筛选与皮肤老化有关的基因和防止皮肤老化的材料的方法

摘要

本发明涉及一种筛选皮肤老化特异性基因的方法以及通过控制基因表达筛选抗老化材料的方法。本发明能够提供一种新材料，所述新材料通过获得与皮肤老化有关的新靶基因和控制基因的表达而具有防止皮肤老化和治疗皮肤疾病的功效。

说明书

技术领域

本发明涉及筛选表现出与皮肤老化有关的特性变化的基因的方法以及 通过控制这些基因的表达筛选防止皮肤老化的物质的方法。

背景技术

到目前为止，主要在皮肤真皮层（dermal layer）的变化方面进行了关于 皮肤老化的研究，且主要集中于调节胶原蛋白和胶原酶MMP（基质金属蛋 白酶，matrix metalloproteinase）的生物合成。而且，抗老化化妆品中的唯一 活性成分是视黄醇，众所周知，该活性成分能够有效地促进胶原蛋白的生物 合成。

然而，通过简单的促进胶原蛋白合成不能充分实现皮肤老化的预防，而 且，皮肤老化的症状和相关因素随着导致老化的原因不同而不同。因此，为 了下一代功能性化妆品的发展，需要研究全面考虑了各种不同因素的新方 法。另外，必需通过综合分析与皮肤老化有关的特性基因的变化以确定引起 皮肤老化的原因和理解皮肤老化的机理，从而开发预防和治疗皮肤老化的技 术，控制与皮肤老化有关的靶基因的表达。

发明内容

技术问题

相应地，为获得与防止老化有关的新的靶基因，本发明的发明人利用基 因芯片，通过全面筛选显示出与皮肤老化有关的特性变化的基因而进行了大 量的尝试。

因此，本发明的目的是提供新的与防止老化有关的靶基因。

本发明的另一个目的是提供筛选新物质的方法，所述物质通过控制以上 基因的表达而表现出抑制皮肤老化和治疗皮肤疾病的效果。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了一种筛选与皮肤老化有关的基因的方 法，该方法包括以下步骤：1）从皮肤组织中提取总RNA，并将提取到的RNA 进行微阵列分析；2）利用生物信息学技术（bioinformatics technique）分析 随老化而改变的基因；3）选择与皮肤老化有关的候选基因；以及4）通过逆 转录-聚合酶链反应（RT-PCR）确认所述候选基因。

本发明还提供了一种用于筛选防止皮肤老化的物质的方法，该方法包括 以下步骤：1）用控制细胞内基因表达的候选物质处理皮肤细胞样品；2）将 皮肤细胞样品暴露于具有皮肤老化因子的环境中，以诱导细胞内基因的表 达；以及3）测试步骤2）中皮肤老化因子诱导的细胞内基因的表达。

有益效果

根据本发明的筛选方法，可以根据引起皮肤老化的不同原因而筛选与皮 肤老化有关的基因。此外，不仅可以研究与UV辐射引起的光老化有关的基 因，而且还可以研究引起与更年期相关的自然老化（intrinsic aging）的基因， 而且根据靶基因的不同，可以开发差异化产品（differentiated products）。因 此，可以从根本上防止皮肤老化。

附图说明

图1显示了对年轻人和老年人的皮肤中甘丙肽前体肽源（galanin  prepropeptide）进行的微阵列分析和定量RT-PCR的结果。

图2和3显示了通过siRNA方法抑制甘丙肽前体肽源的表达，然后测 试抗老化标记（MMP）和炎症因子的表达中UV诱导的变化，以分析甘丙肽 前体肽源的功能而获得的结果。

图4显示了甘丙肽前体肽源和胶原蛋白的表达之间的关系，应用与图2 和3所示的相似方法，通过抑制甘丙肽前体肽源的表达而确定的该关系。

图5显示了对年轻人和老年人的皮肤中骨甘氨酸（osteoglycin）进行的 微阵列分析和定量RT-PCR的结果。

图6显示了甘丙肽前体肽源和胶原蛋白的表达之间的关系，通过抑制骨 甘氨酸的表达而确定的该关系。

图7显示了16个脂溢性角化病中表达增强的基因。

具体实施方式

尽管皮肤老化是由不同因素引起的，但是将着重从以下方面对本发明进 行描述。

1、由于时间推移而引起的自然老化

2、由激素引起的更年期老化

3、脂溢性角化病

本发明提供了一种筛选与皮肤老化有关的基因的方法，该方法包括以下 步骤：1）从皮肤组织中提取总RNA，并将提取到的RNA进行微阵列 （microarray）分析；2）利用生物信息学技术分析随老化而改变的基因；3） 选择与皮肤老化有关的候选基因；以及4）通过逆转录-聚合酶链反应 （RT-PCR）确认所述候选基因。

