一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法

摘要

本发明涉及一种以银杏叶渣为原料进行混菌固态发酵生产蛋白饲料的方法。分别将热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行活化、扩增培养，得到四种液体菌种；将银杏叶渣干燥、粉碎后，加入一定量的水和氮源，混合、灭菌后作为固态发酵培养基；将四种液体菌种按一定比例接入固态发酵培养基，充分混匀，在温度28～30℃条件下，自然PH值下发酵72～120h，干燥后即得银杏叶渣蛋白饲料。该蛋白饲料中粗蛋白含量高，可达46%，营养成分全面，适口性好，能有效提高畜禽的生产性能和饲料转化率，并且制备方法工艺简便，成本低，可实现大规模生产。本发明还为林业加工废弃物银杏叶渣的利用提供了途径。

说明书

技术领域

本发明属于农林废弃物加工利用技术领域，特别是涉及一种以银杏叶渣为原料进行混菌固态发酵生产蛋白饲料的方法。

背景技术

随着我国畜牧业和饲料工业的快速发展，我国对饲料原料的需求量急增，使我国的饲料资源尤其是蛋白质资源更加紧缺，据统计到2012年，全国蛋白饲料可供量为0.22亿吨，需求量为0.66亿吨，可见我国蛋白饲料的供给量已经严重不足。一方面我国蛋白饲料资源缺乏，另一方面由于饲用抗生素的长期使用，现有的饲料营养价值大多较低以及不容易被动物消化吸收，导致饲料的安全性、品质和利用率都比较低。因此积极利用农林废弃物开发具有生物酶活性的植物蛋白饲料，对于弥补市场上蛋白饲料的不足和提高饲料的安全性和利用率具有极为重要的意义。 

银杏树是我国特有的珍贵树种，我国银杏资源丰富，占世界总量的80％以上。由于银杏叶具有多种生物活性物质，被广泛应用于医药、生物农药、保健食品和化妆品行业中。 银杏叶提取活性物后产生大量的银杏叶渣，每年大概有3万吨左右的银杏叶渣作为废弃物被扔掉或焚烧，不仅造成资源的严重浪费，而且会污染环境。银杏叶渣中含有丰富的蛋白质和氨基酸，含量达到30％以上，含有9种必需氨基酸，另外银杏叶渣中还含有丰富的多糖、VC、VE、胡萝卜素、矿物质和微量元素等。因此以银杏叶渣为原料制备菌体蛋白饲料，不仅可以变废为宝，使银杏叶资源走上绿色循环发展之路，而且为银杏叶资源的开发利用注入新的活力，具有广阔的市场发展前景。

菌体蛋白饲料的生物转化大都采用微生物单一菌株或组合菌株发酵，从目前的研究和应用来看，混合发酵的效果要比单菌种发酵的效果好。混合发酵利用了微生物种间协作、协同互生的特性，多个菌种之间可互相补偿其缺陷，共同生长。微生物发酵生产饲料的方法主要包括液态发酵和固态发酵两种，固态发酵具有液态发酵所不具有的优点，如废水废渣少，容易处理，能耗低，培养基原料多为天然基质或废渣，环境污染小，因此，现在在发酵饲料生产方面大多采用固态发酵的方式。

目前国内外仅有以银杏叶为原料制备生物饲料的专利报道，而关于银杏叶渣制备生物饲料的专利报道很少。如专利201210549464.9报道了以银杏叶为原料，采用单一菌种芽孢杆菌进行固态发酵制备生物饲料添加剂；专利200910031310.9报道了以银杏叶为原料，采用单一菌种产朊假丝酵母进行固态发酵制备生物饲料添加剂；专利200910031310.9报道了以银杏叶、食用菌废菌渣、豆粕为原料，采用单一菌种黑曲霉进行发酵制备生物饲料添加剂。这些专利均采用单一菌种进行发酵，制备得到的生物饲料存在蛋白含量低、营养成分单一、消化吸收差和适口性差等问题。在银杏叶渣制备生物饲料方面仅有专利201010295193.x报道了将银杏药渣、秸秆加水密封后直接发酵，该方法没有添加任何菌种直接发酵，制备得到的发酵饲料蛋白含量低、营养价值低，且该方法采用液态发酵，产生大量的废水，处理难、能耗高，且污染环境。

