人miR-26b在制备改善胰岛素敏感性药物中的应用

摘要

本发明属于基因工程领域，公开了人miR-26b在制备改善胰岛素敏感性药物中的应用。本发明提出了人miR-26b在制备提高脂肪组织胰岛素敏感性和/或促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物中的应用的技术方案。本发明检测了在人前体脂肪细胞中过表达miR-26b对成熟脂肪细胞葡萄糖摄取功能的影响，显示人miR‐26b能改善脂肪细胞胰岛素敏感性，促进脂肪细胞葡萄糖的摄取，可用于制备提高脂肪组织胰岛素敏感性和/或促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物，也可用于制备治疗代谢综合症的药物。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及人miR-26b在制备改善胰岛素敏感性药物中的应 用。

背景技术

代谢综合征是一组复杂的代谢紊乱症候群，是多种代谢成分异常聚集的病理状态， 其集簇发生可能与胰岛素抵抗有关，是导致糖尿病、心脑血管疾病的危险因素，目前已 成为心内科和内分泌科医师共同关注的热点。

代谢综合征的核心是胰岛素抵抗。从普通意义上来说，胰岛素抵抗即胰岛素促进葡 萄糖利用能力的下降。由于葡萄糖利用减少引起血糖水平升高，继而胰岛素代偿性增多， 表现为高胰岛素血症。胰岛素抵抗会引起一系列的后果，对重要器官产生损害，胰腺也 是胰岛素抵抗受累的主要器官。为了代偿对胰岛素需求增加，胰岛素分泌也相应增加。 在这种应激状态下，存在糖尿病遗传易感因素的个体胰腺β细胞的凋亡速度就会加快， 非常容易出现高血糖，发展为临床糖尿病。胰岛素抵抗同时启动了胰岛细胞上的一系列 炎症反应。高糖毒性和脂毒性都对β细胞造成明显的损害。胰岛素抵抗还会造成全身性 的影响。胰岛素抵抗会启动一系列炎症反应，胰岛素抵抗个体其炎症因子标记物，如C 反应蛋白和细胞因子白介素6水平会明显升高。胰岛素抵抗还通过对内皮功能的损害， 加速动脉粥样硬化的进程。胰岛素抵抗个体的内皮功能障碍表现为粘附因子增多、平滑 肌细胞增生以及血管扩张功能下降，这一系列改变是促进动脉粥样硬化形成的重要因 素。

鉴于上述情况，如何改善代谢综合征人群的胰岛素敏感性，减轻胰岛素抵抗显得尤 为重要，脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞，其对葡萄糖摄取障碍是胰岛素抵抗产生 的重要因素。因此，从脂肪细胞细胞分化过程中筛选出与胰岛素抵抗相关miRNA并作 为改善胰岛素敏感性的靶点已成为研究热点之一。

miR-26b是我们采用微流体芯片技术检测人原代脂肪前体细胞及诱导分化的成熟脂 肪细胞miRNA表达谱时发现的一条高表达于成熟脂肪细胞的miRNA，该miRNA位于 人染色体2q35,CTDSP1基因的第4内含子，其成熟序列“UUCAAGUAAUUCA GGAUAGGU”在物种间高度保守。但该miRNA与胰岛素敏感性之间的关系如何尚未 知晓。