参与或者不参与皮肤老化的基因、男性或女性中表达增强或减弱的基 因，随引起皮肤老化的原因不同而不同，而且表达改变的基因可被确定为与 皮肤老化有关的基因。因此，可以挑选这些基因作为与皮肤老化有关的候选 基因。

在本发明中，通过筛选方法发现：甘丙肽前体肽源、Wnt3、TNS4、骨 甘氨酸等可以作为与皮肤老化有关的新的靶基因，但是，本发明的范围并不 局限于此。

本发明还提供了一种筛选物质的方法，所述物质通过控制以上靶基因的 表达而具有防止皮肤老化的能力。

具有防止皮肤老化作用的候选物质可以通过使用细胞搜索系统搜索，然 后利用志愿者的皮肤评估其对人体的作用而进行筛选。

本发明还提供了一种用于筛选防止皮肤老化的物质的方法，该方法包括 以下步骤：1）用控制细胞内基因表达的候选物质处理皮肤细胞样品；2）将 皮肤细胞样品暴露于具有皮肤老化因子的环境中，以诱导细胞内基因的表 达；以及3）测试步骤2）中皮肤老化因子诱导的细胞内基因的表达。

关于本发明所述方法的步骤1）中的细胞样品，可以使用任何细胞，只 要将它们置于导致皮肤老化的环境中时，能诱导与皮肤老化有关的基因的表 达即可。具有皮肤老化因子的环境的实例包括但并不限于各种引起皮肤老化 的因子，包括：紫外线、热和激素。

在本发明所述方法的步骤3）中，皮肤老化因子诱导的细胞内基因的表 达可以通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行测试。

根据以上所述的方法，我们可以找到与皮肤老化有关的新的靶基因，并 开发新的和差异化产品，根据皮肤老化有关的基因的不同原因，所述产品作 用于与皮肤老化有关的基因。

实施例

下文中，将结合实施例进一步详细地描述本发明。但是，应当理解的是， 这些实施例是以说明为目的的，在不脱离本发明范围和精神的情况下，各种 修改、添加和替换都是被允许的。

测试实施例1：自然老化模型的微阵列分析

为了筛选与由于时间推移而引起的自然老化有关的基因，在人皮肤上进 行测试。

挑选18-25岁的年轻人（4男4女）和78-82岁的老年人（4男4女）作 为受试者，从每个受试者身上通过4-8mm的穿刺活检（punch biopsy）采集 4-6个臀部皮肤样品。

从采集的皮肤样品中提取总RNA并进行微阵列分析（Affymetrix  GeneChip Human HG-U133 Plus2.0），利用生物信息学技术（DAVID  Bioinformatics Resources/Gene spring）分析随年龄而改变的基因。

根据分析结果选择与皮肤老化有关的候选基因，并通过定量RT-PCR的 结果进行确认。

下表1显示了在男性或女性中表达增强或减弱的基因数。

表1

（P<=0.05，2倍变换U133-2探针（probes），无FDR）

因为没有在男性中增强、女性中减弱的探针，因此，共同基因中不存在 在男性和女性之间具有差异的探针。

下表2显示了在老年男性和老男女性皮肤中表达都增强的基因。

表2

下表3显示了在老年男性和老男女性皮肤中表达都减弱的基因。

表3

下表4显示了老年男性皮肤中表达增强的基因。

表4

下表5显示了老年男性皮肤中表达减弱的基因。

表5

下表6显示了老年女性皮肤中表达增强的基因。

表6

下表7显示了老年女性皮肤中表达减弱的基因。

表7

基因名称 基因符号 胶原蛋白，I型，α1（collagen,type I,alpha1） COL1A1 蛛毒素受体3（Latrophilin3） LPHN3 GREB1蛋白（GREB1protein） GREB1 骨甘氨酸（osteoglycin） OGN

在本发明中，甘丙肽前体肽源（GAL）在老年男性和老年女性皮肤中的 表达都减弱，被选为与皮肤老化有关的候选基因。在神经系统的发育过程中， 甘丙肽前体肽源在神经细胞和非神经细胞中产生，并且GAL受体（GALRl、 GALR2和GALR3）是生物功能方面重要的因素，所述生物功能包括：免疫、 细胞增殖、炎症反应、对药物和压力的反应、胰岛素分泌、生长激素分泌等。