针对以上发明的不足，本发明提出以银杏叶渣为原料采用混菌固态发酵的方法生产蛋白饲料。该方法采用混合菌种发酵，制备得到的银杏叶渣蛋白饲料中不仅蛋白含量高，且含多种维生素、多种活性酶、多种氨基酸和多种微量元素，营养成分全面，饲料消化吸收好，适口性好；采用固态发酵的生产方式，废水废渣少，容易处理，能耗低，环境污染小。该发明利用银杏叶渣这一巨大的资源，发酵制备营养全面的蛋白饲料，不仅可变废为宝，使银杏叶走上绿色可循环发展的道路，且该方法将为银杏叶渣的开发应用提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以银杏叶渣为原料进行混菌固态发酵生产蛋白饲料的方法，该方法能耗低，环境污染小，绿色安全，操作简单，生产成本低，且制备得到的银杏叶渣蛋白饲料蛋白含量高，营养成分全面，饲料消化吸收好，适口性好，适合工业化生产。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的方法，具体步骤如下：

（1）  菌种培养

a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。

b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。

c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。

d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。

（2）制备固态发酵培养基

将银杏叶渣进行干燥、粉碎后，加入银杏叶渣重量2～4倍的水，然后加入银杏叶渣重量5～12%的氮源，混合均匀后，在120～125℃下蒸汽灭菌20～30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基。

（3）混菌固态发酵制备蛋白饲料

将上述热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种按一定菌种比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基重量的8～12%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28～30℃条件下，自然PH值下静止发酵72～120h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。

 所述的银杏叶渣是由3～6年生银杏幼叶经提取银杏黄酮后的叶渣进行风干后所得。

所述的氮源种类为尿素或硫酸铵。

所述的假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种的接入菌种比例为1～2：2：1～2：1。

所述的固态发酵制备得到的银杏叶渣蛋白饲料中粗蛋白含量为45～48%，乳酸含量为2.0～2.5%，粗纤维含量为6～8%。

本发明采用的发酵菌种为热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌四种菌种组成的复合菌种。分别对四种菌种进行了扩增培养制备液体菌种，具体制备方法如下：

a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。

b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。

c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。

d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。

本发明对发酵所用菌种种类进行了考察，分别进行了单一菌种发酵试验和复合菌种发酵试验。单一菌种发酵试验分别考察了热带假丝酵母、产朊假丝酵母、白地霉、米曲霉、黑曲霉、绿色木霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌不同菌种对发酵产物粗蛋白含量的影响；将单菌发酵试验中筛选出的粗蛋白含量较高的酵母菌、霉菌与植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行2 菌、3菌和 4 菌的复合发酵试验，测定复合发酵产物中粗蛋白含量。结果表明，单一菌种发酵产物中粗蛋白含量最高的 4 种菌种为热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽抱杆菌和植物乳杆菌；复合菌种发酵产物的粗蛋白含量要高于单一菌种的发酵产物，菌种组合为热带假丝酵母+米曲霉+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌的四菌组合发酵产物粗蛋白含量最高，因此，本发明采用的发酵菌种为热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌四种菌种组成的复合菌种。

本发明以银杏叶渣为原料，通过加入一定量的水和氮源制备固态发酵培养基。将银杏叶渣进行干燥、粉碎后，加入银杏叶渣重量2～4倍的水，然后加入银杏叶渣重量5～12%的氮源，混合均匀后，在120～125℃下蒸汽灭菌20～30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基，所述的氮源为尿素或硫酸铵。