发明内容

本发明的目的是提供人miR-26b在代谢综合征制备改善脂肪细胞胰岛素敏感性药 物中的应用。

本发明另一个目的是提供人miR-26b在制备治疗代谢综合症的药物中的应用。

发明人检测了人miR-26b过表达对成熟脂肪细胞葡萄糖摄取功能的影响。结果发 现，脂肪细胞在没有胰岛素作用的基础状态下对葡萄糖仅有较低水平的摄取，人miR-26b 过表达不仅显著提高成熟脂肪细胞在基础状态下的葡萄糖摄取量，也能显著提高胰岛素 刺激状态下成熟脂肪细胞的葡萄糖摄取，提示miR-26b与胰岛素抵抗密切相关，可用于 研发改善胰岛素敏感性药物，故提出人miR-26b在制备提高代谢综合征人群脂肪组织胰 岛素敏感性和/或促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物中的应用的技术方案。由于代谢综合征 的核心是胰岛素抵抗，因此，人miR-26b也可以在制备治疗代谢综合症的药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明检测了人miR-26b过表达对成熟脂肪细胞葡萄糖摄取功能的影响，显示人 miR-26b能改善脂肪细胞胰岛素敏感性，促进脂肪细胞葡萄糖的摄取，可用于制备提高 脂肪组织胰岛素敏感性和/或促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物，也可用于制备治疗代谢综 合症的药物。

附图说明

图1：pGLV-H1-GFP/Puro载体图谱、插入位点及人miR-26b过表达慢病毒载体酶 切、测序鉴定结果。

图2：人miR-26b过表达慢病毒感染人脂肪前体细胞株的鉴定。

图3：人miR-26b过表达对成熟脂肪细胞葡萄糖摄取功能的影响（*、#与 pGLV-H1-GFP/Puro相比P<0.05，其中：□代表感染pGLV-H1-GFP/Puro慢病毒的人脂肪 细胞，■代表感染pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro慢病毒的人脂肪细胞）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

1 材料和方法

1.1 试验材料：人前体脂肪细胞株（Human Preadipocytes-visceral，HPA-v）购自美 国Sciencell公司。本实验所需的pGLV-H1-GFP/Puro质粒购自上海吉玛公司，包装质粒 Pcgvp、Rev、Vsvg购自美国Allele Biotech & Pharmaceuticals公司； pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro慢病毒载体由本实验小组自行构建；DNA、RNA抽提试剂 盒购自德国Qiagen公司，miRNA逆转录试剂盒、miRNA检测试剂盒、TanMan基因表 达mixⅡ购自美国ABI公司，TaKaRa LA TaqDNA Polymerase Hot-Start Version PCR试 剂盒购自日本Takara公司，脂肪细胞专有培养基7211购自美国Sciencell公司，限制性 内切酶、T4连接酶购自美国NEB公司，引物由美国Invitrogen公司合成， 2-deoxy-D-3[H]Glucose购自美国Amersham公司。

1.2 实验方法：

（一）人miR-26b minigene的扩增及miR-26b慢病毒表达载体 （pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro）构建

（1）.DNA提取：按照以下步骤提取基因组DNA（德国Qiagen公司QIAamp DNA  Mini Kit）

1)取4ml离心管一只，加入600μl核裂解液，冰上冷却。

2)加入10-20mg解冻的人脂肪组织，匀浆机匀浆10秒。将裂解物移至1.5ml离心 管中。65℃孵育30分钟。

3)待样品达到室温后，加入200μl蛋白沉淀液，涡旋震荡20秒，置于冰上冷却5 分钟。

4)4）13,000×g离心4分钟，可见白色沉淀。将上清移至一新离心管中。

5)加入600μl异丙醇，轻轻颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成。13,000×g离 心1分钟，弃去上清。

6)加入600μl室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次，13,000×g离心1分钟，小心 弃去上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10-15分钟。

7)向离心管中加入50μl双蒸水，65℃孵育1小时，以充分溶解DNA，4℃保存， 得基因组DNA。

（2）人miR-26b minigene的扩增

（2.1）通过miRBase数据库获得人miR-26b的前体pre-miRNA-26b序列；在NCBI blast 中比对查找其所在的基因组序列，根据引物设计规则，采用Primer 5软件设计扩增包括 pre-miR-26b在内的序列，并在其上游和下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，上游引 物（含BamHI位点，下划线区域）5′-GCCGGATCCAGGCTCTTCCCACCAATCCG-3′； 下游引物（含EcoRI位点，下划线区域） 5′-ACCGAATTCGGCCAGCTACCCTGACCACT-3′。目的基因长度为451bp。（PCR试剂 盒：TaKaRa LA TaqDNA Polymerase Hot-Start Version，Takara）