在本发明中，对从年轻人和老年人的皮肤上采集的甘丙肽前体肽源进行 微阵列分析和定量RT-PCR，分析的结果如图1所示。

如图1所示，微阵列分析的结果与定量RT-PCR的结果一致。因此，甘 丙肽前体肽源被确认为候选基因。

甘丙肽前体肽源的功能通过siRNA方法进行分析。

具体地，以1.25×10⁶个细胞/皿的密度，将HaCaT细胞置于60mm细胞 培养皿中，培养皿中含有含10%血清的DMEM培养基，然后在37℃、5%CO₂培养箱中将细胞培养至融合量（confluency）达80%左右。用siRNA处理细 胞并孵育，然后除去培养基。然后，向细胞中加入1mL的Trizol试剂 （Invitrogen），并根据RNA分离方法（Invitrogen）从细胞中分离出RNA。 用UV检测器（HEWLETT PACKARD）在260nm处定量RNA并进行RT-PCR （逆转录-聚合酶链反应）。对每个样品进行基因分析，对互补基因36B4进 行归一化（normalization）。另外，根据制造商的方法（Amersharm）对MMP-1 和MMP-9进行ELISA分析。

测试的结果如图2和图3所示。

从图2可以看出，当皮肤细胞受到UV辐射破坏时，甘丙肽前体肽源、 MMP-1和MMP-9的表达均增强。

从图3可以看出，UV辐射增强了甘丙肽前体肽源、COX-1、IL-6和IL-1b 的表达。

另外，甘丙肽前体肽源和胶原蛋白的表达之间的关系利用与上文描述方 法相似的方法进行检测。

具体地，以1.25×10⁶个细胞/皿的密度，将HaCaT细胞置于60mm细胞 培养皿中，培养皿中含有含10%血清的DMEM培养基，然后在37℃、5%CO₂培养箱中将细胞培养至融合量达80%左右。用siRNA处理细胞并孵育，然 后除去培养基。然后，向细胞中加入1mL的Trizol试剂（Invitrogen），并根 据RNA分离方法（Invitrogen）从细胞中分离出RNA。用UV检测器 （HEWLETT PACKARD）在260nm处定量RNA并进行RT-PCR（逆转录- 聚合酶链反应）。对每个样品进行基因分析，对互补基因36B4进行归一化。 另外，根据制造商的方法（Takara）对原胶原进行ELISA分析。

测试的结果如图4所示。

从图4可以看出，当甘丙肽前体肽源的表达不充分时，胶原蛋白的表达 也减弱。

测试实施例2：更年期老化模型的微阵列分析

在本测试实施例中，利用了测试实施例1中的结果。在本发明中，只在 老年女性皮肤细胞中表达减弱的骨甘氨酸基因被选择为候选基因。骨甘氨酸 基因参与胶原蛋白的合成，骨甘氨酸表达减弱时胶原蛋白的合成也减少。另 外，关于骨甘氨酸，目前的研究主要基于角膜的再生和退行性关节炎方面， 且骨甘氨酸涉及正常的胶原原纤维生成、细胞生长、细胞分化和受伤组织的 恢复。

在本发明中，对从年轻女性和老年女性的皮肤上采集的骨甘氨酸进行微 阵列分析和定量RT-PCR，分析的结果如图5所示。

从图5可以看出，微阵列分析的结果与定量RT-PCR的结果一致。因此， 骨甘氨酸被确认为候选基因。

骨甘氨酸的功能通过siRNA方法进行分析。

具体地，以1.25×10⁶个细胞/皿的密度，将HaCaT细胞置于60mm细胞 培养皿中，培养皿中含有含10%血清的DMEM培养基，然后在37℃、5%CO₂ 培养箱中将细胞培养至融合量达80%左右。用siRNA处理细胞并孵育，然 后除去培养基。然后，向细胞中加入1mL的Trizol试剂（Invitrogen），并根 据RNA分离方法（Invitrogen）从细胞中分离出RNA。用UV检测器 （HEWLETT PACKARD）在260nm处定量RNA并进行RT-PCR（逆转录- 聚合酶链反应）。对每个样品进行基因分析，对互补基因36B4进行归一化。 另外，根据制造商的方法（Amersharm）对骨甘氨酸进行ELISA分析。

测试的结果如图6所示。

从图6可以看出，在不存在骨甘氨酸时，胶原蛋白的形成受到抑制。

测试实施例3：脂溢性角化病模型的微阵列分析

在脂溢性角化病皮肤和正常皮肤上进行微阵列分析，以对比其中的基因 的表达。

挑选78-82岁的患有脂溢性角化病的老年人（4男4女）作为受试者， 从每个受试者身上通过4-8mm的穿刺活检采集4-6个患有脂溢性角化病的皮 肤样品和4-6个不患有脂溢性角化病的皮肤样品。

从采集的皮肤样品中提取总RNA并进行微阵列分析（Affymetrix  GeneChip Human HG-U133Plus2.0），利用生物信息学技术（DAVID  Bioinformatics Resources/Gene spring）分析随年龄而改变的基因。

通过基因分析确定了16个脂溢性角化病中表达增强的基因，且如图7 所示。

根据上文所述，与皮肤老化有关的基因随导致皮肤老化的原因的不同而 不同。因此，通过筛选能够控制这些基因表达的物质可以开发有效防止皮肤 老化的差异化产品。