水分是微生物发酵所必需的基本物质之一，每种微生物都具有最适宜其生长的水分含量，这是因为水是微生物细胞的重要组成部分，是微生物进行代谢活动的介质，同时还参与一部分生化反应。

本发明对固态发酵培养基的料水比进行了考察，料水比分别取1：1、1：2、1：3、1：4、1：5进行混菌固态发酵，测定发酵产物的粗蛋白含量，结果表明当料水比为1：2～1：4范围内，发酵产物中的粗蛋白含量均能达到45%以上，当料水比为1；5时，发酵产物中粗蛋白含量呈下降趋势。其中料水比为1：3时，发酵产物中的粗蛋白含量达到最高为48.13%。因此优选料水比为1：3。

     银杏叶渣其氮含量较低，并且组分多为不溶性的碳水化合物，由于发酵底物自身原因的限制，在试验和实际生产中如果不添加一定的氮源，很难满足微生物生长的需要，同时也无法达到生产蛋白饲料的要求，因此固态发酵培养基中需添加一定量的氮源。

 本发明对氮源种类和添加量进行了考察，分别选取尿素和硫酸铵作为培养基氮源，氮源添加量分别为3%、5%、8%、10%、12%，混菌固态发酵后测定产物的粗蛋白含量，结果表明，尿素对发酵产物粗蛋白含量的增幅高于硫酸铵。在尿素添加量为8%时，发酵产物中粗蛋白含量达到最高。因此优选氮源种类为尿素，氮源添加量为8%。

本发明采用混菌固态发酵制备银杏叶渣蛋白饲料。将热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种按一定菌种比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基的8～12%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28～30℃条件下，自然PH值下静止发酵72～120h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。所述的热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种的接入菌种比例为1～2：2：1～2：1。

本发明对复合菌种比例进行了考察，选择接种比例分别为 1∶1∶2：1、2∶2∶1：1、1∶2∶2：1、2∶1∶1：1、2∶1∶2：1、1∶2∶1：1，测定发酵产物的粗蛋白含量，结果表明，当米曲霉比例为2时，发酵产物的粗蛋白含量均能达到45%以上，其中热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的接种比例为2：2：1：1时，发酵产物中粗蛋白含量最高，达到47.85%。因此，优选的热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的最佳接种比例为 2∶2∶1：1。

本发明对复合菌种的接种量进行了考察，分别按 6%、8%、10%、12%、15%的接种量接入固体发酵培养基。结果表明当接种量为8～12%范围内，发酵产物中的粗蛋白含量均能达到45%以上，当接种量为15%时，发酵产物中粗蛋白含量呈下降趋势。其中接种量为10%时，发酵产物中粗蛋白含量最高，为48.38%，因此优选接种量为10%。

本发明对固态发酵时间进行了考察，选择发酵时间分别为24h、48h、72h、96h、120h，结果表明发酵时间为72～120h范围内，发酵产物中的粗蛋白含量均能达到45%以上，当发酵时间为72h时，发酵产物中粗蛋白含量达到最高为47.39%，继续增加发酵时间，发酵产物中蛋白含量保持平稳趋势。。因此优选发酵时间为72h。

本发明对制备的银杏叶渣蛋白饲料指标成分进行分析，分别测定其粗蛋白、乳酸和粗纤维含量，并与原料进行了比较。结果表明银杏叶渣蛋白饲料中粗蛋白含量为45～48%，乳酸含量为2.0～2.5%，粗纤维含量为6～8%。与原料相比，蛋白饲料的粗蛋白含量有了显著提高，粗纤维含量有了明显降低，另外发酵产物中增加了乳酸成分能增强动物的体液免疫和细胞免疫，另外还可以改善饲料的适口性。

