATTTTCA ACAAATTCTG TTTAAGAAAG GAAGATCGCA AATTTGTGGA TCGCGAGGGA

-1390TACGGTAGTA GATTGCGGGG GGCAAGGAGC AAAAATCACG AGTCCCCAAA ACGTCGCACG

-1330CGGTAAGCCG CCGTTTTATA CGGGGCGGCG TACTTTGCCT TGAGATGGAC GCGTATAAGC

-1270CGGCGCCTCG CGTTTTCTTC GTCCGTCCAC CGACCCAGCA GTGCACCTCC CGTTCGCCTC

-1210GCTCGCGAGC TCGCGTTACT TTACACCGCC GCCGCCGAGC TCTCCAGACT CCGGAGGAGG

-1150AAGCGATCGT TACACGTACG CCTCGTCAAG CAGAAGCAGG TGATCCTCCG CCCCTTCCGA

G-Box

-1090TCCCCTCGGT CCTCCGAGCT GTTCGATCTG AGAAGAAAAA AAAGAAAAAT CTGCTGGATT

5UTR Py-rich stretch

-1030ATACTTTGCT TGCTCTAGGA TTAATTCATC GCCTTATTAT GGTTGATGAT TTTATTTCCT

-970TCGTAATTAC TGCGTATGTT TTTCTCTCGG CTGTACCCGA TGGAATTTTG GTAGTTGGTT

-910TGGTGGTGTC CTGGTGATCC CCTTTGGAAC AATCGAACAT AATTCTTCAG GTTTATCGTG

-850TTGTATTTAG TAACTGTTCG TGCCAGTAAG TACTGTGTAG TGATTGTGAT TAGTGATATT

-790TGCTCATGCA TACAGGTTAG GTGAACTGGG TTTGCCGTCG TGGGGCATCA TGATCTCCCC

G-Box

-730GTTGTTTAGA GAAATCAGCT GTAGCTTTTG CTTTTGTAGA GCTTACCCCT TTTTTTTTTG

-670AACGAAACGA GCTTACCCCT TATCAGTTAT CACCGTGGCT GTGAAGCTAC AATTTCTTTC

-610CCTGCCCTTT TATTATTAGT GTTATGATAA ATTGATTGAT GTTGAGATAG TTCTTGTGAT

-550GTGTCCTGAT TTGAACTCTG CGTGTAAGCT GTGACATGTG TCCCCTATTT TTTTCCGCAC

-490CTCATCAAAC TGGATAGGTT CAGGATAAAC TATGTATTAT TAAAAACGCC ACCAAAACAA

-430GTTGATGCTT TGGTTTGCTG CTCGGATGTA ATGTGAACTT CCCAAAATCT TAATACAAAG

-370ATGCGCAACT CTTTTGCGCA TTCTCGAAAG AAAAAAAAAA CGCCATTGAA ACAAGTTGAT

-310GCTTGGTATA GTTAATGTGC TTATACTCTG TTGTGCAATG TAGTGAATAT ACTAGTTAGC

-250TGAAAATTGC ATGATATACT TTCAACCTTG ATGCTTCAAT TAAATATATT CCAATCTGCT

CAAT-box

-190GGGCACCGAT GATTTTTTTT TAAAAGATTG TACTCTGGAC ATCTCAAGCA GTATATATTA

TATA-box

-130ATACATGTAG TGTTTATGTT ATTAGTTTAC TTGGTTTTGC CCAGC

-70CTTTT GTCAGAGCCT AACAAGTGAT GTGTAATTAT CACGCATTTC TGTTGCAGAA

-10CATCTGAAGA ATGGCT

注：保守元件和翻译起始位点用下划线表示；PCR引物序列用方框标出。

本发明成功克隆出一种高水平表达基因启动子Ospz4，Ospz4启动子能驱动下游基因在转基因水稻植株的根、茎、叶、花、胚乳和芽中表达；以及在转基因烟草叶脉中表达。经组织化学染色初步分析，该启动子在各个器官的表达活性均非常高，这为水稻Ospz4启动子更广泛的高效启动外源基因的表达打下坚实基础。