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：预变性94℃ 5min；

终末延伸72℃ 10min

（2.2）PCR产物切胶纯化回收（Gel/PCR Extraction Kit，Biomiga）

1）按照5μl PCR产物+1μl上样缓冲液（6×）比例混匀后，在1.0％琼脂糖凝胶上 电泳，在成像仪显色下，切取469bp的目的条带于离心管中。

2）加入1倍体积的Buffer GC，至于55℃水浴中8-10分钟，至凝胶完全融化。冷 却至室温。

3）转移以上混合液至一带有收集管的吸附柱中，室温下，13,000×g离心1分钟， 倒掉收集管中的废液。重复此步骤，直至剩余液体全部通过吸附柱。

4）加入650μl DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000×g离心30秒，倒掉 废液，重复此步骤。

5）室温下，13,000×g开盖离心2分钟，去除残余的乙醇。

6）转移吸附柱至一新的1.5ml的离心管中，加入30-50μl在60℃预热的ddH2O，室 温放置数分钟，13,000×g离心1分钟。

（2.3）PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro双酶切

PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro分别按照下述反应体系，37℃反应1小时，得 PCR产物目的片段及载体片段。

表1

酶切产物，加入2倍体积Buffer GC后，瞬时离心。其余步骤按照上述切胶纯化回 收步骤进行纯化。

（2.4）PCR产物及载体pGLV-H1-GFP/Puro连接反应

按照载体片段和PCR产物目的片段数目比例1:3左右加反应体系（见表2）， 体系中加入1μl T4 DNA连接酶及1μl T4 DNA Buffer，16℃过夜，得到连接产物 （pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro）。以不加入目的片段的载体为对照。

表2

（2.5）转化（无菌操作）

1）从-80℃冰箱取出TOP10感受态细胞，冰上融化，每200μl感受态细菌加入2-4μl 连接产物，轻轻扣击管壁混匀细菌。

2）冰上30min，42℃热休克90sec，然后迅速放置冰上3min。

3）加入500μl预热到37℃的LB培养基，37℃ 200转/分钟培养90分钟。然后将菌 液铺于含有Ampicillin抗生素（100mg/ml）的LB固体培养板。

4）37℃孵育，培养板先正置1h后倒置培养12-16小时后挑取克隆或于4℃保存。

（2.6）阳性克隆扩增和质粒抽提（质粒抽提试剂盒为德国QIAGEN公司Plasmid  Mini Kit）

1）取5ml无菌Ampicillin LB液体培养基（100mg/ml），加入到无菌的15ml试管 中，用无菌移液器枪头在培养板上随机挑选阳性克隆，置于上述试管中，37℃ 200rpm振 荡孵育过夜。

2）室温下，10,000rpm离心1分钟，收集菌体，并尽可能弃去上清

3）加入250μl Buffer A1，涡旋震荡混匀。

4）加入250μl Buffer B1，混匀后静置5分钟至溶液粘稠而澄清

5）加入350μl Buffer N1，立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉 淀。13,000rpm离心10分钟。

6）吸取上清至带有收集管的DNA吸附柱中，13,000rpm离心1分钟，弃去收集管 中的废液。

7）加入500μl Buffer KB，室温下13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。

8）加入500μl DNA Wash Buffer，13,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的废液。重 复此步骤后，开盖离心5分钟。

9）向吸附柱中加入50-100μl ddH₂O。

（2.7）pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro双酶切验证、测序及保种

按照前述酶切方法（表1）进行双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，切开双条带及条带 大小与目的条带分子量相符，进行测序验证。同时取无菌1.5ml离心管并作标记，加入 0.15ml无菌甘油溶液,分别吸取0.85ml阳性克隆的菌液，加入相应标记的离心管中， 充分混匀，贮存于-80℃保种。