本发明对银杏叶渣蛋白饲料进行了生长猪饲喂试验，将制备的银杏叶渣蛋白饲料完全替代基础饲粮中的菜籽粕，用于生长猪的饲喂，检验其对生长猪生产性能和饲料消化率的影响。

结果表明，与对照组（基础饲粮添加菜籽粕）相比，试验组（基础饲粮添加银杏叶渣蛋白饲料）的生长猪的平均日增重提高了23.61%，料重比降低了18.44%，饲料的CP消化率提高了15.38%，干物质消化率提高了10.45%。说明饲喂本发明所得的银杏叶渣蛋白饲料能有效提高生长猪的生产性能和饲料转化率，其可完全替代基础饲粮中的菜籽粕，用于生长猪的饲喂。

本发明的有益效果：

（1）本发明以林业资源加工废弃物银杏叶渣为原料，采用生物转化的方法制备蛋白饲料，不仅可以变废为宝，而且可为我国畜牧业提供安全、营养价值高的优质蛋白饲料。 

（2）本发明采用混合菌种进行发酵，与传统的单一菌种发酵相比，制备得到的银杏叶渣蛋白饲料中不仅蛋白含量高，且含多种维生素、多种活性酶、多种氨基酸和多种微量元素，营养成分全面，适口性好。

（3）本发明采用固态发酵的方法，废水废渣少，容易处理，能耗低，环境污染小，工艺操作简单，生产成本低，安全性高，适合工业化生产。

（4）本发明制备的银杏叶渣蛋白饲料能有效提高畜禽的生产性能和饲料转化率，具有很好的市场前景。

附图说明

图1  银杏叶渣混菌固态发酵制备蛋白饲料的工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步详细的描述，本发明不受此限制。

实施例1

菌种培养

a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。

b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。

c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。

d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。

本发明对发酵所用菌种种类进行了考察，分别进行了单一菌种发酵试验和复合菌种发酵试验。将混合均匀的银杏叶渣固态发酵培养基灭菌、冷却后，分别接入10%的热带假丝酵母、产朊假丝酵母、白地霉、米曲霉、黑曲霉、绿色木霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌,在30℃，自然pH值下静止发酵72h后,测定发酵产物中粗蛋白含量，结果见表1；将单菌发酵试验中筛选出的粗蛋白含量较高的酵母菌、霉菌与植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行 2 菌 （接种比例 1∶1）、3菌（接种比例 1∶1∶1）和 4 菌（接种比例 1∶1∶1∶l）的复合发酵试验，测定复合发酵产物中粗蛋白含量，结果见表2。

表1不同单菌对发酵产物粗蛋白含量的影响

菌种粗蛋白含量（%）空白9.23黑曲霉21.67米曲霉  32.55绿色木霉10.41白地霉13.29植物乳杆菌    27.97热带假丝酵母  28.22产朊假丝酵母16.05枯草芽孢杆菌   29.01

表2不同复合菌种组合对发酵产物粗蛋白含量的影响

菌种组合粗蛋白含量（%）米曲霉+热带假丝酵母34.86米曲霉+枯草芽孢杆菌32.29米曲霉+植物乳杆菌32.67米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌40.57米曲霉+热带假丝酵母+植物乳杆菌38.25米曲霉+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌35.91米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌45.26

从表1可以看出，单一菌种发酵产物中粗蛋白含量最高的 4 种菌种为热带假丝酵母 （28.22%）、米曲霉（32.55）、枯草芽抱杆菌（29.01%）和植物乳杆菌（27.97%）；从表2可以看出，菌种组合为热带假丝酵母+米曲霉+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌的四菌组合发酵产物粗蛋白含量最高，因此，本发明采用的发酵菌种为热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌四种菌种组成的复合菌种。

 实施例2

固态发酵培养基的制备

将银杏叶渣进行干燥、粉碎后，加入银杏叶渣重量2～4倍的水，然后加入银杏叶渣重量5～12%的氮源，混合均匀后，在120～125℃下蒸汽灭菌20～30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基。