附图说明

图1为Ospz4启动子PCR产物凝胶电泳分析；

M：1kb ladder marker；1、2:Ospz4的PCR产物；

图2为表达载体pCAMBIA1301zp4T-DNA的结构示意图；

P_35S为35S启动子；Hyg为潮霉素基因；T_NOS为终止子；

图3为pCAMBIA1301pz4载体质粒的酶切产物凝胶电泳分析；

M：DNA1kb ladder marker；1、2:pCAMBIA1301pz4的酶切产物；

图4为部分Ospz4转基因水稻植株中潮霉素基因的PCR扩增检测；

1:无模板阴性对照；2:未转化水稻植株阴性对照；3:表达载体pCAMBIA1301zp4阳性对照；4-12:潮霉素抗性水稻植株，5、6、9、11、12代表5株阳性转基因水稻植株；M:D2000DNAmarker；

图5为转Ospz4-GUS重组基因水稻植株不同组织中GUS活性的组织化学染色；

A，C，E，G，I，K分别为转基因水稻叶片、根、幼芽、颖花、胚乳染色后照片，可以看出染蓝色明显很深；B，D，F，H，J，L分別为对照水稻叶片、根、幼芽、颖花、胚乳染色后照片，未染色；

图6转Ospz4-GUS基因烟草叶片GUS染色。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1启动子克隆及活性检测载体构建流程

1.Ospz4启动子的克隆

①水稻基因组总DNA提取

取0.2g左右新鲜的日本晴水稻叶片，于液氮中研磨成粉。把粉末转到预冷的1.5ml离心管中，立即加入等体积（W/V）65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀，65℃保温10-20分钟，其间不断摇动。加入等体积的氯仿，轻轻颠倒离心管混匀，室温下，12,000rpm，离心10-20分钟，将上清液转入另一个1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿，颠倒混匀，室温下12,000rpm，离心10分钟。取上相，重复上一步骤一次。将上相转入另一新的1.5ml离心管中，用70%的乙醇沉淀两次，室温干燥沉淀。最后溶于30-50μl离子水（含RNase）中，于37℃处理15min，-20℃或者-70℃下保存备用。

②启动子的克隆、片段回收、克隆载体

根据水稻基因组芯片分析，我们选取了在逆境和非逆境条件下都高水平表达的基因OsSG4（Genbank登陆号为AK068991.1），设计并合成基因特异引物，以水稻品种日本晴基因组DNA为模板，用PCR方法分别扩增该基因起始密码子上游约1.6-kb长的启动子区域序列。引物序列分别为：上游引物Ospz4-F:5'-CCGTTAAAGCTTGTACAGTAGCA-3'（SEQ NO:2）和下游引物Ospz4-R:5'-TACCCAGCCATGGAGAAGTCG-3'（SEQ NO:3）。PCR反应按标准体系进行，反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环30次；72℃后延伸10min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离（图1）。

电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒（天为时代）回收目的基因片断。操作程序如下：将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，使胶块充分溶解。将上一步得到的溶液加到吸附柱中（吸附柱放在收集管中），13,000rpm离心30秒，去除废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm离心30秒，去除废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm离心30秒，去除废液，将吸附柱重新放入收集管中，13,000rpm离心2分钟。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附柱膜中间位置悬空滴加洗脱缓冲液，室温2分钟。13,000rpm离心一分钟收集DNA溶液。

然后参照pMD18-T Vector（TaKaRa）说明书，克隆入载体pMD18-T中，按试剂盒要求建立连接反应体系：pMD18-T Vector0.5μl，Solution I4.5μl，回收基因片断2μl，ddH₂O3μl，总反应体积10μl，在16℃连接过夜。

③大肠杆菌感受态制备及热激转化

制备大肠杆菌DH5α感受态细胞（CaCl₂法）：从37℃培养12-16h的平板中用无菌牙签挑取一个单菌落,转到含有3ml LB培养基的试管中,37℃培养过夜；取0.5mL过夜菌加到含100mlLB液的三角瓶中，37℃剧烈振荡（150-200rpm）培养2-3h，使OD₆₀₀达到0.3-0.4时立即冰浴10min，无菌条件下转到预冷的50ml灭菌离心管中。