构建载体及酶切、测序结果见图1。

1.2（二）慢病毒包装

在37℃、5%CO₂孵箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养病毒包装细胞 HEK-293T细胞（美国ATCC）。将HEK-293T细胞按10⁵/ml密度均匀接种于6孔板中，待细 胞融合度达80%左右时，共转染慢病毒表达质粒（pGLV-H1-miR-26b-GFP/Puro）与包装 质粒，转染试剂（美国Invtrogen公司Lipofectamine^TM2000）(μl)与表达和包装质粒总质 量(μg)比例为2.5:1，慢病毒表达质粒与包装质粒Pcgvp、Rev、Vsvg比例为1.5:1.5:1:0.5（质 量比）。转染12h换液，24h后使用荧光显微镜观察转染效率，于48h、72h收取细胞培养 液上清（即病毒上清），0.45μM滤器过滤后，分装-80℃冻存。

1.2（三）慢病毒感染人脂肪前体细胞

在37℃、5%CO₂孵箱中，以含5%胎牛血清的人脂肪细胞专用培养基（7211， Sciencell）培养人脂肪前体细胞，按10⁵/ml密度接种于6孔板中，待细胞融合度达60%左 右时，将收集的病毒上清与凝聚胺（polybrene，终浓度5μg/ml）一同加入人脂肪前体细 胞，24h后换液，48h-72h在荧光显微镜通过观察荧光表达情况判断感染效率，80%以上 细胞可见绿色荧光，表明感染效率达到80%以上（见图2），72h时使用RNA抽提试剂盒 （TRIzol法）提取细胞总RNA。

1.2（四）Real-time PCR鉴定人miR-26b在人脂肪前体细胞中过表达

分别收集miR-26b慢病毒组（miR-26b过表达组）及空载对照组的人脂肪前体细胞， 使用RNA抽提试剂盒（TRIzol法）抽提总RNA，Nanodrop2.0检测RNA浓度，定量150ng 总RNA用于逆转录，经特异性茎环引物（美国ABI公司，miR-26b检测试剂盒）逆转录 为cDNA，进一步使用相应引物探针（美国ABI公司，miR-26b检测试剂盒）检测人miR-26b 的表达。Realtime PCR反应体系为：TanMan gene expression master MixII 10μl，cDNA1μl， TanMan引物探针1μl，双蒸水8μl，共20μl，在ABI 7500运行，条件为：预变性95℃ 10min 后，95℃ 15s，60℃ 1min，重复40个循环。用△△CT法计算人miR-26b的相对表达量。 结果见图2。

1.2（五）成熟脂肪细胞葡萄糖摄取的测定

将感染miR-26b慢病毒及空载对照慢病毒的人脂肪前体细胞诱导分化为成熟脂肪细 胞后，换无血清的DMEM培养基饥饿4小时，以KRPH buffer（5mM Na₂HPO₄，20mM  HEPES，1mM MgSO₄，1mM CaCl₂，4.7mM KCl，PH 7.4）洗涤2次，以含1%BSA 的KRPH缓冲液（基础摄糖）或含100nM胰岛素的相同缓冲液（胰岛素刺激后的摄糖） 37℃，5%CO₂孵箱孵育30min。加入2-Deoxy-[³H]glucose（Amersham Biosciences，UK； 终浓度1μCi/ml），37℃孵育5min，再加入含10mmol/L葡萄糖的冰PBS终止摄糖反应。 冰PBS洗涤细胞3次，将细胞溶解于0.4ml 0.1%Triton-X100中，均匀吹打细胞，充分 裂解后细胞，1000g离心10min，收集细胞上清。对收集的细胞上清进行液闪计数（由 南京医科大学同位素教研室进行检测），结果见图3。

2.结果

无论是基础状态还是胰岛素刺激后，人miR-26b过表达的成熟脂肪细胞的葡萄糖摄 取都显著高于对照细胞，提示人miR-26b过表达能够显著增加成熟脂肪细胞的胰岛素敏 感性。