 所述的银杏叶渣是由3～6年生银杏幼叶经提取银杏黄酮后的叶渣进行风干后所得。

所述的氮源为尿素或硫酸铵。

水分是微生物发酵所必需的基本物质之一，每种微生物都具有最适宜其生长的水分含量，这是因为水是微生物细胞的重要组成部分，是微生物进行代谢活动的介质，同时还参与一部分生化反应。

本发明对固态发酵培养基的料水比进行了考察，料水比分别取1：1、1：2、1：3、1：4、1：5进行混菌固态发酵，测定发酵产物的粗蛋白含量，结果见表3。从表3可以看出，当料水比为1：2～1：4范围内，发酵产物中的粗蛋白含量均能达到45%以上，当料水比为1；5时，发酵产物中粗蛋白含量呈下降趋势。其中料水比为1：3时，发酵产物中的粗蛋白含量达到最高为48.13%。因此优选料水比为1：3。

表3不同料水比对发酵产物粗蛋白含量的影响

料水比粗蛋白含量（%）1:139.141:245.481:348.131:445.141:535.46

     银杏叶渣其氮含量较低，并且组分多为不溶性的碳水化合物，由于发酵底物自身原因的限制，在试验和实际生产中如果不添加一定的氮源，很难满足微生物生长的需要，同时也无法达到生产蛋白饲料的要求，因此固态发酵培养基中需添加一定量的氮源。

 本发明对氮源种类和添加量进行了考察，分别选取尿素和硫酸铵作为培养基氮源，氮源添加量分别为3%、5%、8%、10%、12%，混菌固态发酵后测定产物的粗蛋白含量，结果见表4。由表4可以看出，尿素对发酵产物粗蛋白含量的增幅高于硫酸铵。在尿素添加量为8%时，发酵产物中粗蛋白含量达到最高。因此优选氮源种类为尿素，氮源添加量为8%。

表4不同氮源及添加量对发酵产物粗蛋白的影响

实施例3

固态发酵制备蛋白饲料

将热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种按一定菌种比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基的8～12%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28～30℃条件下，自然PH值下静止发酵72～120h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。

所述的热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、枯草芽孢杆菌液体菌种和植物乳杆菌液体菌种的接入菌种比例为1～2：2：1～2：1。

本发明对复合菌种比例进行了考察，向固体发酵培养基中分别按 10%的接种量接入不同比例的酵母菌、霉菌、枯草芽抱杆菌和植物乳杆菌的菌液，进行发酵试验，接种比例分别为 1∶1∶2：1、2∶2∶1：1、1∶2∶2：1、2∶1∶1：1、2∶1∶2：1、1∶2∶1：1，测定发酵产物的粗蛋白含量，结果见表5。由表5可知，当米曲霉比例为2时，发酵产物的粗蛋白含量均能达到45%以上，其中热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的接种比例为2：2：1：1时，发酵产物中粗蛋白含量最高，达到47.85%。因此，优选的热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的最佳接种比例为 2∶2∶1：1。

表5 不同菌种比例对发酵产物粗蛋白含量的影响

菌种比例粗蛋白含量（%）1∶1∶2：140.592∶2∶1：147.851∶2∶2：146.032∶1∶1：144.022∶1∶2：143.231∶2∶1：145.01

本发明对复合菌种的接种量进行了考察，将筛选出的复合菌种分别按 6%、8%、10%、12%、15%的接种量接入固体发酵培养基，灭菌，冷却后，在30℃，自然pH值下静止发酵72h后,发酵产物粗蛋白含量分别为34.59%、45.08%、48.38%、47.29%、37.21%。结果表明当接种量为8～12%范围内，发酵产物中的粗蛋白含量均能达到45%以上，当接种量为15%时，发酵产物中粗蛋白含量呈下降趋势。其中接种量为10%时，发酵产物中粗蛋白含量最高，为48.38%，因此优选接种量为10%。