连接产物用热激法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α：取一管感受态细胞，于冰上溶解，无菌条件下取5μl连接产物，加到感受态细胞中，用加样器吸打轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，将管迅速转到冰浴中放置2-3min；每管加无抗生素的LB培养基800μl，37℃摇床（100-160rpm），温和摇振1h左右；取200μl培养液涂于含Amp(氨苄青霉素Ampicillin)的LB琼脂板，37℃培养16h～20h，挑取单克隆菌落于含Amp液体LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养14h。

④质粒抽提及酶切鉴定

将培养物倒入1.5ml离心管中，用超低温离心机于4℃下以8000g/min离心1min，弃上清液，重复3次，最后用吸水纸吸干；将细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L TrisCl（ph8.0），10mmol/LEDTA（PH8.0），在高温、高压下蒸汽灭菌15min，贮存于4℃冰箱）中，剧烈振荡；加200ul溶液II（0.2M NaOH，1%SDS）,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，应确保离心管的整个内表面均与溶液II接触，不要振荡，将离心管放置冰上；加入150ul用冰预冷的溶液III（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml），盖紧管口，将管倒置后，温和振荡10S，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管静置于冰上3-5min；微量离心机于4℃，12,000g/min离心5min，将上清液移到另一离心管中；加等量异丙醇放于4℃冰箱中或冰块中30min；在4℃低温离心，12500rpm，20-30min。弃上清液；加70%的乙醇500ul，洗涤，然后低温离心5min，弃上清液；于干燥机中干燥10min；加无菌水100ul，另加RNase5ul，放在37℃培养箱30min。

将提取到的大肠杆菌质粒用HindIII和EcoRI酶切，放在37℃培养箱2h，将酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，以检测是否为阳性克隆，然后送Invitrogen公司测序。

2.水稻启动子活性检测载体构建

将测序验证为正确的Ospz4启动子区片段经HindⅢ与Nco Ⅰ酶切，克隆入质粒pCAMBIA1301（CambiaLabs,http://www.cambia.org/daisy/bioforge_legacy/3725.html）中，即得到含有Ospz4-GUS重组基因的表达载体pCAMBIA1301pz4。图2展示已构建好的表达载体的结构。

用HindIII和NcoI酶切载体，酶切结果鉴定表明启动子序列已经正确连接到启动子分析载体pCAMBIA1301上(图3)。

农杆菌感受态细胞制备：将保存的农杆菌在固体LB培养基上划线EHA105（100ug/ml Rif+50ug/ml CHL）;GV3101(100ug/ml Rif+50ug/ml Gent)，28℃培养；挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16hr；取2ml菌液转接于100ml LB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5；转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液；加入10ml预冷的0.02M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清；加入4ml预冷的含15%甘油的0.02M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮；农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃备用。

转化农杆菌：取1μg左右的质粒DNA（pCAMBIA1301pz4）加入到200μl感受态细胞中，混匀后，冰上放置10分钟；液氮1min，再在37℃水浴5min；加入800μl LB液体培养基，28℃，200rpm摇培3h；室温下4000rpm离心1分钟，用枪头吸掉800uL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮；将细菌涂在LB平板上(Rif+CHL+Kan）。28℃培养48-72h后形成单菌落。

挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3天。提取质粒后进行PCR鉴定阳性克隆。取灭过菌的离心管，加入鉴定好的菌液和预冷的50%甘油（终浓度15%），冻存于-70℃。

水稻遗传转化

水稻愈伤组织诱导：取开花后12-15天的水稻台北309未成熟穗子或健康谷粒，加入75%乙醇表面灭菌，用无菌ddH₂O冲洗一次，加入NaClO原液抽真空两次并置于摇床上摇40min；用无菌ddH₂O冲洗4次，在滤纸上小心挤出幼胚或挑取完整的种子，置于诱导培养基上，25-26℃黑暗培养15-20天。

愈伤继代培养：挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除芽和谷粒，转接到继代培养基上。25-26℃黑暗培养15-20天。

农杆菌准备：将含有表达载体和目标启动子的EHA105农杆菌菌种划LB板（LB+Kan50mg/L+CHL34mg/L+RIF50mg/L），两天后挑取单菌落涂LB板（LB+Kan50mg/L+CHL34mg/L+RIF50mg/L）全皿，28℃培养48小时备用，将菌洗到50ml液体的共培养基（NBM+As0.1mM）中，调OD₆₀₀=0.5。

