一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶

摘要

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶，尤其涉及一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶，属于酶蛋白工程技术领域。该酶是通过定向进化天然β-半乳糖苷酶获得的突变酶，具有新的转糖基受体底物特异性，能对天然酶无法糖基化的白藜芦醇分子进行糖基化，可作为半乳糖基化修饰的工具酶，在酚类化合物加工及药物分子修饰等方面应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶，属于酶蛋白工程技术领域。

技术背景

化学法和酶法是目前进行糖基化修饰、糖苷合成的两大方法。糖类分子上多个可以反应 的羟基，使得化学法糖基化必须进行复杂的基团保护及糖苷合成后的去保护，才能在立体构 象和区域位置上特异性合成糖苷键，如此繁琐的步骤大大限制了其工业化合成糖苷的实用性。 相比而言，酶法糖基化具有立体选择性和区域选择性，步骤简单，环境友好。目前有两类酶 可用于糖苷合成，即糖基转移酶(glycosyltransferase;EC2.4)和糖苷水解酶(简称糖苷酶 glycosidase;EC3.2.1)。与糖基转移酶相比，糖苷酶较易获得、价格低，而且不需要糖基转移 酶所用的贵重的核苷酸活化或磷酸长萜醇活化形式的糖基供体，所以工业化的实用性优于糖 基转移酶。

酚类化合物具有非常重要的药理学活性，其糖基化修饰意义重大，但由于酚类化合物苯 环羟基亲核性较低，天然糖苷酶以酚类化合物为受体进行糖基化修饰难度较大，多羟基酚类 的酶法修饰尤其困难。目前国际上仅报道有来源于黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的α- 淀粉酶(EC3.2.1.1)、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)能对芳香环羟基进行α-葡萄糖基化(糖基供体为麦芽糖)，改善化 合物水溶性和气味等，转糖基受体非常有限，仅报道有对苯二酚、儿茶酚和子丁香酚。其他 糖基化修饰即半乳糖基修饰仅有一例报道，采用的酶源为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces  lactis)的β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)，糖基化受体仅局限于对苯二酚。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶。

一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的能糖 基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶来源于GenBank登录号为ACE06986.1的β-半乳糖苷酶，通过定 向进化获得氨基酸和转糖基性质的改变。

一种编码能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种重组载体，在表达载体中插入了上述编码能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶的基因。

优选的，所述表达载体为pBAD/his表达载体。

一种重组细胞，含有上述表达载体。

优选的，所述的重组细胞通过将上述表达载体转化感受态大肠杆菌LGM194后获得。

上述能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶的制备方法：

人工合成GenBank登录号为EU734748.1的β-半乳糖苷酶基因序列(编码蛋白GenBank 登录号为ACE06986.1)，采用易错PCR进行随机突变，突变后的PCR产物连接到pBAD/his 表达质粒上，转化大肠杆菌LGM194，筛选并获得能糖基化白藜芦醇的重组子，突变酶经测 序获得具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。按照pBAD/his 表达系统说明书制备能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶。

上述能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶在糖基化白藜芦醇中的应用，步骤如下：

（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，丙酮配制的白藜芦醇浓度为0.05M～ 0.2M，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；

（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应， 10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；

（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得白藜芦醇糖苷化合物。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸 钾缓冲溶液；根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸 钾缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的分离采用制备型薄层层析板分离，型号Silica gel 60F254(Merck,Germany)。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的干燥为冷冻干燥。

根据本发明进一步优选的，所述步骤（3）中还包括分离时的薄层层析检测，合并迁移距 离相同的产物的步骤。

上述薄层层析检测的步骤如下：

薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。

上述展层剂由乙腈和水按体积比85：15混合制得；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和 浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。

有益效果

本发明提供了一种能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶，该酶是通过定向进化天然β-半乳 糖苷酶获得的突变酶，具有新的转糖基受体底物特异性，能对天然酶无法糖基化的白藜芦醇 分子进行糖基化，拓宽了转糖基受体范围，可作为半乳糖基化修饰的工具酶，在酚类化合物 加工及药物分子修饰等方面应用前景广阔。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

pBAD/his表达质粒购自Invitrogen公司；

大肠杆菌LMG194购自Invitrogen公司。

实施例1：能糖基化白藜芦醇的β-半乳糖苷酶基因的获得及酶蛋白制备

人工合成GenBank登录号为EU734748.1的β-半乳糖苷酶基因序列(编码蛋白GenBank登录 号为ACE06986.1)，采用易错PCR进行随机突变：

正向引物：

5’-GCATGAGCAATAAGTTAGTAAAAG-3’(含NheⅠ酶切位点)  SEQ ID NO.3 反向引物：

5’-GCTTATTTTAGTAAAAGGGGCTG-3(含BglⅡ酶切位点)  SEQ ID NO.4

PCR反应体系(50μL)：终浓度为10ng/μL的模板、1μM的引物、0.2mM dATP、dGTP，1mM dTTP、dCTP，5mM MgCl₂，2.5U rTaq DNA 聚合酶，1× PCR缓冲液。

PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；反应30个循环（95℃变性30秒，55℃退火30 秒，72℃延伸3分钟）；72℃延伸10分钟。

将易错PCR产物双酶切后，连接到经过同样双酶切的pBAD/his表达质粒上，转化大肠 杆菌LMG194，涂布含X-gal的RM培养基，挑取蓝色菌落分别接种于1ml的RM液体培养 基，培养16小时，离心收集菌细胞，向其中加20μl乳糖终浓度为0.2M、白藜芦醇终浓度为 0.1M的底物(用pH7.0、50mM磷酸钾缓冲液配制)，45℃反应8小时，将反应液稀释5倍， 离心取上清液进行薄层层析分析。

从上述反应中筛选到具有转糖基新产物的重组子,提取重组质粒，突变酶经测序，核苷 酸序列如SEQ ID NO.2所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

按照pBAD/his表达系统说明书制备β-半乳糖苷酶，考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量。

上述RM培养基配方为：1×M9盐（磷酸氢二纳6g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、 氯化铵1g/L）、酪蛋白2%、葡萄糖0.2%、氯化镁1mM、维生素B11mg/ml。固体培养基中 加入1.5%琼脂粉。

上述薄层层析检测的步骤如下：

薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。

上述展层剂由乙腈和水按体积比85：15混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和 浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。

实施例2：β-半乳糖苷酶糖基化白藜芦醇

用pH7.0、50mM磷酸钾缓冲液配制乳糖终浓度为0.2M，丙酮配制的白藜芦醇终浓度为 0.1M，酶的添加量为4μg/mL，反应体系50mL。在45℃反应45分钟后，100℃煮沸5分钟， 终止反应。

将煮沸后的反应液12000转/分钟离心20分钟，吸取上清液，在制备薄层层析板(PLC Silica  gel60F254,Merck)点样展层。展层结束后，在薄层层析板上每隔10cm取1cm宽的条形小板 显色，判定目标糖类在层析板上的位置。然后刮取层析板未显色区域含目标糖类的硅胶粉末， 将其重新溶解于水中，离心取上清，冷冻干燥后制成粉末，即为白藜芦醇半乳糖苷。

取上述白藜芦醇半乳糖苷用水稀释为质量百分比为1%的溶液，进行质谱分析，所用仪器 为岛津LCMS-IT-TOF质谱仪（日本），目标产物的特征分子离子峰[M-H]-为m/z389.11，判断 产物分子量为390，证实为白藜芦醇半乳糖苷。

上述薄层层析检测的步骤如实施例1所述。