本发明对固态发酵时间进行了考察，将筛选出的复合菌种分别按10%的接种量接入固体发酵培养基，灭菌，冷却后，在30℃，自然pH值下，分别静止发酵24h、48h、72h、96h、120h，发酵产物粗蛋白含量分别为25.34%、30.28%、47.39%、47.03%、46.28%。结果表明发酵时间为72～120h范围内，发酵产物中的粗蛋白含量均能达到45%以上，当发酵时间为72h时，发酵产物中粗蛋白含量达到最高为47.39%，继续增加发酵时间，发酵产物中蛋白含量保持平稳趋势。因此优选发酵时间为72h。

 

实施例4

银杏叶渣蛋白饲料指标成分分析

本发明对制备得到的银杏叶渣蛋白饲料中粗蛋白、乳酸和粗纤维含量分别进行了测定，并与原料进行了比较，结果见表6。结果表明银杏叶渣蛋白饲料中粗蛋白含量为45～48%，乳酸含量为2.0～2.5%，粗纤维含量为6～8%。与原料相比，蛋白饲料的粗蛋白含量有了显著提高，粗纤维含量有了明显降低，另外发酵产物中增加了乳酸成分能增强动物的体液免疫和细胞免疫，另外还可以改善饲料的适口性。

表6 发酵产物成分分析

发酵物粗蛋白（%）乳酸含量（%）粗纤维（%）发酵原料8.41017.24发酵产物45～482.0～2.56～8

实施例5

银杏叶渣蛋白饲料对生长猪饲喂效果试验

     本发明将制备的银杏叶渣蛋白饲料完全替代基础饲粮中的菜籽粕，用于生长猪的饲喂，检验其对生长猪生产性能和饲料消化率的影响。

     选取生长发育正常，日龄相近、体重25kg左右的生长猪24头，按饲养试验要求，并按初始猪的重量相同或相近原则随机分成2组，每组设2个重复，每个重复6头（公母各半）。一组为对照组（基础饲粮添加8%菜籽粕），另一组为试验组（基础饲粮添加8%银杏叶渣蛋白饲料）。正式试验期共28d，饲养规程均按常规管理与免疫，预试开始日的早晨空腹称重，正试期内，每两周和试验结束时，停喂24h后早晨空腹称重。试验期间每日观察、记录采食量，计算试验猪的平均采食量、日增重和料重比，结果见表7。另外在试验期的最后4天进行消化试验，利用指示剂法,收集猪粪便,按比例取样保存,测定粗蛋白和指示剂含量，计算饲料的表观消化率，结果见表8。

结果表明，与对照组相比，试验组的生长猪的平均日增重提高了23.61%，料重比降低了18.44%，饲料的CP消化率提高了15.38%，干物质消化率提高了10.45%。说明饲喂本发明所得的银杏叶渣蛋白饲料能有效提高生长猪的生产性能和饲料转化率，其可完全替代基础饲粮中的菜籽粕，用于生长猪的饲喂。

表7 银杏叶渣蛋白饲料对生长猪生产性能的影响

 表8 银杏叶渣蛋白饲料对饲料养分表观消化率的影响

项目CP消化率干物质消化率对照组（基础饲粮添加8%菜籽粕）74.8280.84试验组（基础饲粮添加8%银杏叶渣蛋白饲料）86.3389.29

实施例6：

银杏叶渣蛋白饲料的制备

（1）  菌种培养

a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。

b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。

c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。

d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。

（2）制备固态发酵培养基

取银杏叶渣1kg，干燥、粉碎后，加入2000mL的水，然后加入80g的尿素，混合均匀后，在120℃下蒸汽灭菌30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基。

（3）混菌固态发酵制备蛋白饲料

将上述热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、植物乳杆菌液体菌种和枯草芽孢杆菌液体菌种按2：2：1：1的比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基重量的12%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28℃条件下，自然PH值下静止发酵72h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。经测定其粗蛋白含量为46.78%，粗纤维含量为6.06%，乳酸含量为2.45%。