农杆菌介导转化：挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白。将愈伤组织转移至调好OD值的菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。倒去菌液，无菌ddH₂O冲洗5次至液体不浑浊，置于灭过菌的滤纸上吸干水分，风干至愈伤表面发白。将愈伤组织转移到共培养基（NBM+As0.1mM）上，其上有用液体共培养基浸湿的滤纸，25-26℃下暗培养3天。

筛选培养：3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞和400mg/L羧变青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基（500mg/L头孢霉素+400mg/L羧变青霉素+50mg/L潮霉素）。

分化培养：两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基（500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素）上，置于光照培养箱中，培养条件为：25-26℃，14h光照培养，光强1000-1500lx，3-7天陆续有愈伤组织变绿。将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基（500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素）上，置于25-26℃，14h光照培养，光强1000-1500lx光照培养，每20天更换一次培养基。

生根培养：绿苗高约5-8cm时，转移到生根培养基（R）上，促进根的生长，置于25-26℃，14h光照培养，光强1000-1500lx光照培养。

炼苗、移栽：3-4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3-5天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。

烟草遗传转化

农杆菌感受态细胞制备、所使用载体、组织化学染色步骤与水稻遗传转化过程相同。取培养8周的烟草无菌苗叶片，避开主脉切成0.5cm×0.5cm大小的叶片，叶片正面向上于预培养基（MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA)上培养2天；外植体置于活化的GV3101农杆菌菌液中（OD600=0.4）侵染15min,期间不断震荡使菌液与叶片充分接触；用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，置于共培养基（MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA)上培养（暗培养）；共培养3天（肉眼观察到叶片边缘长出菌斑），将叶片用无菌水洗1-2次，无菌滤纸吸干转至分化培养基（MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+25mg/L Hyg+500mg/L Cef)上光照培养；待愈伤分化出不定芽，转至继代培养基（MS+0.5mg/L NAA+25mg/L Hyg+500mg/L Cef)上培养；不定芽长至3cm左右时，转至生根培养基（MS+25mg/L Hyg+500mg/L Cef)上进行生根培养。

实施例2植物转基因及分子鉴定

阳性植株的PCR鉴定：从新鲜叶片中提取微量总DNA。根据表达载体上潮霉素的编码序列信息设计1对引物，Hyg-F:5'-ACCTGCTGAAACCGAACTG-3'（SEQ NO:4），Hyg-R:5'-CTGCTCCATACAAGCCAACC-3'（SEQ NO:5），PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，循环30次；72℃后延伸10min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离。预期PCR产物片段长为527bp(图4)。

实施例3水稻基因启动子转基因水稻和烟草植株的GUS组织化学染色

为研究水稻Ospz4启动子的活性和所控制的GUS报告基因在转基因水稻中的表达模式，选取经PCR检测呈阳性的转基因水稻植株进行GUS活性分析。GUS活性的组织化学染色分析参考Jefferson的方法进行改良（附参考文献）。将待测水稻样品与含底物X-Gluc的染色反应液（0.2%triton X-100；50mM NaPO₄pH=7.2；2mM Ferrocyanide；2mM Ferricyanide；2mMX-Gluc）抽真空后，于37℃保温过夜后进行组织化学染色观察，叶片等绿色组织用75%乙醇脱色后观察。从每个植株上分别取叶片、茎、根、花、胚乳、成熟种子发出的芽等不同组织进行GUS组织化学染色分析，并分别选取未转化植株的相应器官作为阴性对照。结果显示，在Ospz4阳性转化植株的所检测的所有器官中都检测到了明显的GUS活性(图5)，从图中可见Ospz4阳性转化植株的所检测的所有器官都呈现很明显的蓝色，显示Ospz4启动子在水稻植株几乎所有器官中均能表达。说明Ospz4启动子可驱动下游基因在转基因水稻植株的根、茎、叶、花、胚乳和芽中表达，经组织化学染色初步分析，该启动子在各个器官均有较高表达。同时，转基因烟草组织化学染色结果表明，Ospz4启动子在转基因烟草的叶脉中检测到GUS活性(图6)，显色明显。

参考文献：

Jefferson R A.Assaying chimeric genes in plants:the GUS gene fusion system.Plant MolecularBiology Reporter,1987,5(4):387-405.