 实施例7：

银杏叶渣蛋白饲料的制备

（1）  菌种培养

a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。

b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。

c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。

d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。

（2）制备固态发酵培养基

取银杏叶渣1kg，干燥、粉碎后，加入3500mL的水，然后加入50g的尿素，混合均匀后，在125℃下蒸汽灭菌30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基。

（3）混菌固态发酵制备蛋白饲料

将上述热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、植物乳杆菌液体菌种和枯草芽孢杆菌液体菌种按1：2：2：1的比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基重量的10%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28℃条件下，自然PH值下静止发酵86h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。经测定其粗蛋白含量为48.24%，粗纤维含量为7.05%，乳酸含量为2.51%。

 实施例8：

银杏叶渣蛋白饲料的制备

（1）  菌种培养

a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。

b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。

c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。

d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。

（2）制备固态发酵培养基

取银杏叶渣1kg，干燥、粉碎后，加入4000mL的水，然后加入100g的硫酸铵，混合均匀后，在125℃下蒸汽灭菌30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基。

（3）混菌固态发酵制备蛋白饲料

将上述热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、植物乳杆菌液体菌种和枯草芽孢杆菌液体菌种按1：2：1：1的比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基重量的9%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28℃条件下，自然PH值下静止发酵110h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。经测定其粗蛋白含量为45.92%，粗纤维含量为8.02%，乳酸含量为2.02%。

 实施例9：

银杏叶渣蛋白饲料的制备

（1）  菌种培养

a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。

b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。

c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。

d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。

（2）制备固态发酵培养基

取银杏叶渣1kg，干燥、粉碎后，加入3200mL的水，然后加入90g的尿素，混合均匀后，在120℃下蒸汽灭菌30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基。

（3）混菌固态发酵制备蛋白饲料

将上述热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、植物乳杆菌液体菌种和枯草芽孢杆菌液体菌种按2：2：1：1的比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基重量的10%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28℃条件下，自然PH值下静止发酵96h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。经测定其粗蛋白含量为47.08%，粗纤维含量为7.76%，乳酸含量为2.12%。

 实施例10：

银杏叶渣蛋白饲料的制备

（1）  菌种培养

a.热带假丝酵母菌的扩增培养：将热带假丝酵母活化后接种到装有5mL麦芽汁培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到热带假丝酵母液体菌种。

b.米曲霉菌的扩增培养：将米曲霉活化后接种到装有5mLCzapek’s液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLCzapek’s液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到米曲霉液体菌种。

c.枯草芽孢杆菌的扩增培养：将枯草芽孢杆菌活化后接种到装有5mLBPY液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLBPY液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到枯草芽孢杆菌液体菌种。

d.植物乳杆菌的扩增培养：将植物乳杆菌活化后接种到装有5mLMRS液体培养基的大试管中，28℃培养24h，然后以5%的接种量接种于装有500mLMRS液体培养基的三角瓶中，28℃恒温摇床（180r/min）培养36h，得到植物乳杆菌液体菌种。

（2）制备固态发酵培养基

取银杏叶渣1kg，干燥、粉碎后，加入3600mL的水，然后加入120g的硫酸铵，混合均匀后，在125℃下蒸汽灭菌30min，冷却后得到银杏叶渣固态发酵培养基。

（3）混菌固态发酵制备蛋白饲料

将上述热带假丝酵母液体菌种、米曲霉液体菌种、植物乳杆菌液体菌种和枯草芽孢杆菌液体菌种按1：2：2：1的比例分别接入银杏叶渣固态发酵培养基中，四种液体菌种的接种总量为固态发酵培养基重量的8%，接种完毕后充分混匀，然后在温度28℃条件下，自然PH值下静止发酵120h，最后将发酵产物在50℃条件下烘干至恒重，即得银杏叶渣蛋白饲料。经测定其粗蛋白含量为46.18%，粗纤维含量为7.46%，乳酸含量为2.35%。